氣相色譜-質(zhì)譜法測定發(fā)酵乳中氨基甲酸乙酯含量

陳同強，梁 鋒，吳海智，向 俊,3，宋 陽，荊輝華，袁列江，李 燦，李凱龍

（1.湖南省產(chǎn)商品質(zhì)量檢驗研究院，湖南 長沙 410007；2.中南林業(yè)科技大學食品科學與工程學院，湖南 長沙 410004；3.中南大學化學化工學院，湖南 長沙 410083；4.湖南省農(nóng)業(yè)科學院植物保護研究所，湖南 長沙 410125）

氨基甲酸乙酯是食品在發(fā)酵過程中較易產(chǎn)生的一類潛在性致癌化合物，可能會引起肺癌、肝癌等多種癌癥[1-3]。食品中氨基甲酸乙酯的存在對人體健康存在一定的風險[4-6]，因此，準確測定食品中氨基甲酸乙酯含量對保障食品質(zhì)量安全具有重要意義。

目前，食品中氨基甲酸乙酯的檢測方法包括色譜法，如薄層色譜法[7]、高效液相色譜法[8-10]、氣相色譜法[11]等，以及色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法，如高相液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[12-18]、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法[19-22]、氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[23-24]等，但往往基于目標物含量低，食品基質(zhì)本身復雜，氨基甲酸乙酯的檢測常常需要進行有效前處理，如提取、凈化、濃縮等[12,25-26]，因氨基甲酸乙酯本身屬于小分子化合物，較易在濃縮階段損失較大，造成檢測靈敏度下降，因此，樣品的前處理已成為檢測食品中氨基甲酸乙酯的關(guān)鍵步驟[27-29]?，F(xiàn)行GB 5009.223—2014《食品安全國家標準 食品中氨基甲酸乙酯的測定》適用范圍有限，僅適用于酒類、醬油等少數(shù)食品類別。本研究在國標基礎(chǔ)上，通過優(yōu)化提取、凈化及濃縮等前處理步驟，建立氣相色譜-質(zhì)譜法測定發(fā)酵乳中氨基甲酸乙酯含量的方法，為保障發(fā)酵乳的質(zhì)量安全提供技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

氨基甲酸乙酯（色譜純，純度＞99%）、D5-氨基甲酸乙酯（色譜純，純度＞99%）、堿性硅藻土小柱（5 g，20 mL） 上海安譜實驗科技股份有限公司；其他所用試劑均為色譜純。

1.2 儀器與設(shè)備

TRACE1310-ISQ氣相色譜-質(zhì)譜儀 美國賽默飛世爾科技公司；HP-INNOWAX毛細管色譜柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm） 美國安捷倫公司。

1.3 方法

1.3.1 標準溶液配制

D5-氨基甲酸乙酯標準儲備液（1 000 μg/mL）：準確稱取D5-氨基甲酸乙酯標準品10 mg置于10 mL容量瓶中，甲醇溶解后定容，渦旋混勻，4 ℃冰箱中保存。

D5-氨基甲酸乙酯標準使用液（10 μg/mL）：準確移取D5-氨基甲酸乙酯標準儲備液（1 000 μg/mL）1.0 mL于100 mL容量瓶中，甲醇溶解后定容，渦旋混勻，4 ℃冰箱中保存。

氨基甲酸乙酯標準儲備液（100 μg/mL）：準確稱取氨基甲酸乙酯標準品10 mg置于100 mL容量瓶中，甲醇溶解后定容，渦旋混勻，4 ℃冰箱中保存。

氨基甲酸乙酯標準中間液（0.5 μg/mL）：準確移取氨基甲酸乙酯標準儲備液（100 μg/mL）0.5 mL于100 mL容量瓶中，甲醇溶解后定容，渦旋混勻，4 ℃冰箱中保存。

標準系列工作液：分別準確移取0.5 μg/mL氨基甲酸乙酯標準中間液0.02、0.04、0.10、0.20、0.40 mL于1.0 mL容量瓶中，各加入D5-氨基甲酸乙酯標準使用液（10 μg/mL）20 μL，甲醇定容，即得到質(zhì)量濃度分別為10、20、50、100、200 ng/mL的標準系列工作液。

