罕見Ael亞型的血清學和基因序列分析①

劉鳳霞 李國才 周鳴（中南大學湘雅三醫(yī)院輸血科，長沙 410013）

KARL LANDSTEINER發(fā)現(xiàn)了人類第一個血型系統(tǒng)——ABO，從而打開了血庫之門［1］。這標志著不同個體紅細胞膜上紅細胞抗原唯一性的概念的開始。ABO血型系統(tǒng)至今仍是輸血醫(yī)學中最重要的血型系統(tǒng)。A101和B101為ABO基因的兩個等位基因，分別編碼A糖基轉(zhuǎn)移酶和B糖基轉(zhuǎn)移酶。兩者在編碼區(qū)僅有7個核苷酸存在差異，導(dǎo)致4個不同的氨基酸殘基。A型個體表達A糖基轉(zhuǎn)移酶將UDP-GalNAc分子上的GalNAc基團催化轉(zhuǎn)移至H前體糖蛋白從而形成A抗原；而B型個體表達B糖基轉(zhuǎn)移酶將從UDP-Ga1分子上的Gal基團催化轉(zhuǎn)移至H前體糖蛋白從而形成B抗原［1］。ABO基因位于第9號染色體，由7個外顯子組成，跨越約19.5 kb的基因組DNA［2］。最后兩個外顯子（6和7）編碼ABO糖基轉(zhuǎn)移酶類的催化結(jié)構(gòu)區(qū)域，大多數(shù)編碼序列在7號外顯子上。開放閱讀框最大的部分位于6、7號外顯子［3］。一系列遺傳突變，包括替換、剪接位點突變、堿基插入、缺失和雜交等位基因，可能影響A或B糖基轉(zhuǎn)移酶（GT）活性，導(dǎo)致ABO表型表達變化［4］。ABO基因型的復(fù)雜性是由于ABO血型基因位點的顯著多樣性。常見的等位基因之間的重組或基因轉(zhuǎn)換可能會雜交產(chǎn)生意想不到的ABO表型。檢索血型抗原基因突變數(shù)據(jù)庫發(fā)現(xiàn)，ABO血型基因大部分突變位點位于外顯子6和7，占77%［5］。ABO亞型是糖基轉(zhuǎn)移酶執(zhí)行糖化功能的酶動力學差異造成的［6］。對1例Ael亞型獻血者進行全面分析，發(fā)現(xiàn)其存在新的基因突變，結(jié)合其血清學特點探討Ael亞型鑒定策略。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 標本來源2021年3月1例ABO正反定型不符的血液標本由中南大學湘雅三醫(yī)院提供。

1.1.2 試劑與儀器抗-A、抗-B單克隆血型試劑（北京金豪制藥股份有限責任公司）；ABO血型反定型標準紅細胞（江蘇力博醫(yī)藥生物技術(shù)有限責任公司）；抗-H抗體（荷蘭sanquin公司）；抗-A，B抗體、核酸提取試劑盒、人類紅細胞ABO血型基因分型熒光PCR法試劑盒（江蘇中濟萬泰生物醫(yī)藥有限責任公司）；Glycosyhransferase Activity Kit（美 國R&D公司）；UDP-GalNAc、MUC-1（美國Sigma公司）；人類紅細胞ABO血型基因分型試劑盒、特異性引物（天津秀鵬生物技術(shù)有限公司）；KA-2200血型血清專用離心機（日本久保田公司）；ABI9700 PCR儀（美國ABI公司）；熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）檢測系統(tǒng)FQD-96A（杭州博日科技有限公司）；酶標儀（美國Thermo公司）。

1.2 方法

1.2.1 血型血清學檢查根據(jù)文獻［7］進行紅細胞ABO血型正反定型檢測、紅細胞抗體篩查、H抗原檢測、唾液中ABH血型物質(zhì)測定試驗和紅細胞弱抗原吸收放散試驗。

