非洲豬瘟病毒檢測方法研究進展

文│黃永生（深圳市質(zhì)量安全檢驗檢測研究院、深圳市動物疫病預(yù)防控制中心）

徐志遠 婁華*（佛山科學(xué)技術(shù)學(xué)院）

非洲豬瘟（African swine fever，ASF）是由非洲豬瘟病毒（African swine fever virus，ASFV）感染引起的一種急性、熱性、出血性、高度接觸性的烈性傳染病。該病可引起各個品種和年齡段的豬發(fā)病，其臨床特征為高熱、皮膚發(fā)紺、嘔吐、便血、淋巴結(jié)嚴重出血、脾腫大3～10倍，典型敗血癥，發(fā)病急、病程短、死亡率高。近年來，非洲豬瘟給國內(nèi)外養(yǎng)豬業(yè)帶來巨大威脅的同時也造成了巨大的經(jīng)濟損失。因此，目前非洲豬瘟被稱為養(yǎng)豬業(yè)的“頭號殺手”。

非洲豬瘟病毒是目前惟一已知的蟲媒DNA病毒。自1921年首次在非洲肯尼亞地區(qū)發(fā)現(xiàn)ASFV后，該病毒相繼在西班牙、意大利、法國、比利時、馬耳他以及荷蘭等國家和地區(qū)被發(fā)現(xiàn)。20世紀90年代，該病毒在歐洲大部分地區(qū)被消滅，但仍流行于意大利撒丁島。2007年，ASFV首次傳入俄羅斯高加索地區(qū)格魯吉亞，并于當(dāng)年8月在亞美尼亞暴發(fā)流行，此后ASFV傳播到烏克蘭、白俄羅斯。2014年在立陶宛、愛沙尼亞、波蘭、拉脫維亞相繼報道非洲豬瘟疫情。2017年，意大利、羅馬尼亞、捷克共和國以及匈牙利等國暴發(fā)非洲豬瘟疫情。2018年8月，我國在遼寧省沈陽市某豬場首次發(fā)現(xiàn)ASFV，此后我國的一些其他省份相繼發(fā)生非洲豬瘟疫情。

目前，非洲豬瘟尚無安全、有效的疫苗以及特異性藥物進行非洲豬瘟的防治，對其防控依然采取的是快速檢測結(jié)合有效的生物安全措施為主。因而，ASF快速檢測方法的建立對于ASF的診斷、疫情的確認與及時處置、防控與凈化起到至關(guān)重要的作用。

一、非洲豬瘟病毒的特點

ASFV是非洲豬瘟病毒科、非洲豬瘟病毒屬中唯一的成員，其結(jié)構(gòu)為復(fù)雜的二十面體結(jié)構(gòu)，直徑約為200納米，基因組為線性雙鏈DNA，基因組全長度170～190kb，包含151～167個開放閱讀框，可以編碼170多種蛋白，目前超過一半的蛋白功能未知。成熟病毒顆粒包含54種結(jié)構(gòu)蛋白，其中病毒血清學(xué)檢測方法研究最為常用的結(jié)構(gòu)蛋白為p30、p54、p72。ASFV具有雙層囊膜結(jié)構(gòu)，對外界環(huán)境的抵抗力非常強，血清等有機質(zhì)的存在也可以增加病毒的抵抗力。ASFV根據(jù)結(jié)構(gòu)蛋白p72的B646L基因序列的不同可分為24種基因型，而依據(jù)病毒顆粒表面蛋白的抗原性又可以分為8種不同的血清型。ASFV是目前惟一已知的蟲媒DNA病毒，鈍緣蜱是其重要的傳播媒介。ASFV可以借助口鼻間接觸與破損的皮膚進行直接接觸的水平方向傳播，也可以通過糞便、尿液、唾液等排泄物或分泌物的接觸進行間接接觸傳播。除此之外，相關(guān)研究還表明，ASFV還可以借助氣溶膠進行短距離傳播。ASFV在未熟制肉品、凍肉、腌肉、泔水中可以長時間存活，在糞便以及受污染的豬舍內(nèi)可以存活30天之久，豬只飼喂泔水也是引起ASFV傳播的重要途徑。