1.3.2 試樣的制備

樣品混勻，準確稱取2.0 g于10 mL塑料離心管中，加水5 mL，再分別加入10 μg/mLD5-氨基甲酸乙酯標準使用液20 μL、氯化鈉0.3 g，超聲提取30 min，4 ℃、5 000 r/min離心5 min，吸取上清液至塑料離心管中，加5 mL正己烷，渦旋萃取2 min，棄正己烷層，取水層置于堿性硅藻土固相萃取柱，使樣液緩慢滲透至填料中，靜置10 min，用10 mL乙酸乙酯洗脫，洗脫液經(jīng)2 g無水硫酸鈉脫水后，收集于10 mL塑料離心管中，35 ℃下減壓濃縮至約0.5 mL，甲醇定容至1 mL，供氣相色譜-質(zhì)譜儀分析。

1.3.3 儀器條件

1.3.3.1 氣相色譜條件

進樣口溫度220 ℃；爐溫程序：初始溫度50 ℃，保持1 min，以6 ℃/min速率升至180 ℃，保持5 min，再以20 ℃/min速率升至240 ℃，保持2 min；載氣：高純氦氣；設(shè)置流速為1.0 mL/min；進樣方式：不分流，進樣量1.0 μL。

1.3.3.2 質(zhì)譜條件

電離方式：電子轟擊離子源；離子源溫度230 ℃；氣相色譜-質(zhì)譜儀接口溫度280 ℃；監(jiān)測方式：選擇性離子監(jiān)測（selected ion monitoring，SIM），監(jiān)測離子如表1所示。

表1 目標物及內(nèi)標的監(jiān)測離子Table 1 Monitoring ions of target compound and internal standard

1.3.3.3 結(jié)果計算

式中：X為樣品中氨基甲酸乙酯含量/（μg/kg）；ρ為測定液中氨基甲酸乙酯含量/（ng/mL）；V為樣品測定液的定容體積/mL；m為樣品質(zhì)量/g。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用Excel 2010軟件進行數(shù)據(jù)處理及繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 提取方式的選擇

樣品常見的提取方式分為3 類：超聲提取、索氏提取及液-液萃取。一般來說，索氏提取耗時較長，操作過程相對復雜，同時溶劑用量較大；液-液萃取方式，如處理不當，對于發(fā)酵乳樣品來說極易乳化，極大降低提取效率；而超聲提取則具備操作步驟簡易、方便樣品的大批量處理等優(yōu)點，采用超聲提取法提取30 min可保證發(fā)酵乳中氨基甲酸乙酯的加標回收率高達90%以上，因此，選擇超聲提取法較適宜。

2.2 洗脫溶劑的選擇

GB 5009.223—2014以正己烷淋洗方式除雜，然而在實際操作過程中發(fā)現(xiàn)，凈化處理前采用5 mL正己烷直接萃取可以更有效去除發(fā)酵乳中脂溶性雜質(zhì)，大幅減少待測樣品對儀器進樣口端的污染。因此，本研究采用正己烷萃取代替正己烷淋洗除雜的操作過程。

國標選擇體積分數(shù)5%乙酸乙酯-乙醚作為目標物洗脫劑，其中乙醚體積分數(shù)占到95%，因乙醚具有刺激性氣味，且毒性較大，考慮到實驗人員的健康安全，實驗室應(yīng)盡可能避免或減少這些試劑的使用。比較乙酸乙酯、體積分數(shù)50%乙酸乙酯-乙醚、體積分數(shù)5%乙酸乙酯-乙醚、乙醚4 種洗脫溶劑對發(fā)酵乳中氨基甲酸乙酯加標回收率的影響。

由圖1可知，分別經(jīng)4 種洗脫溶劑洗脫后，樣品中氨基甲酸乙酯加標回收率相差無幾，均在95%以上，考慮到乙醚的使用量，直接選擇乙酸乙酯作為目標物的洗脫溶劑。

圖1 洗脫溶劑對樣品中氨基甲酸乙酯加標回收率的影響（n=3）Fig.1 Effect of elution solvents on the recovery of the added ethyl carbamate (n = 3)