1.2.2 糖基轉(zhuǎn)移酶活性測定根據(jù)文獻［8］和Gly?cosyhransferase Activity Kit說明書繪制糖基轉(zhuǎn)移酶活性測定標準曲線；以已知正常A型紅細胞/血清作為對照和待測獻血者的離體后2 h內(nèi)紅細胞/血清為檢測對象，檢測N-乙酰半乳糖胺基轉(zhuǎn)移酶活性：供體為1 mmol/L的UDP-GalNAc，受體為0.4 mg/L的MUC-1；最后按本實驗室標準曲線的轉(zhuǎn)換因子（CF）通 過 公 式Specific Activty=S（吸 光 度A/μg）×CF（pmol/吸光度A）/Time（minutes）計算N-乙酰半乳糖胺基轉(zhuǎn)移酶活性。

1.2.3 ABO血型基因分型PCR摻入染料法以熒光染料通過摻入DNA的擴增產(chǎn)物表示DNA擴增效果。擴增后進行熔解曲線分析。通過熔解曲線分析可確認目的產(chǎn)物是否被特異性擴增，以此判斷ABO的等位基因。

1.2.3.1 全血DNA提取根據(jù)核酸提取試劑盒說明書提取該標本基因組DNA。

1.2.3.2 PCR擴增反應(yīng)根據(jù)人類紅細胞ABO血型基因分型試劑盒（熒光PCR法）說明書進行擴增和結(jié)果判讀。

1.2.4 ABO血型基因測序 采用特異性引物對ABO基因的外顯子1~7進行雙鏈擴增，然后對擴增產(chǎn)物進行測序。使用ChromasPro Version軟件1.2版本將結(jié)果與NCBI-dbRBC網(wǎng)站公布的序列比對，確定ABO基因的突變位點及類型。

2 結(jié)果

2.1 血型血清學檢測結(jié)果

2.1.1 ABO血型正反定型結(jié)果及紅細胞抗體篩查結(jié)果結(jié)果顯示標本正定型為O型，反定型標本血清與B細胞凝集強度較強，為3+~4+，與A1型紅細胞凝集強度較弱，為0~1+，提示ABO正反定型不符。反定型采用3個A型和3個O型獻血者紅細胞，結(jié)果無凝集。

2.1.2 H抗原檢測選取健康成人O型紅細胞做強陽性對照，A型紅細胞做弱陽性對照，與獻血者紅細胞做H抗原檢測結(jié)果顯示，獻血者紅細胞與抗-H凝集強度明顯強于健康成人A細胞，與O細胞凝集強度相當。

2.1.3 唾液中ABH血型物質(zhì)測定結(jié)果獻血者待檢唾液與標化的抗體試劑中和后與A細胞反應(yīng)有2+凝集，與B細胞反應(yīng)有2+凝集，與O細胞反應(yīng)無凝集；提示患者唾液中無A、B血型物質(zhì)，只有H血型物質(zhì)。

2.1.4 吸收放散試驗結(jié)果采用單克隆抗-A進行吸收放散試驗，末次洗液與健康成人O型紅細胞、A型紅細胞凝集反應(yīng)均顯示為陰性；放散液與O細胞凝集反應(yīng)顯示為陰性，但與A細胞凝集反應(yīng)顯示有凝集，且均為3+，提示該獻血者紅細胞表面存在弱A抗原。

2.2N-乙酰半乳糖胺基轉(zhuǎn)移酶的試驗結(jié)果采用Glycosyhransferase Activity Kit試劑盒檢測該獻血者紅細胞和正常A紅細胞上N-乙酰半乳糖胺基轉(zhuǎn)移酶活性，發(fā)現(xiàn)獻血者紅細胞的N-乙酰半乳糖胺基轉(zhuǎn)移酶活性為0。同時測定血漿中的N-乙酰半乳糖胺基轉(zhuǎn)移酶活性，發(fā)現(xiàn)該獻血者血漿中的N-乙酰半乳糖胺基轉(zhuǎn)移酶活性亦為0。

