近紅外光譜技術在微生物檢測中的應用進展

田燕龍，王 毅，王 簫，高學軍，周加才，陸道禮，陳 斌

1.江蘇大學食品與生物工程學院，江蘇 鎮(zhèn)江 212013 2.北京京儀集團有限責任公司，北京 100022 3.北京北分瑞利分析儀器(集團)有限責任公司，北京市物質成分分析儀器工程技術研究中心、北京市企業(yè)技術中心，北京 100095

引 言

微生物是指一切肉眼看不見或看不清的微小生物，形體微小，結構簡單，通常要用光學顯微鏡和電子顯微鏡才能看清楚[1]。微生物種類繁多、數目龐大，主要包括放線菌、細菌、病毒、真菌、立克次體、支原體等。微生物無處不在，與人類生產生活有著十分密切的關系。人們每天吃的饅頭、面包、泡菜等食品和喝的酸奶，以及各種酒類-調味品中的醋、醬油，都是經過微生物發(fā)酵制作出來的。但是微生物在人們日常生活中也有負作用。比如肉、蛋，水果等食物，如果保存不當，就會腐爛、變質；人類感染細菌和病毒等病原微生物后就會生病乃至死亡；藥品生產過程中如果被有害微生物污染，其有效成分會遭到破壞，從而失去有效性。凡此種種、不勝枚舉，為了防范和控制微生物的危害，微生物的快速、準確檢測變得尤為重要。

目前常用的微生物檢測技術，主要包括傳統(tǒng)生化方法、色譜技術、顯色培養(yǎng)基技術、鏈式反應檢測技術、核酸探針檢測技術、電阻抗檢測技術和免疫分析檢測技術等[2-3]。這些技術雖然檢測準確度很高，但都存在一定的局限性，或者前處理步驟復雜、時間長、檢測結果假陽性率偏高，或者儀器設備昂貴、對檢測環(huán)境要求高，均不適合快速檢測。因此探尋一種準確、簡便、快捷的分析技術具重要意義。近紅外光譜(NIRs)技術是指利用物質對近紅外光的選擇性吸收及其吸收強度來預測其成分和含量，主要用于有機物質定性和定量分析，具有操作簡單、分析速度快、對檢測人員專業(yè)要求低、分析過程無污染等優(yōu)點，已廣泛應用于農業(yè)、醫(yī)藥、食品等多個領域，在微生物檢測領域也展現(xiàn)出巨大的應用潛力[4-5]。

1 近紅外光譜技術鑒定微生物的基本原理

近紅外光是指位于780～2 500 nm(12 820～4 000 cm-1)范圍的電磁波，NIRs主要測量分子振動的倍頻及合頻吸收，包含了絕大多數類型有機物組成和分子結構的豐富信息。所有的生物系統(tǒng)都是由水、核酸、蛋白質、糖類和脂類組成的，其中的核酸(RNA和DNA)、蛋白質(多肽)、糖類和脂類是由分子量小于500的單體通過聚合作用形成的大分子，統(tǒng)稱為生物大分子[6]。NIRs技術通過讀取微生物菌體細胞壁、細胞膜及細胞內生物大分子和水的化學鍵振動情況，提供整個微生物菌體生化組成成分的光譜定性定量信息，因此可以區(qū)分生化信息上的差別[7-8]。此外，由于倍頻與合頻吸收強度弱、吸收帶較寬且重疊嚴重，導致NIRs解析困難，必須結合化學計量學技術，才能實現(xiàn)對微生物的檢測[9]。

2 近紅外光譜技術在微生物研究中的應用

2.1 國外近紅外光譜技術檢測微生物的研究發(fā)展狀況

2.1.1 微生物分類

馬里蘭大學帕克分校的Rodriguez-Saona等利用氧化鋁多孔膜富集細菌，在光譜信息豐富的1 667～2 500 nm(6 000～4 000 cm-1)區(qū)域進行主成分分析(PCA)，最早用NIRs實現(xiàn)了大腸桿菌HB101、大腸桿菌ATCC 43888、大腸桿菌1224、淀粉酶樣芽孢桿菌、銅綠假單胞菌、蠟樣芽孢桿菌、伊諾卡氏李斯特菌等細菌的鑒定[7-8,10]。在此基礎上，他們又實現(xiàn)了NIRs對1×105CFU·mL-1濃度大腸桿菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌、蠟樣芽孢桿菌、蘇云金桿菌等菌株的快速檢測和鑒定[11]。