二、免疫學(xué)檢測方法

1.酶聯(lián)免疫吸附試驗。酶聯(lián)免疫吸附試驗（Enzyme linked immunosorbent assey，ELISA）是OIE推薦的用于ASFV診斷最常用的血清學(xué)檢測方法。ELISA的原理是將某種酶與抗體結(jié)合形成酶標抗體，然后與吸附于固相載體上的相應(yīng)的抗原或者抗體發(fā)生特異性結(jié)合反應(yīng)，加入底物溶液，發(fā)生酶分子催化反應(yīng)，呈現(xiàn)不同的顏色變化，據(jù)此來判斷抗原或抗體的含量。根據(jù)檢測靶標的不同，可以將其分為直接ELISA、間接ELISA、雙夾心ELISA以及阻斷ELISA。采用ELISA方法進行ASFV檢測時，對于抗原檢測最為常用的靶標為p30、p54、p72、p32、K205R。ELISA方法具有操作簡便、質(zhì)優(yōu)價廉、實用性強、快速以及對儀器設(shè)備要求不高的優(yōu)點，適用于ASFV的大規(guī)模流行病學(xué)調(diào)查以及定期監(jiān)測。Barderas等利用制備的重組p30蛋白開發(fā)了檢測非洲豬瘟病毒的間接ELISA方法，實現(xiàn)了對ASFV的特異性抗體的檢測。Cubillos等基于ASFV東非分離株制備出了重組p30蛋白，并設(shè)計了相應(yīng)的ELISA診斷方法，經(jīng)檢測可以準確檢測出ASFV。Wardley等以抗ASFV的特異性抗體IgG為包被單抗，設(shè)計了間接ELISA試驗，實現(xiàn)了對ASFV抗原的檢測，其最低檢測濃度為50HAD50/毫升，上限檢測濃度為500HAD50/毫升。Perez Filgueira D M等借助昆蟲細胞表達的重組蛋白p30作為包被抗原，設(shè)計了間接ELISA檢測方法用于非洲豬瘟病毒抗體的檢測，對采樣于西班牙以及來自非洲不同地區(qū)的672份豬血取其血清作為樣品檢測，可以檢測到非洲豬瘟病毒的特異性抗體，同時，通過此種方法可以實現(xiàn)對ASFV早期感染樣品的檢測。因此，也證實了此種間接ELISA檢測方法具有較高的敏感性。鄔旭龍等依據(jù)原核表達的pk205R蛋白為包被抗原，設(shè)立了檢測ASFV抗體的間接ELISA診斷方法。由此表明，ELISA檢測方法及開發(fā)的相關(guān)試劑盒在ASFV的檢測中得到了廣泛應(yīng)用。

2.免疫熒光試驗。免疫熒光試驗（Immunofluorescence assey，IFA）的原理是利用熒光素標記相應(yīng)的抗原或抗體，使之與其相對應(yīng)的抗體或抗原發(fā)生特異性結(jié)合，形成抗原—抗體免疫復(fù)合物，在熒光顯微鏡下觀察，實現(xiàn)對未知抗原或抗體的檢測。根據(jù)其檢測靶標是抗原或抗體，可以將其分為直接免疫熒光試驗和間接免疫熒光試驗。直接免疫熒光試驗的原理是利用熒光素（如異硫氰酸熒光素）標記抗ASFV的特異性單抗或多抗，將其與組織觸片以及薄層冷凍切片上的抗原直接發(fā)生反應(yīng)后鏡檢，實現(xiàn)對ASFV的抗原檢測。此種方法具有特異性強、靈敏度高的優(yōu)點，但也存在不足之處，如對操作技術(shù)要求高、對實驗室設(shè)備要求高以及需要特定的操作環(huán)境等。間接免疫熒光試驗的原理是將感染ASFV的細胞（如原代以及傳代培養(yǎng)細胞）固定于固相載體（載玻片）上，加入待檢測血清，使之發(fā)生特異性反應(yīng)，若待檢測的血清樣品中含有ASFV的特異性抗體，則會與含有ASFV抗原的特定細胞進行結(jié)合，進而會與熒光染料標記的二抗發(fā)生特異性結(jié)合，形成特異性熒光復(fù)合物，通過熒光顯微鏡觀察可對此復(fù)合物做出判斷。此種檢測方法與直接免疫熒光試驗存在一樣的不足之處。免疫熒光試驗對于急性感染ASFV豬只樣品檢測的敏感性較高，但不適用于亞急性及慢性感染豬只的檢測。Heuschele等通過免疫熒光試驗實現(xiàn)了對不產(chǎn)生紅細胞吸附現(xiàn)象的ASFV的檢測。

3.免疫印跡試驗。免疫印跡試驗（Immunoblotting test，IBT）的原理是將聚丙烯酰胺凝膠電泳分離得到的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到膜上，通過一抗與二抗的孵育，實現(xiàn)對ASFV抗原或抗體的檢測，這是一種凝膠電泳與免疫分析化學(xué)技術(shù)相結(jié)合的檢測技術(shù)。免疫印跡試驗具有特異性強、靈敏度高、準確性好、高通量的優(yōu)點，同時對于含有細胞化合物的抗原進行檢測時假陽性率低，但操作煩瑣，對實驗設(shè)備以及實際試驗操作環(huán)境要求較高，此種方法僅適用于實驗室檢測。Kazakova等基于其制備的較高純度重組表達p30蛋白開發(fā)了相對應(yīng)的免疫印跡檢測方法，實現(xiàn)了對ASFV感染豬只的血清及組織樣品的檢測，具有非常高的特異性和敏感性。對于家豬或野豬以及自然感染狀態(tài)下的豬只，可在感染ASFV后6～8天從其血清或組織器官中檢出相應(yīng)的特異性抗體。