2.3 ABO血型基因分型依據(jù)熒光PCR試劑盒結(jié)果分型表判讀，該標本ABO血型基因分型為A/O02型（圖1），藍色框為內(nèi)參，紅色框為陽性條帶。

圖1 ABO血型基因分型結(jié)果Fig.1 ABO Blood group genotyping results

2.4 ABO測序結(jié)果（檢測1~7外顯子）根據(jù)NCBI網(wǎng)站提供的The Blood Group Antigen Gene Mutation Database綜合結(jié)果判定（以A101為參考序列），該樣本的測序結(jié)果（表1）為：ABO基因在A101/O02的基礎(chǔ)上發(fā)生了239G>A的雜合突變（圖2），且位于外顯子5的最后一位，極可能導(dǎo)致RNA的可變剪接。該突變將導(dǎo)致ABO基因編碼蛋白的第80位氨基酸由半胱氨酸（Cys）變成絡(luò)氨酸（Tyr）。該突變并未被截止到2020年12月的dbRBC數(shù)據(jù)庫收錄。根據(jù)血清學結(jié)果推測，該突變可能位于A基因，影響了A抗原表達。同時，根據(jù)ISBT網(wǎng)站提供的Names for ABO（ISBT 001）blood group alleles v1.1 171023綜合結(jié)果判定（以A101為參考序列），測序結(jié)果一致，在ISBT數(shù)據(jù)庫中同樣未收錄239G>A的突變。

表1 1~7外顯子的測序結(jié)果Tab.1 Sequencing results of exons 1~7

圖2 ABO基因第5外顯子測序結(jié)果（239G>A的突變）Fig.2 Sequencing results of the fifth exon of ABO gene（with mutations of 239G>A）

3 討論

ABO血型系統(tǒng)是唯一具有正反定型的血型系統(tǒng)，又因具有強血型抗原性使其成為最為重要的血型系統(tǒng)。ABO亞型是指紅細胞或分泌液（“分泌型”個體中）所含A或B抗原量不同的表型［3］。世界范圍內(nèi)有超過300個ABO亞型的等位基因報道［9-10］。大量亞型的原報道見于使用單克隆分型試劑常規(guī)檢測ABO血型之前。如果使用常用的人源多克隆抗-A、抗-B和抗-A，B試劑，ABO亞型則表現(xiàn)為血清學反應(yīng)性減弱。ABO亞型常常導(dǎo)致血型血清學的ABO血型正反定型不符。A亞型存在一個問題：如果一個Ax供者被誤判成O型，輸給一個O型患者，是有潛在危險的，因為O型患者有抗-A，B抗體，可凝集Ax紅細胞并使其溶解，引起急性血管內(nèi)溶血。因此對于A亞型的準確鑒定不僅能反映一個實驗室的檢測水平，同時對于輸血安全也非常重要。

中國人群ABO亞型檢出率為0.015%［11］，比A2弱的亞型很少，大多通過ABO正反定型不符被發(fā)現(xiàn)。A亞型的特征包括：紅細胞上A抗原位點減少（與人源多克隆抗-A試劑反應(yīng)較弱或不凝集）；不同程度地凝集人源抗-A、抗-B試劑［3］；H抗原的高度變異性，導(dǎo)致與抗-H試劑反應(yīng)增強；血清中是否存在抗-A1；可利用分泌型檢測，吸收放散試驗；分子生物學的進展使得檢測紅細胞上具有A或B抗原弱表達的許多亞型成為可能［12］。分子檢測等將A型個體細分為A3、Ax、Aend、Ael等。其中Ael亞型為1種少見的A亞型，該亞型個體紅細胞上的A抗原極少，僅為A1型的1/1 000。用單克隆抗血清檢測不到A抗原，需要用人源抗血清吸收放散才能檢出。研究顯示ABO亞型個體中，吸收放散型亞型（Ael/Bel/AelB/ABel）的個體者占14%（11/77）［13-15］。Ael紅細胞與抗-A或抗-A，B試劑不凝集?？?A，B對弱的AB抗原的檢測能力強于單克隆抗-A和抗-B，當亞型弱A/B抗原與單克隆抗-A和抗-B反應(yīng)呈陰性時，常使用抗-A，B進行檢測，但抗-A，B試劑檢測紅細胞上抗原并非常規(guī)用于ABO檢測［16］。Ael只有通過吸收放散試驗才可證實A抗原的存在，其個體血清或紅細胞膜上檢測 不 到A糖基轉(zhuǎn)移 酶［17］。Ael遺傳 自ABO位 點 上一個罕見的等位基因［17-18］。Ael型個體血清中通常含抗-A1抗體，與A1紅細胞反應(yīng)，有時產(chǎn)生抗-A，與A2紅細胞反應(yīng)［17］。Ael分泌型唾液中只含H物質(zhì)。本文案例獻血者使用常規(guī)血型血清學檢測，正定型紅細胞與單克隆抗-A、抗-B、抗-A，B試劑均無反應(yīng)，只能通過吸收放散才能證實A抗原的存在，這是Ael的核心定義所在。另外，弱抗原吸收放散試驗特別需要注意的是，越容易吸收到紅細胞上的抗體越難從紅細胞上放散下來。按放散液抗體的強度A1