Alexandrakis等選擇700～900 nm(14 286～11 111 cm-1)的波長范圍進行建模，對英諾庫亞氏李斯特菌FH、乳酸乳球菌、熒光假單胞菌、門多西納假單胞菌、惡臭假單胞菌進行鑒別，發(fā)現(xiàn)偏最小二乘(PLS)方法能夠實現(xiàn)菌屬水平上5種細菌共127個樣本100%的正確判別[12]。Feng等采用競爭性自適應重加權采樣(CARS)技術，僅選擇3個波長就實現(xiàn)了對濃度為1×109CFU·mL-1的大腸桿菌和因諾氏李斯特菌在菌種和菌株水平上的分類[13]。Sivakesava等分別使用傅里葉變換紅外光譜(FT-IRs)和傅里葉變換近紅外光譜(FT-NIRs)對5種不同微生物進行了鑒別，發(fā)現(xiàn)FT-NIRs的樣品制備過程更加簡單，但是在典型變量分析時需要更多的主成分數，而且只能在菌屬水平上對5種微生物進行分類，不能在菌種水平上對5種微生物進行分類[14]。Krepelka等提出了一種FT-NIRs曲線擬合方法，該算法將光譜分解為特定的吸收峰，簡化了光譜，提高了對細菌種類的預測能力[15]。Lima等利用FT-NIRs方法結合多元分析快速鑒別了產碳青霉烯酶肺炎克雷伯菌和不產碳青霉烯酶肺炎克雷伯菌[16]。

2.1.2 食源性微生物檢測

食源性致病菌是引起食源性疾病的首要原因，全球每年發(fā)生高達1.5億的腹瀉病例中，有70%是由各種致病性微生物污染食品所引起，因而快速、簡便、特異的致病微生物檢測方法成為研究熱點[17]。

使用NIRs法可以實現(xiàn)對肉類腐敗程度的檢測[18-22]。Alexandrakis等利用NIRs和化學計量學檢測和鑒定了接種在雞胸肉上的選定細菌，發(fā)現(xiàn)NIRs可以檢測和區(qū)分接種和未接種細菌的雞胸肉，而且可以區(qū)分新鮮和不新鮮，但是卻未能區(qū)分用于本研究接種的五種不同菌株[21]。Powell等在1 000～1 333 nm(10 000～7 500 cm-1)的光譜范圍內，利用FT-NIRs方法實現(xiàn)了新鮮三文魚魚片與4 ℃保存9 d的魚片的分離鑒別，并利用PLS回歸預測模型，預測了9 d后的細菌數量，證明了NIRs檢測和預測魚類微生物腐敗的可行性[22]。

NIRs還能夠檢測水果蔬菜中的微生物污染物[23-25]。有研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)T-NIRs方法在1 111～2 000 nm(9 000～5 000 cm-1)范圍內可用于菠蘿果肉中1×108CFU·mL-1濃度水平大腸桿菌和腸炎鏈球菌的鑒別，認為該技術在食品中污染物的檢測方面具有很大的潛力[23]。在700～1 100 nm(14 286～9 091 cm-1)短波區(qū)域內，NIRs也被證明是一種快速、無損檢測卷心菜細菌污染的方法[24-25]。

此外，Cámara-Martos等使用FT-NIRs方法實現(xiàn)了對水基食品基質中的乳酸菌以及牛奶中的大腸桿菌和銅綠假單胞菌的鑒定和定量[26-27]。Daskalov等發(fā)現(xiàn)NIRs可以成功區(qū)分保加利亞黃色奶酪是否被低濃度(1×101×103CFU·g-1)的單核增生李斯特菌污染[28]。Al-Qadiri利用短波NIRs技術，將光譜特征的變化與細菌增殖和牛奶腐敗程度相關聯(lián)，實現(xiàn)了快速、無創(chuàng)地檢測和監(jiān)測牛奶腐敗[29]。

