羧基化多壁碳納米管分散固相萃取－三重四極桿氣質(zhì)聯(lián)用法測定茶葉中16種農(nóng)藥殘留量

林金俗，榮杰峰，張松艷，樂有東，龔慧婷，張志勇，佘紫文

1.福建八馬茶業(yè)有限公司，福建 泉州362000；2.泉州海關(guān)綜合技術(shù)服務(wù)中心，福建 泉州362000

茶葉是一種重要的飲料產(chǎn)品，目前我國是世界上最大的茶葉生產(chǎn)國和茶葉消費(fèi)國，為保障茶葉的產(chǎn)量和質(zhì)量，常規(guī)生產(chǎn)中多使用噴施農(nóng)藥的手段進(jìn)行病蟲害的防治，從而導(dǎo)致茶葉中存在農(nóng)藥殘留的可能。對農(nóng)藥制定最大殘留限量，是加強(qiáng)農(nóng)藥殘留風(fēng)險(xiǎn)管理的重要技術(shù)手段，也是世界各國的通行做法。我國最新版《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品中農(nóng)藥最大殘留限量》（GB 2763—2021）中對茶葉中農(nóng)藥的殘留限量指標(biāo)已達(dá)到106項(xiàng)，其中烯蟲乙酯、烯蟲炔酯等17種農(nóng)藥殘留尚未規(guī)定檢測方法或參考方法[1]。GB 2763—2021推薦的氣相色譜分離的檢測方法標(biāo)準(zhǔn)中，樂殺螨[2]、丙酯殺螨醇[3]、滅草環(huán)[3]、抑草蓬[3]、百菌清[4]、氯酞酸甲酯[5]指定的是參考果蔬的氣質(zhì)聯(lián)用檢測標(biāo)準(zhǔn)方法，毒蟲畏[6]、茚草酮[7]指定的是參考糧谷的氣質(zhì)聯(lián)用檢測標(biāo)準(zhǔn)方法，巴毒磷[8]采用氣相色譜法，蟲螨腈[9]采用氣質(zhì)聯(lián)用法，烯蟲乙酯、烯蟲炔酯、草枯醚、氟除草醚、格螨酯和環(huán)螨酯6種農(nóng)藥目前尚無茶葉中的檢測方法；該16種農(nóng)藥中僅百菌清和蟲螨腈為茶園登記用藥，其余14種農(nóng)藥尚未在我國取得登記，為GB 2763—2021新增農(nóng)藥品種。以上16種農(nóng)藥的方法標(biāo)準(zhǔn)和文獻(xiàn)方法相對繁雜，使用儀器設(shè)備多，不便于檢測人員的使用，目前國內(nèi)外關(guān)于茶葉中該16種農(nóng)藥的同時(shí)檢測方法尚未見報(bào)道。

與單四極桿氣質(zhì)聯(lián)用儀相比，氣相色譜－三重四極桿質(zhì)譜聯(lián)用儀（Gas chromatography-triple quadrupole mass spectrometry，GC-MS/MS）因 可獲得更豐富的離子碎片信息而擁有更高的靈敏度、更強(qiáng)的抗干擾能力和更強(qiáng)的定性能力，目前已廣泛應(yīng)用于茶葉[10-15]、糧谷[16-17]、動物源性食品[18]等基質(zhì)樣品中目標(biāo)化合物的分析檢測。

本研究選擇以上16種農(nóng)藥為研究對象，以羧基化多壁碳納米管（Carboxylated multi-walled carbon nanotubes，MWCNTs-COOH）為主要凈化材料，結(jié)合GC-MS/MS技術(shù)，建立了一種通用性強(qiáng)、選擇性好、靈敏度高的快速測定茶葉中16種農(nóng)藥殘留的GC-MS/MS方法，為相關(guān)方法的修訂完善提供有意義的借鑒。

1 材料與方法

1.1 主要儀器與試劑

Thermo 1300-TSQ9000三重四極桿氣質(zhì)聯(lián)用儀（美國賽默飛世爾科技）：配備電子轟擊源（EI）。

無水硫酸鎂（MgSO4）、氯化鈉、乙腈、丙酮和正己烷均為分析純，購于國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；乙酸乙酯（色譜純），購于美國TEDIA公司；乙二胺-N-丙基硅烷化硅膠（PSA，40～60μm）、石墨化碳黑（GCB，40～120μm）和十八烷基鍵合硅膠（C18，40～60μm）購于上海安譜試驗(yàn)科技股份有限公司，羧基化多壁碳納米管（長度10～30μm，外徑10～20 nm，內(nèi)徑5～10 nm，純度＞95%，比表面積＞200 m2/g）購于北京德科島金科技有限公司；標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)從壇墨質(zhì)檢科技股份有限公司購得[11-12]。

