蟲草素對D-半乳糖與三氯化鋁聯(lián)合誘導(dǎo)阿爾茨海默病小鼠認(rèn)知功能的改善作用及機制探討

彭達，趙爽，宋潤蔚，公元，韓冷，宗閏喆，王浩，田華，2，張繼國

1 山東第一醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，山東泰安 271016；2 山東中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，山東濟南 250355

阿爾茨海默?。ˋD）是一種以行為異常、漸進性認(rèn)知功能障礙為主要臨床表現(xiàn)的中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾?。?］。隨著社會人口老齡化加劇，AD發(fā)病率逐漸升高，嚴(yán)重威脅人類健康。但目前，臨床還未有有效的AD治療藥物，主要應(yīng)用的化學(xué)合成藥物或多肽類化合物不僅價格昂貴，而且長期應(yīng)用還具有明顯的不良反應(yīng)。因此，人們越來越多地將注意力轉(zhuǎn)向天然化合物［2］。蟲草素，又稱3'-脫氧腺苷，是蛹蟲草核苷酸的衍生物，也是天然中藥材冬蟲夏草的活性成分之一，具有抗菌、抗炎、抗病毒、抗腫瘤和免疫調(diào)節(jié)等多種藥理活性［3］。近年研究發(fā)現(xiàn)，蟲草素可減輕東莨菪堿所致小鼠記憶障礙，可改善海馬CA1、CA3區(qū)腦缺血損傷，并可通過增強膽堿能神經(jīng)系統(tǒng)功能、減少海馬神經(jīng)元損傷、抑制小膠質(zhì)細(xì)胞炎癥因子的產(chǎn)生，進而對神經(jīng)退行性疾病產(chǎn)生一定的保護作用［4］。目前雖然已有研究發(fā)現(xiàn)蟲草素對AD具有一定改善作用［5］，但對其確切的作用和機制仍未完全明了。本研究擬以D-半乳糖（D-gal）聯(lián)合三氯化鋁（AlCl3）誘導(dǎo)小鼠AD模型，通過Morris水迷宮檢測小鼠認(rèn)知功能，觀察蟲草素對AD的改善作用，并從抗炎、抗氧化角度對其作用機制進行初步探討。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 3月齡雄性C57BL/6J小鼠54只，體質(zhì)量20~25 g，均為SPF級，由濟南朋悅實驗動物繁育有限公司提供［SCXK（魯）20190003］。于SPF級實驗室進行飼養(yǎng)，室溫（22±1）℃，濕度45%~60%，光照周期為12 h/12 h（光照時間早8點至晚8點），自由飲食、水。實驗方案經(jīng)山東第一醫(yī)科大學(xué)動物實驗倫理委員會批準(zhǔn)［SYXK（魯）20190022］。

1.1.2 實驗試劑和儀器 蟲草素（CAS#73-03-0）購自上海源葉生物科技有限公司，鹽酸多奈哌齊購自江蘇豪森藥業(yè)集團有限公司，D-gal購自北京索萊寶科技有限公司，AlCl3購自天津市大茂化學(xué)試劑廠，以上試劑均用生理鹽水溶解配置成所需濃度；β-淀粉樣蛋白（Aβ）1-40（Aβ1-40）、Aβ1-42與IL-6試劑盒均購自上海酶聯(lián)生物科技有限公司；丙二醛（MDA）、過氧化氫酶（CAT）、過氧化物酶（POD）、超氧化物歧化酶（SOD）試劑盒購自南京建成生物工程研究所。儀器：Morris水 迷 宮（Top Scan，美 國）；Infinite F200型Tecan Infinite酶標(biāo)儀（TECAN，瑞士）；UV1810S型紫外可見光分光光度計（上海佑科儀器儀表有限公司）。