4.膠體金免疫層析法。膠體金免疫層析法（C o l l o i d a l g o l d immunochromatography，GICA）是以膠體金作為示蹤標記物用于抗原或抗體檢測的新型固相載體免疫檢測技術(shù)。膠體金免疫層析試紙條包括質(zhì)控線和檢測線兩部分，質(zhì)控線是保證試紙條是完好的，而檢測線的存在是對樣本進行檢測，檢測線的存在與否用于檢測結(jié)果的判斷。此種檢測方法具有易操作性、實用性、快速、便攜、費用低、特異性好的優(yōu)點，不需要專業(yè)的儀器設(shè)備，肉眼即可進行檢測結(jié)果判斷等優(yōu)點，但對于檢測樣本濃度有一定的要求。膠體金免疫層析試紙條適用于ASFV的現(xiàn)場快速初步診斷、ASFV的流行病學(xué)調(diào)查以及定期監(jiān)測、急性感染、疑似感染與病死豬的檢測，但不適用于ASFV感染的早期檢測。Sastre等基于制備的抗ASFV結(jié)構(gòu)蛋白p72的單克隆抗體，建立了用于ASFV抗原檢測的免疫層析試紙條。張鑫宇等基于制備的抗ASFV的p54蛋白的抗體，建立了具有較高特異性的膠體金免疫層析檢測法。林彥星等利用量子點標記葡萄球菌A蛋白，建立了相應(yīng)的量子點免疫層析檢測技術(shù)，可用于ASFV抗體的快速檢測。吳海濤等基于原核表達的ASFV衣殼蛋白PET-30A-P72，利用雙抗體夾心法原理，制備了純化的用于膠體金標記的特異性多抗，建立了具有較高靈敏度的膠體金免疫層析抗原檢測法。

三、核酸檢測方法

1.常規(guī)PCR檢測法。常規(guī)PCR（Polymerase chain reaction) ，稱為聚合酶鏈式反應(yīng)。這種檢測方法依據(jù)的是雙鏈擴增的原理，在引物、模板DNA以及4種脫氧核苷酸存在的情況下，在DNA聚合酶的催化作用下，依據(jù)堿基互補配對原則，在體外實現(xiàn)目的DNA片段的指數(shù)級擴增。常規(guī)PCR檢測方法是OIE推薦的用于ASFV診斷的核酸檢測方法，也是當(dāng)前實驗室較為實用的ASFV鑒別診斷方法。常規(guī)PCR檢測法具有特異性高、靈敏度高、簡便快速的優(yōu)點，且可實現(xiàn)擴增反應(yīng)終點產(chǎn)物的定性或半定量分析。這種檢測方法需要專業(yè)的熱循環(huán)儀，對操作人員的技術(shù)要求高，需要特定的實驗室環(huán)境條件等，因而并不適用于ASFV的現(xiàn)場快速檢測，是用于ASFV確診的實驗室檢測方法。Aguero M等建立了用于ASFV感染的早期診斷的PCR檢測方法，具有較高的特異性和敏感性。Giammarioli等建立了用于非洲豬瘟病毒（ASFV）、豬瘟病毒（CSFV）、豬繁殖與呼吸綜合征病毒（PRRSV）、豬圓環(huán)病毒2型（PCV-2）以及豬細小病毒（PPV）的檢測與鑒別診斷的多重PCR。張倩等建立了用于PRRSV、PCV-2、PPV以及PRV鑒別診斷的多重PCR檢測方法，經(jīng)過實際樣品的檢測，發(fā)現(xiàn)其具有較高的敏感性。Hu等建立了用于ASFV、PRRSV以及PRV鑒別診斷的三重PCR檢測方法。Luo等基于ASFV的P72蛋白基因高度保守區(qū)域設(shè)計特異性引物，建立了相應(yīng)的PCR檢測方法，其檢測限為60個拷貝。