2.3 內(nèi)標物的選擇

本方法使用的內(nèi)標物為D5-氨基甲酸乙酯，其是與氨基甲酸乙酯具有相同分子結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定同位素，且具有基本一致的物理化學性質(zhì)，內(nèi)標的加入能夠有效消除基質(zhì)效應(yīng)及前處理等因素對分析結(jié)果的影響，在色譜分析中又能與待測物實現(xiàn)充分分離，尤為重要的是，D5-氨基甲酸乙酯作為一種人工合成物質(zhì)，無法在生產(chǎn)過程中自然產(chǎn)生。這些特點使D5-氨基甲酸乙酯作為該檢測方法的內(nèi)標物，大大優(yōu)于氨基甲酸丙酯等同類化合物。在預(yù)處理前加入內(nèi)標物D5-氨基甲酸乙酯，當混合溶液中的待測物和內(nèi)標物的含量比值維持恒定時，可以消除預(yù)處理過程中帶入的不穩(wěn)定性因素的影響。

2.4 色譜柱的選擇

本研究選擇的是HP-INNOWAX毛細管色譜柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm），該色譜柱為一種超惰性色譜柱，不易與化合物之間產(chǎn)生吸附作用，固定相可采用溶劑沖洗，同時可耐受水溶液或含水溶液進樣，分析時能夠更加有效地分離氨基甲酸乙酯與內(nèi)標物D5-氨基甲酸乙酯，提供對稱的峰形及更強的響應(yīng)。且該色譜柱可以檢測其他酯類、醇類及酸類等化學成分，適用范圍廣泛，且適用性強。氨基甲酸乙酯與其內(nèi)標物的峰形完整且完全分開。

2.5 標準譜圖及線性關(guān)系

由圖2可知，氨基甲酸乙酯與D5-氨基甲酸乙酯標準品色譜峰型均良好，且分離效果佳。在質(zhì)量濃度0～200 ng/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)r＞0.999。

圖2 氨基甲酸乙酯與D5-氨基甲酸乙酯標準品的SIM譜圖Fig.2 SIM chromatograms of ethyl carbamate and D5-ethyl carbamate standard

2.6 檢出限與定量限

向儀器注入一定濃度的氨基甲酸乙酯標準溶液，觀察噪音強度，將3 倍信噪比（RS/N）作為檢出限最低響應(yīng)值，通過稀釋氨基甲酸乙酯標準溶液使其響應(yīng)強度至3 倍RS/N，計算得到氨基甲酸乙酯檢出限為2.0 μg/kg；稀釋氨基甲酸乙酯標準溶液使其響應(yīng)強度至10 倍RS/N，以10 倍RS/N作為其定量限最低響應(yīng)值，計算得到定量限為5.0 μg/kg。結(jié)果表明，所建立的實驗方法靈敏度較高。

2.7 精密度與準確度

在空白發(fā)酵乳基質(zhì)中分別添加5.0、10.0、50.0 μg/kg 3 個水平的氨基甲酸乙酯，按實驗方法進行測定，計算其加標回收率和相對標準偏差（relative standard deviation，RSD）。

由表2可知，氨基甲酸乙酯加標回收率為89.9%～105.2%，RSD小于10%，符合GB/T 27404—2008《實驗室質(zhì)量控制規(guī)范 食品理化檢測》中的相關(guān)要求。

表2 發(fā)酵乳中氨基甲酸乙酯加標回收率與RSD（n=6）Table 2 Recoveries and RSD of ethyl carbamate spiked in fermented milk (n = 6)

2.8 樣品分析

隨機網(wǎng)購10 個不同品牌發(fā)酵乳，按1.3.2節(jié)進行處理，由表3可知，氨基甲酸乙酯檢出率為100%，但檢測值較低，最高含量僅為10.8 μg/kg。由此可見，市面上的發(fā)酵乳中氨基甲酸乙酯的污染問題較為普遍，但含量處于較低水平。

表3 網(wǎng)購發(fā)酵乳中氨基甲酸乙酯的檢測結(jié)果（n=3）Table 3 Results of detection of ethyl carbamate in fermented milk purchased online (n = 3)

3 結(jié) 論

通過對國標中提取方法、洗脫溶劑等參數(shù)進行優(yōu)化，建立氣相色譜-質(zhì)譜法測定發(fā)酵乳中氨基甲酸乙酯的分析方法，該方法具有靈敏度高、重復性好等特點，通過對市面上不同品牌的發(fā)酵乳中氨基甲酸乙酯進行隨機監(jiān)測發(fā)現(xiàn)，污染問題普遍存在，但氨基甲酸乙酯含量較低，這些實驗數(shù)據(jù)可為國家食品安全風險監(jiān)測提供一定依據(jù)。