1.2 實驗分組及給藥 將C57BL/6J小鼠隨機分為6組，分別為空白組、模型組、蟲草素高劑量組、蟲草素中劑量組、蟲草素低劑量組、多奈哌齊組，每組9只。除空白組給予等劑量溶劑外，其余各組腹腔注射D-gal 120 mg/kg同時灌胃給予AlCl3200 mg/kg誘導(dǎo)AD模型，給藥共9周。上述給藥4周后，蟲草素高、中、低劑量組分別灌胃40、20、10 mg/kg蟲草素；多奈哌齊組灌胃0.9 mg/kg鹽酸多奈哌齊；空白組和模型組灌胃等劑量溶劑，灌胃給藥5周。D-gal聯(lián)合AlCl3給藥的第9周，開始Morris水迷宮實驗（MWM），檢測小鼠的學(xué)習(xí)記憶功能。行為學(xué)結(jié)束，取小鼠腦組織，分離皮質(zhì)和海馬，檢測相應(yīng)指標(biāo)。

1.3 小鼠學(xué)習(xí)記憶能力檢測 采用MWM實驗［6］，包括定位航行實驗和空間探索實驗。定位航行實驗連續(xù)5 d，記錄小鼠的逃生潛伏期。60 s內(nèi)小鼠尋找到平臺，記錄其實際找到平臺的潛伏期；大于60 s未找到平臺者，潛伏期以60 s計。第6天進行空間探索實驗，撤去逃生平臺，在平臺所在象限的對側(cè)象限放入小鼠，記錄小鼠在1 min內(nèi)穿越原平臺所在區(qū)域的次數(shù)。用TOPSCAN軟件記錄并分析其行為學(xué)軌跡。

1.4 大腦皮質(zhì)和海馬Aβ1-40、Aβ1-42和IL-6水平檢測 采用ELISA法。行為學(xué)結(jié)束后，處死各組小鼠，分離大腦皮質(zhì)和海馬，加入生理鹽水分別制備皮質(zhì)和海馬組織勻漿，4 ℃、2 500 r/min離心10 min，取上清，使用ELISA檢測試劑盒，按說明書步驟操作分別對大腦皮質(zhì)和海馬內(nèi)Aβ1-40、Aβ1-42和IL-6水平進行測定，于酶標(biāo)儀450 nm處測定光密度值。

1.5 大腦皮質(zhì)氧化指標(biāo)檢測 取各組小鼠大腦皮質(zhì)，按照說明書操作制備腦組織勻漿，離心、取上清，采用TBA法測定MDA水平，同時采用羥胺法、比色法和紫外法分別測定SOD、POD和CAT活力，具體步驟按照試劑盒說明書操作。

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法 采用GraphPad Prism8.0統(tǒng)計軟件。計量資料以±s表示，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用Dunnett檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 蟲草素對D-gal聯(lián)合AlCl3誘導(dǎo)AD小鼠學(xué)習(xí)記憶能力的影響 在定位航行實驗中，隨著實驗天數(shù)的增加，各組小鼠的逃生潛伏期縮短；從第2天起，與空白組相比，模型組逃生潛伏期延長（P均＜0.05）；而與模型組相比，蟲草素各劑量組和多奈哌齊組逃生潛伏期大都從第3天開始下降（P均＜0.05）；結(jié)果見表1。在空間探索實驗中，空白組、模型組、蟲草素高劑量組、蟲草素中劑量組、蟲草素低劑量組、多奈哌齊組平臺穿越次數(shù)分別為（2.26±0.25）、（0.94±0.20）、（0.89±0.38）、（1.88±0.45）、（2.00±0.33）、（1.62±0.18）次/分；與空白組相比，模型組平臺穿越次數(shù)減少（P＜0.05）；與模型組相比，蟲草素中、高劑量組和多奈哌齊組平臺穿越次數(shù)增加（P均＜0.05）。

表1 各組小鼠定位航行實驗逃生潛伏期比較（s，±s）

表1 各組小鼠定位航行實驗逃生潛伏期比較（s，±s）

注：與空白組相比，#P＜0.05，##P＜0.01；與模型組相比，*P＜0.05。

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2.2 蟲草素對D-gal聯(lián)合AlCl3誘導(dǎo)AD小鼠腦組織中Aβ1-40和Aβ1-42水平的影響 與空白組相比，模型組大腦皮質(zhì)與海馬組織中Aβ1-40水平升高；與模型組相比，蟲草素低、高劑量組與多奈哌齊組海馬組織中Aβ1-40水平降低（P均＜0.05），蟲草素中、高劑量組與多奈哌齊組大腦皮質(zhì)中Aβ1-40水平降低（P均＜0.05）。與空白組相比，模型組大腦皮質(zhì)與海馬組織中Aβ1-42水平升高（P均＜0.05）；與模型組相比，蟲草素中、高劑量組與多奈哌齊組大腦皮質(zhì)及海馬組織中Aβ1-42水平降低（P均＜0.05）。見表2。