2.1.3 糧食中產毒真菌檢測

據聯(lián)合國糧農組織調查估算，全球每年受真菌毒素的污染的糧食約有25%。因污染嚴重而失去商業(yè)價值的農作物約有2%，利用NIRs可以實現(xiàn)對產毒真菌的快速檢測[30-34]。Berardo等采用NIRs法快速檢測了玉米籽粒的腐敗和霉菌毒素，發(fā)現(xiàn)NIRs可以準確預測真菌侵染果仁的發(fā)生率，特別是黃萎病菌侵染果仁的發(fā)生率，以及膳食中麥角甾醇和富馬菌素B1的含量[31]。Gaspardo等研究發(fā)現(xiàn)FT-NIRs方法是檢測玉米粉中富馬菌素B1和B2的一種較好的方法，可用于安全食品和污染食品的鑒別[32]。Tao等使用CARS-PLS模型對黃曲霉毒素污染玉米粒和健康玉米粒進行了分類，當閾值為20和100 ppm時分類的總體準確率分別達到86.67%和84.44%[33]。Fernández-Ibaez等分別使用FT-NIRs儀器和色散型NIRs儀器測試了玉米和大麥籽粒中的黃曲霉毒素B1，發(fā)現(xiàn)在FT-NIRs儀器上建立的校正模型可以獲得更好的光譜信息，無需數學預處理就能得到較好的統(tǒng)計結果[34]。

2.1.4 近紅外光譜成像微生物檢測

運用常規(guī)的NIRs技術得到的是樣品某一點(或區(qū)域)的平均光譜，因而是樣品組成或性質的平均結果。利用NIRs成像技術則可以實現(xiàn)樣品空間各點的信息，從而進一步得到空間各點的組成和結構信息[35]。Dubois等利用近紅外化學成像技術分別在1 000～2 350 nm(10 000～4 255 cm-1)和1 200～2 400 nm(8 333～4 167 cm-1)的光譜范圍內對沉積在特制拋光鋁卡片上的細菌細胞進行了高通量分析[36-37]。結果表明，通過分析特定波長的強度差異可以來識別細菌，并且可以使用離散波長來區(qū)分和識別卡片中包含的各種生物體。Sun等利用高光譜成像技術先后快速測定了雞胸肉中假單胞菌和腸桿菌含量以及三文魚肉中乳酸菌的腐敗，證明近紅外高光譜成像技術是一種不需要復雜的實驗室條件就能確定食品衛(wèi)生和檢測食品基質上致病菌的潛在工具[38-40]。Kimmies等利用近紅外高光譜成像和多元數據分析對食源性細菌進行鑒別，成功分離了革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌，并實現(xiàn)了顏色相似細菌的區(qū)分和致病菌與非致病菌的區(qū)分[41]。

2.1.5 其他微生物檢測

除了上述應用外，NIRs技術在微生物檢測領域還有一些其他的應用。Quintelas等在1 667～1 852 nm(6 000～5 400 cm-1)的光譜區(qū)域內使用FT-NIRs技術對藥品中的細菌污染進行了檢測和定量，結果表明在3種藥物制劑(隱形眼鏡液、止咳糖漿和主題消炎液)中，F(xiàn)T-NIRs能夠對所有細菌的無菌溶液和污染溶液進行鑒別，對枯草桿菌、大腸桿菌、熒光假單胞菌、腸沙門氏菌、表皮葡萄球菌的檢測限分別為9.0，5.1，5.7，7.8和5.7 CFU·mL-1[42]。銅綠假單胞菌是醫(yī)院感染的主要原因，并且在治療的3～4 d后就會產生耐藥性，Marques等利用線性判別分析(LDA)和遺傳算法(GA)對銅綠假單胞菌進行FT-NIRs分析，根據耐藥和敏感性實現(xiàn)了對臨床標本中銅綠假單胞菌的分離[43]。Sikulu-Lord等利用NIRs檢測和鑒定了實驗室飼養(yǎng)的雄性和雌性埃及伊蚊中兩種沃爾巴克氏體菌株(wMelPop和wMel)，發(fā)現(xiàn)NIRs可以將感染wMelPop和wMel的埃及伊蚊與未感染的野生樣本區(qū)分開，鑒別準確率最低也達到了84.5%[44]。此外，Pesala等利用紅外光譜和NIRs對結核分枝桿菌進行無創(chuàng)檢測；Saranwong等設計了一種生牛奶化學成分和總需氧菌計數的無損近紅外光譜分析系統(tǒng)[45]。