2.熒光定量PCR檢測法。熒光定量PCR（Quantitative Real-time PCR）的原理是在反應(yīng)體系中加入熒光基團，通過捕捉熒光信號來追蹤擴增反應(yīng)產(chǎn)物，實現(xiàn)PCR反應(yīng)進程的實時監(jiān)測，最終通過呈現(xiàn)的標準曲線實現(xiàn)初始反應(yīng)模板定量分析。這種檢測方法具有特異性強、靈敏性極高、穩(wěn)定性好、操作簡便、準確性及可靠性高的優(yōu)點。因其具有極高靈敏度的特點，更需注重規(guī)范操作過程。相對于常規(guī)PCR而言，反應(yīng)更為迅速，且閉管操作污染小。這種檢測方法同樣需要專業(yè)的熱循環(huán)儀，對儀器設(shè)備要求及試驗條件要求高，只適用于實驗室檢測。熒光定量PCR檢測法是非洲豬瘟病毒檢測最為常用的實驗室檢測方法。King等基于ASFV的VP72特定基因序列設(shè)計特異性引物及TaqMan探針，建立了檢測ASFV的熒光定量PCR檢測方法，檢測限為40個拷貝。郭少平等基于ASFV的K205R基因序列構(gòu)建了熒光定量PCR檢測方法。張彩虹等基于ASFV的VP72基因序列設(shè)計相應(yīng)的引物和探針，構(gòu)建了只針對ASFV檢測的熒光定量PCR檢測方法，具有高度的特異性和敏感性的特點。王建華等依據(jù)ASVF的CP530R（pp62）基因序列以及高致病性PRRSV的NSP2基因序列，分別設(shè)計相對應(yīng)的特異性引物和TaqMan探針，建立了用于ASFV與高致病性PRRSV鑒別診斷的熒光定量PCR檢測方法。王彩霞等基于ASFV的CD2v基因序列設(shè)計對應(yīng)的引物和探針，構(gòu)建了ASFV檢測的熒光定量PCR，最低檢測限為10個拷貝。Haines F J等依據(jù)ASFV和CSFV的基因序列建立了具有較高靈敏度的雙重鑒別診斷熒光定量PCR檢測方法。由此可見，熒光定量PCR檢測法是ASFV檢測應(yīng)用最為廣泛且精準度最高的檢測技術(shù)。

3.等溫擴增技術(shù)。等溫擴增技術(shù)是一種恒溫條件下依賴于DNA酶作用的新型核酸擴增技術(shù)。常見的等溫擴增技術(shù)主要包括環(huán)介導(dǎo)等溫擴增技術(shù)（Loop-mediated isothermal amplification，LAMP）、重組聚合酶擴增技術(shù)（Recombinase protein amplification，RPA）、交叉引物擴增技術(shù)（C r o s s i n g Priming Amplification，CPA）、滾環(huán)擴增技術(shù)（R o l l i n g c i r c l e amplification，RCA）以及雜交鏈式反應(yīng)（Hybridization chain reaction，HCR）。等溫擴增技術(shù)具有簡便、快速、便攜、耗費低以及敏感度高的優(yōu)點，對儀器設(shè)備、操作人員技術(shù)、試驗條件等要求不高，且檢測結(jié)果的判斷更為直觀，更適合于現(xiàn)場快速診斷。James H E等基于ASFV的拓撲異構(gòu)酶基因Ⅱ建立了用于ASFV快速診斷的高特異性的LAMP檢測法，檢測時長為30分鐘，相對于其他檢測方法而言耗時短。王建昌等依據(jù)ASFV的VP72基因序列建立了用于ASFV快速檢測的RPA技術(shù)。Fan等基于ASFV的B646L基因序列設(shè)計特異性引物，設(shè)計了用于ASFV檢測的高特異性的重組聚合酶輔助擴增檢測法。

4.其他核酸檢測方法。除了上述三類常見基于非洲豬瘟病毒核酸的檢測方法，還有數(shù)字PCR、納米PCR、探針雜交技術(shù)、微流控芯片技術(shù)以及CRISPR/Cas系統(tǒng)等核酸檢測方法。CRISPR/Cas系統(tǒng)是一種新型的核酸檢測方法，如今已成為研究人員對于非洲豬瘟病毒檢測關(guān)注的焦點。王鑫杰等基于CRISPR/Cas系統(tǒng)，建立了ASFV的核酸快速檢測方法，并開發(fā)了相應(yīng)的Cpf1試劑盒。郭春和等基于CRISPR/Cas12a系統(tǒng)，建立了針對ASFV的精準快速檢測方法。

四、總結(jié)

近年來，非洲豬瘟給國內(nèi)外的養(yǎng)豬業(yè)構(gòu)成了巨大的威脅，造成了巨大的經(jīng)濟損失。因此，非洲豬瘟病毒快速檢測方法的建立顯得尤為重要。非洲豬瘟病毒快速檢測方法的建立，可以為ASF診斷、疫情確認與及時處置、防控以及凈化提供重要的技術(shù)手段。隨著現(xiàn)代科技的發(fā)展，特別是分子水平檢測技術(shù)的發(fā)展，在保證檢測方法的特異性、敏感性、準確性以及可靠性的前提下，ASFV的檢測將會向著集約化、工業(yè)化、自動化、高通量、高性能、低成本方向發(fā)展，檢測用儀器設(shè)備也會向著微型化、便攜化趨勢發(fā)展，向社會提供隨時隨地、精準快速的檢測技術(shù)。