表2 各組小鼠腦組織中Aβ1-40和Aβ1-42水平比較（pg/mg protein，±s）

表2 各組小鼠腦組織中Aβ1-40和Aβ1-42水平比較（pg/mg protein，±s）

注：與空白組相比，#P＜0.01；與模型組相比，*P＜0.05，**P＜0.01。

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2.3 蟲草素對D-gal聯(lián)合AlCl3誘導(dǎo)AD小鼠腦組織中IL-6水平的影響 與空白組相比，模型組大腦皮質(zhì)和海馬組織中IL-6水平升高（P均＜0.05）；與模型組相比，蟲草素中、高劑量組與多奈哌齊組大腦皮質(zhì)和海馬組織中IL-6水平降低（P均＜0.05）。見表3。

表3 各組小鼠腦組織中IL-6水平比較（pg/mg protein，-x±s）

2.4 蟲草素對D-gal聯(lián)合AlCl3誘導(dǎo)AD小鼠腦組織氧化應(yīng)激的影響 與空白組相比，模型組MDA水平升高，SOD、POD和CAT水平降低（P均＜0.05）；與模型組相比，蟲草素高劑量組MDA水平降低，CAT活力升高（P均＜0.05）；與模型組相比，蟲草素中、低劑量組SOD、POD和CAT活力均升高（P均＜0.05）；與模型組相比，多奈哌齊組MDA水平降低，SOD、POD和CAT活力均升高（P均＜0.05）。見表4。

表4 各組小鼠腦組織氧化應(yīng)激指標(biāo)比較（-x±s）

3 討論

蟲草素具有顯著的抗氧化和抗炎作用，可以改善腎缺血再灌注損傷、對抗脂多糖誘導(dǎo)的肺損傷等［7］。近年有研究報道，蟲草素通過抗氧化、抗炎也具有神經(jīng)保護作用［8］。蟲草素（24 mg/kg）能明顯改善糖尿病小鼠的認(rèn)知功能，并減輕腦組織的氧化應(yīng)激損傷［9］。D-gal具有神經(jīng)毒性，在腦組織中大量聚積，能使細(xì)胞滲透壓升高，細(xì)胞內(nèi)活性氧增多，腦功能退化，誘導(dǎo)亞急性衰老模型［10］。鋁是天然存在的有毒微量元素，慢性長期給予AlCl3可致機體腦內(nèi)乙酰膽堿酯酶活性增加，誘導(dǎo)氧化損傷，導(dǎo)致認(rèn)知功能障礙［11］。AlCl3和D-gal聯(lián)用能明顯增強兩者的神經(jīng)毒性，為國內(nèi)外廣泛認(rèn)可的、良好的AD模型誘導(dǎo)方法［12］。本研究以此方法誘導(dǎo)小鼠AD模型，探討蟲草素在AD中的確切作用和機制。本研究發(fā)現(xiàn)，9周后，模型組小鼠的認(rèn)知功能下降，AD造模成功。給予與文獻相似劑量的蟲草素［9］干預(yù)的小鼠認(rèn)知功能明顯改善，從而確認(rèn)了蟲草素對AlCl3聯(lián)合D-gal誘導(dǎo)AD的保護作用。Aβ沉積形成的老年斑是AD的特征性病理學(xué)改變之一?！唉碌矸蹣蛹僬f”認(rèn)為，Aβ沉積是AD發(fā)病的主要因素［13］。D-gal和AlCl3聯(lián)用可使小鼠體內(nèi)β-分泌酶（BACE）和γ-分泌酶水平升高，兩種酶可作用于APP產(chǎn)生Aβ，而Aβ可以與乙醇脫氫酶反應(yīng)產(chǎn)生活性氧，使線粒體功能異常，活性氧可通過激活各種信號通路，進一步使APP代謝異常，導(dǎo)致Aβ異常產(chǎn)生和積累［14］。雖然已有實驗證實，蟲草素可減輕Aβ或Aβ聯(lián)合D-gal誘導(dǎo)的神經(jīng)損傷［5，15］，但對蟲草素是否調(diào)控Aβ的水平還未見報道。本實驗中，模型組Aβ1-40與Aβ1-42水平較空白組高，表明二者聯(lián)用誘導(dǎo)了Aβ在小鼠腦組織中的異常累積。應(yīng)用蟲草素后，部分Aβ1-40與Aβ1-42水平下降，說明蟲草素可能不僅能減輕Aβ誘導(dǎo)的神經(jīng)毒性，也可調(diào)控其表達，但具體的機制還有待進一步研究。