2.2 國內近紅外微生物檢測研究發(fā)展狀況

和國外相比，國內關于NIRs微生物檢測的研究起步較晚，2008年劉建學等使用NIRs快速預測了原料乳中大腸菌群[46]。目前國內關于NIRs微生物檢測的文獻主要集中在不同細菌分類、食源性致病菌檢測以及糧食中產毒真菌檢測等三方面。

2.2.1 微生物分類

河南科技大學的劉建學等在基于NIRs技術的細菌分型和鑒別方面做了大量工作。該課題組利用基于PCA的投影判別技術，檢測和識別了大腸桿菌、單增李斯特菌和沙門氏菌，54個樣本的判別正確率達到100%[47]；以NIRs結合支持向量機(SVM)實現(xiàn)了對大腸桿菌O157∶H7、單增李斯特菌、金黃色葡萄球菌(90個樣本)的100%分類鑒別[48]；采用改進的貝葉斯判別模型(BDA)實現(xiàn)了對大腸埃希氏菌0157∶H7、單增李斯特菌和金黃色葡萄球菌3種細菌(80個樣本)100%的正確分類[49]。最近，馬凱旋等研究了大腸埃希氏菌O157∶H7、金黃色葡萄球菌、單增李斯特菌3種致病菌的不同濃度和不同培養(yǎng)階段的光譜數據，發(fā)現(xiàn)在10 CFU·mL-1的低濃度下仍然能夠實現(xiàn)對細菌的識別；此外在對致病菌檢測時，應對樣品的前處理進行統(tǒng)一，以提高鑒別的準確度[50]。

西北農林科技大學的相關研究通過采集1株酵母和5株細菌標準菌株的近紅外漫反射光譜，在1 852～2 500 nm(5 400～4 000 cm-1)的光譜范圍內采用PCA對光譜數據進行了分析，構建了基于FT-NIRs的微生物快速鑒定模型，這是國內較早進行的基于NIRs技術的細菌分型和鑒別工作。隨后，該課題組又基于FT-NIRs技術實現(xiàn)了脂環(huán)酸芽孢桿菌種間的分類鑒定。

第三軍醫(yī)大學馬寧等進行了NIRs鑒別耐甲氧西林金葡菌和甲氧西林敏感金葡菌的研究，發(fā)現(xiàn)在900～2 200 nm(11 111～4 545 cm-1)光譜范圍內使用NIRs結合SVM的分析方法具有精確區(qū)分耐甲氧西林金葡菌和甲氧西林敏感金葡菌的能力[51]。Mu等研究了FT-NIRs技術在不同菌種中對單個菌株進行分類的潛力，結果表明，SVM和徑向基函數神經網絡(RBF)等非線性分類方法的分類正確率均在96%以上，優(yōu)于PLS判別分析[52]。福州大學的相關研究使用FT-NIRs技術對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和沙門氏菌進行鑒別，結果表明反向傳播神經網絡(BP-ANN)算法具有最佳預測效果，預測集60個樣品的預測精度達到100%。

最近，江蘇大學Shi等研究了利用NIRs特征結合化學計量學快速鑒定乳酸菌種類的可行性，發(fā)現(xiàn)當選取10個特征波數(4 119，4 428，4 316，4 914，5 905，6 193，6 526，6 969，8 373和8 659 cm-1)時，利用最小二乘支持向量機(LS-SVM)可以建立最優(yōu)識別模型，對實驗中所用的4個菌種11個菌株的識別率在80%～95%之間[53]。

2.2.2 食源性微生物檢測

中國海洋大學相關研究針對魚類在低溫貯藏過程中的微生物變化，利用便攜式NIRs儀器結合GA和BP-ANN系統(tǒng)方法建立了三文魚和比目魚菌落總數的預測和檢測模型[58-59]。三文魚模型與傳統(tǒng)平板計數方法的相關系數為0.981，均方根誤差為0.097，驗證模型的相關系數為0.960，均方根誤差為0.098；比目魚模型與傳統(tǒng)平板計數方法的相關系數為0.985，均方根誤差為0.095，驗證模型的相關系數為0.966，均方根誤差為0.083，兩種模型都具有良好精密度和準確度。