標(biāo)準(zhǔn)溶液：首先用乙酸乙酯配制一定濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)中間溶液，再根據(jù)需要用乙酸乙酯和空白樣品提取液稀釋得系列標(biāo)準(zhǔn)工作溶液和基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。

1.2 方法

1.2.1 樣品前處理

準(zhǔn)確稱取2 g茶葉試樣于50 mL聚丙烯離心管中，加入5 mL飽和食鹽水，渦旋混勻后靜置30 min；隨后加入10 mL乙酸乙酯，漩渦振蕩提取5 min；4 000 r/min離心3 min。準(zhǔn)確吸取0.9 mL茶葉提取液于2 mL聚丙烯離心管中，加入25 mg PSA、50 mg MWCNTs-COOH、150 mg MgSO4和0.1 mL甲苯；渦旋混合1 min，取上清液過0.22μm有機(jī)濾膜，用于測定[19-20]。

1.2.2 色譜條件

進(jìn)樣口溫度：280℃；不分流進(jìn)樣，進(jìn)樣量：1μL；恒流模式，流量為1.0 mL/min；TG-5SILMS毛細(xì)管色譜柱，規(guī)格：30 m×0.25 mm×0.25μm；柱箱升溫程序：70℃（0 min），以25℃/min升溫至240℃（0 min）；最后以10℃/min升溫至310℃（2 min）[19-20]。

1.2.3 質(zhì)譜條件

電子轟擊源：70 eV；離子源溫度：300℃；傳輸線溫度：280℃；多反應(yīng)監(jiān)測（SRM Timed）模式：16種農(nóng)藥的質(zhì)譜參數(shù)見表1。

2 結(jié)果與分析

2.1 質(zhì)譜條件優(yōu)化

在合適的質(zhì)量數(shù)范圍內(nèi)，分別對10.0 mg/L的16種農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行全掃描；選擇質(zhì)量數(shù)較大并且響應(yīng)較高的離子進(jìn)行二級碎裂，采用Auto SRM軟件對二級碎裂碰撞電壓進(jìn)行優(yōu)化。16種農(nóng)藥定量離子對、定性離子對及碰撞能量見表1。

表1 16種農(nóng)藥的保留時(shí)間、定量離子對、定性離子對和碰撞能量

2.2 前處理方法優(yōu)化

2.2.1 提取溶劑的選擇

根據(jù)待測農(nóng)藥的極性和溶解程度，試驗(yàn)選擇乙腈、正己烷-丙酮（7∶3）和乙酸乙酯為提取溶劑，將添加有20μg/kg 16種農(nóng)藥的全發(fā)酵（紅茶）、半發(fā)酵（烏龍茶）、不發(fā)酵（綠茶）茶按照“1.2.1”進(jìn)行提取凈化后上機(jī)檢測，使用乙腈提取時(shí)進(jìn)行溶劑置換后上機(jī)，用溶劑標(biāo)準(zhǔn)工作曲線進(jìn)行校正，每種樣品平行處理3次。3種提取溶劑對16種農(nóng)藥均可獲得80%以上的回收率，但采用乙腈為提取溶劑時(shí)需要進(jìn)行溶劑置換，氮吹等過程可能導(dǎo)致目標(biāo)物質(zhì)的損失且過程繁雜；使用正己烷-丙酮（7∶3）提取時(shí)提取液的顏色較深，提取的色素等共提取雜質(zhì)較多將不利于后續(xù)凈化，所以，為獲得更好的方法準(zhǔn)確性，同時(shí)考慮操作更加便捷，最終選擇乙酸乙酯作為提取溶劑。圖1為不同茶類在乙酸乙酯為提取溶劑時(shí)16種農(nóng)藥殘留的提取回收率，不同茶類樣品中16種農(nóng)藥均獲得90%以上提取回收率，其中巴毒磷、抑草蓬及樂茶螨的回收率較高，超過200%。