弱A和弱B抗原的產(chǎn)生與分子水平的改變，如核酸替換、缺失、插入、剪切位點突變等相關(guān)，因此分子生物學手段，如PCR、基因測序，是鑒定ABO亞型的重要手段［19］。為進一步明確其類型，需要進行ABO血型基因分型和ABO基因測序分析。ABO基因的移碼、插入、缺失突變、堿基替換等可能改變ABO基因表達或糖基轉(zhuǎn)移酶活性，最終形成血型不同的亞型表型［20］。結(jié)合在ABO基因啟動子上的轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控糖基轉(zhuǎn)移酶的表達和活性，形成A亞型或B亞型［21-22］。所有ABO抗原均源于單個ABO基因的突變，但只有3種高頻率的特殊突變會直接改變表位結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致A、B或O特異性的改變。兩種突變（替換）可改變酶的特異性，從α-3-N-乙酰半乳糖氨基轉(zhuǎn)移酶（A酶）轉(zhuǎn)變成α-3-D-半乳糖基轉(zhuǎn)移酶（B酶）［3］。這些糖基轉(zhuǎn)移酶類將1，3N-乙酰半乳糖胺（A）或1，3半乳糖（B）碳水化合物加至H糖鏈末端。第三種突變是指5'催化結(jié)構(gòu)區(qū)域的缺失，導(dǎo)致移碼和酶的失活，而H糖鏈未被改變［23］。不同糖類組成不同的A、B、O抗原或抗原表位。外顯子6和7是產(chǎn)生ABO亞型基因突變的主要區(qū)域，因此目前大部分基因測序局限在外顯子6和7。當血清學結(jié)果異常而外顯子6和7測序正常時，為探索本例獻血者抗原減弱的原因需要檢測其他外顯子是否存在突變。對外顯子1~5進行測序，結(jié)果顯示，ABO基因在A101/O02的基礎(chǔ)上發(fā)生了239G>A的雜合突變，根據(jù)與野生型正常A的比對，該突變位于A基因5號外顯子的最后一位堿基，將導(dǎo)致ABO基因編碼蛋白的第80位氨基酸由Cys變成絡(luò)氨酸Tyr，從而導(dǎo)致A抗原的功能或活性減弱。突變引起的蛋白質(zhì)變化是ABO亞群的潛在原因［4］。但基因分型預(yù)測的血型表型最終還須結(jié)合血清學方法來驗證，從而避免潛在的定型錯誤。ABO亞型是由血型血清學方法結(jié)合基因型所定義，因為ABO基因突變并不是決定紅細胞表面A、B抗原數(shù)量的唯一因素。值得注意的是，仍存在一些A變異型與以上亞型的描述不符，因此ABO亞群背后巨大的遺傳異質(zhì)性已經(jīng)非常明顯［24］。后續(xù)會進一步對該獻血者的父母和子女進行ABO血型相關(guān)檢測以證實該突變的遺傳性。

在輸血相容性檢測當中應(yīng)特別注意患者的臨床資料，許多導(dǎo)致異常血型的原因往往都可依據(jù)臨床資料資料來排除，如年齡、移植史、用藥史、診斷、輸血史等，將血清學、基因測序、糖基轉(zhuǎn)移酶檢測與Ael亞型家譜研究相結(jié)合，有助于進一步了解A亞型的形成機制。ABO變異的分子基礎(chǔ)在不同群體中具有特定特征。涉及ABO變異的最佳輸血實踐將是基于特定人群的數(shù)據(jù)和經(jīng)驗。氨基酸的變化對所編碼的蛋白質(zhì)具有不同的性質(zhì)和顯著的影響［4］。對于ABO亞型建議盡可能開展三代家系調(diào)查以確定其遺傳性，為完善中國人群ABO亞型數(shù)據(jù)庫奠定基礎(chǔ)。