有研究利用FT-NIRs技術快速、準確、無損地識別了雞肉中分離的4種致腐假單胞菌單菌種及其混合菌種菌液，從而實現(xiàn)了雞肉中假單胞菌的NIRs快速識別[56]。浙江工商大學曹海燕等利用FT-NIRs結合PLS、馬氏距離等分析方法實現(xiàn)了對紫薯半干面新鮮程度的鑒別以及紫薯半干面中菌落總數含量的定量檢測，其中檢測紫薯半干面菌落總數含量范圍為40～1×108CFU·g-1，已經可以滿足行業(yè)標準NY/T 1512—2007《綠色食品 生面食、米粉制品》中菌落總數(≤3×105CFU·g-1)的檢測要求[57]。

2.2.3 糧食中產毒真菌檢測

東北農業(yè)大學的張強等基于SVM進行了稻谷黃曲霉毒素B1的NIRs無損檢測研究，所建模型的校正集決定系數達到0.913，表明NIRs可準確檢測稻谷中的黃曲霉毒素B1[58]。基于多元線性回歸(MLR)和逐步回歸算法(SRA)，他們又構建了基于NIRs的稻谷霉菌和毒素檢測數學模型，實現(xiàn)了稻谷表面霉菌菌落總數的快速預測[59]。中國農業(yè)大學的袁瑩等利用FT-NIRs對霉變玉米進行了檢測，SVM分類模型對訓練集和測試集的預測準確率分別達到93.3%和91.7%[60]。相關研究利用PCA，LDA和PLSR方法建立了稻谷霉菌污染的快速分析模型，該模型不僅可以用于感染不同霉菌稻谷樣品的快速鑒別，還可有效區(qū)分不同霉變程度的稻谷。

利用NIRs技術還可以檢測花生的真菌病害。有研究開發(fā)了一種基于NIRs技術的花生產毒霉菌污染程度的定性定量分析方法，對儲藏0，3，6和9 d花生的感染單一霉菌和多種霉菌的總體判別正確率分別達到100%和99.17%。江蘇大學的黃星奕等建立了一種基于FT-NIRs技術和K最近鄰(KNN)模式識別方法的霉變和出芽花生識別方法，訓練集與預測集識別率均為98.84%[61]。

3 結論和展望

NIRs技術作為一種新型的分析技術，目前已經可以實現(xiàn)10 CFU·mL-1的極低濃度水平下食源性致病菌的檢測[28,50,57]，滿足部分食品安全國家或行業(yè)標準中100 CFU·mL-1(CFU·g-1)微生物限量的檢測需求，在食品安全領域具有廣闊的應用前景。NIRs技術結合化學計量學軟件可以實現(xiàn)食品生產和加工中微生物的在線檢測，縮短檢測時間，提高生產效率。NIRs用于微生物鑒別和分類時，在將來的臨床檢測中，可以節(jié)約大量的人力、物力和財力，并為尋找合適的抗菌藥物提供了依據，縮短對病人的確診時間，減緩病人的痛苦。

然而，開展NIRs技術在微生物檢測領域的應用研究，還任重而道遠。(1)必須制定規(guī)范化和標準化的樣品制備和操作流程，這樣才能實現(xiàn)不同微生物實驗室的數據互通和實驗重現(xiàn)性，進而實現(xiàn)NIRs技術在微生物檢測領域的大規(guī)模應用；(2)目前還沒有一個成熟的關于微生物檢測的NIRs模型數據庫，而NIRs定性和定量分析幾乎完全依賴于數據庫；(3)由于傳統(tǒng)紅外儀器設計理念的問題，處于近紅外和中紅外結合區(qū)域的2 000～3 000 nm(5 000～3 333 cm-1)范圍的電磁波，F(xiàn)T-NIRs儀器和FT-IRs儀器在這一區(qū)域受到光源種類、分光器件基礎材料、探測器類型等諸多因素的影響，儀器的信噪比都非常低，而2 000 nm以上波長區(qū)域恰恰是生物大分子光譜信息最豐富的區(qū)域，因此如果有專門針對這一波段優(yōu)化設計的光譜儀器，相信會有助于微生物的定性和定量分析。