神經(jīng)炎性反應(yīng)被認(rèn)為是AD發(fā)病的重要因素之一，炎癥因子還可誘導(dǎo)氧化應(yīng)激，促進神經(jīng)元損傷，從而加速AD病情進展［16］。D-gal和AlCl3聯(lián)用可通過異常累積的Aβ激活神經(jīng)小膠質(zhì)細(xì)胞，釋放大量炎癥因子，包括IL-1、TNF-α、IL-6、補體等，促進AD腦內(nèi)的炎癥反應(yīng)。其中IL-6參與了AD患者腦內(nèi)老年斑的形成，在AD發(fā)病過程中發(fā)揮重要作用［17］。本研究發(fā)現(xiàn)，模型組小鼠大腦皮層和海馬中的IL-6炎癥因子水平升高，蟲草素中、高劑量組IL-6水平降低，說明蟲草素的抗AD作用可能與其抗炎、降低IL-6水平有關(guān)。

眾所周知，氧化應(yīng)激能增強Aβ介導(dǎo)的神經(jīng)毒性，促進AD發(fā)生［18-19］。本研究結(jié)果顯示，D-gal和AlCl3聯(lián)合處理可誘導(dǎo)小鼠氧化應(yīng)激，明顯升高氧化損傷產(chǎn)物——MDA水平，而抗氧化標(biāo)志物——SOD、CAT和POD活力下降，這與文獻［20］結(jié)果一致。給予蟲草素處理后，氧化應(yīng)激生物標(biāo)志物的不平衡則被逆轉(zhuǎn)，小鼠大腦皮質(zhì)中的MAD水平降低，SOD、CAT、POD水平均有不同程度升高。表明蟲草素可降低D-gal聯(lián)合AlCl3誘導(dǎo)AD小鼠的氧化應(yīng)激損傷，從而發(fā)揮神經(jīng)保護、改善AD的作用。

多奈哌齊是第二代膽堿酯酶抑制劑，是目前臨床應(yīng)用的AD治療藥物，因此本實驗選用該藥物作為陽性對照。結(jié)果顯示，蟲草素與多奈哌齊具有相似的改善AD小鼠認(rèn)知的作用。多奈哌齊通過提高患者腦組織中乙酰膽堿的水平、減輕Aβ的神經(jīng)毒性、抗氧化和抗炎等多種機制發(fā)揮對神經(jīng)元的保護作用［21］。本研究結(jié)果顯示，蟲草素在降低Aβ水平、抗氧化、抗炎方面與多奈哌齊相似。這進一步證實了蟲草素良好的改善AD的作用。但本實驗中一些指標(biāo)未呈現(xiàn)明顯的劑量依賴關(guān)系，這可能與本實驗所應(yīng)用的蟲草素劑量跨度偏小、不同劑量發(fā)揮的作用可能存在差異有關(guān)，具體的機制還有待進一步研究。

綜上，蟲草素能改善D-gal聯(lián)合AlCl3誘導(dǎo)AD小鼠的認(rèn)知功能，其機制可能與抗炎、抗氧化、降低Aβ水平有關(guān)。可見，蟲草素具有潛在的抗AD作用，具有良好的藥用開發(fā)前景。

利益聲明所有作者聲明不存在利益沖突

作者貢獻聲明彭達，趙爽：實驗設(shè)計及實施，論文撰寫；宋潤蔚，公元，韓冷，宗閏喆：參與實驗實施；張繼國，田華：指導(dǎo)實驗設(shè)計；王浩：指導(dǎo)論文的撰寫