圖1 乙酸乙酯為提取溶劑時(shí)不同茶類中16種農(nóng)藥的提取回收率

2.2.2 甲苯用量的選擇

試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，具有平面結(jié)構(gòu)的百菌清容易被MWCNTs-COOH吸附，為了獲得準(zhǔn)確的檢測結(jié)果，在凈化前向提取溶液中加入一定量的甲苯再進(jìn)行凈化[11-12]，被吸附的百菌清可以解析出來，而其他農(nóng)藥受影響的程度較小?？疾炝思妆接昧浚?.02 mL、0.05 mL、0.10 mL、0.20 mL、0.30 mL）對百菌清凈化回收率的影響。結(jié)果顯示，隨著甲苯用量的增加，百菌清的凈化回收率呈增大趨勢，當(dāng)加入量為0.10 mL時(shí)，百菌清的凈化回收率即可恢復(fù)至100%左右，繼續(xù)增大甲苯用量，凈化回收率變化不明顯，但方法的檢測限將受到影響，所以最終選擇甲苯用量為0.10 mL。

2.2.3 吸附劑種類的選擇

試驗(yàn)考察了50 mg PSA、C18、GCB、MWCNTs-COOH等4種凈化吸附劑對烏龍茶提取液中色素的去除效果。結(jié)果顯示，PSA和C18對色素的吸附能力較差，凈化后溶液顏色變化較小仍呈墨綠色，經(jīng)GCB吸附劑凈化后呈黃綠色，經(jīng)MWCNTs-COOH凈化后烏龍茶提取液呈淺黃綠色。試驗(yàn)結(jié)果表明MWCNTs-COOH對色素的凈化效果最好；PSA對色素的去除能力較弱，但能有效去除茶多酚、兒茶素類和糖類物質(zhì)。茶葉基質(zhì)比較復(fù)雜，不同類別（全發(fā)酵、半發(fā)酵和不發(fā)酵）的茶類基質(zhì)區(qū)別較大，所以使用分散固相萃取凈化時(shí)需要考慮兩種或多種吸附凈化劑，以更有效除去提取液中的色素、茶多酚、兒茶素和糖類等雜質(zhì)成分，因此，本研究選擇MWCNTs-COOH和PSA為凈化吸附劑。

2.2.4 吸附劑用量的選擇

為獲得較好的樣品凈化效果，以目標(biāo)物回收率為考察依據(jù)對吸附劑用量進(jìn)行考察。以加標(biāo)水平20μg/kg的烏龍茶為基質(zhì)，按“1.2.1”方法前處理，比較了不同吸附劑組合的凈化效果及其對目標(biāo)物回收率的影響，吸附劑組合加入MgSO4除水。圖2為不同吸附劑組合凈化后16種農(nóng)藥的回收率情況。結(jié)果顯示，PSA凈化后目標(biāo)物回收率變化較?。浑SMWCNTs-COOH的加入，大部分目標(biāo)物回收率呈一定的下降趨勢；其中巴毒磷、抑草蓬和樂殺螨的回收率在MWCNTs-COOH的凈化作用下有較大程度的下降；但在MWCNTs-COOH的用量達(dá)到20 mg以上后，隨著MWCNTs-COOH用量繼續(xù)加大回收率變化變緩，部分農(nóng)藥回收率仍然較高，說明基質(zhì)效應(yīng)仍然明顯。當(dāng)MWCNTs-COOH用量為50 mg時(shí)，烏龍茶提取液顏色為淺黃綠色，紅茶和綠茶的提取液接近無色，最終結(jié)合色素清除效果、回收率和經(jīng)濟(jì)效應(yīng)，選擇25 mg PSA+50 mg MWCNTs-COOH+150 mg MgSO4為本方法的吸附劑組合用量。

圖2 不同吸附劑組合對加標(biāo)空白樣品提取回收率的影響

2.3 基質(zhì)效應(yīng)

基質(zhì)效應(yīng)（ME）在氣相系統(tǒng)中主要表現(xiàn)為“基質(zhì)誘導(dǎo)色譜響應(yīng)增強(qiáng)現(xiàn)象”，即基質(zhì)增強(qiáng)效應(yīng)；通過合適的凈化方法和優(yōu)化進(jìn)樣方式等手段可以減小氣相系統(tǒng)在檢測過程中出現(xiàn)的基質(zhì)效應(yīng),但無法將其徹底消除[21-22]。本研究采用公式：基質(zhì)效應(yīng)（ME）=[（基質(zhì)匹配校準(zhǔn)曲線斜率／純?nèi)軇?biāo)準(zhǔn)曲線率）－1]×100%對基質(zhì)效應(yīng)進(jìn)行評估，中等程度以上的基質(zhì)效應(yīng)須采取措施補(bǔ)償[23]。16種農(nóng)藥在紅茶、綠茶和烏龍茶中的基質(zhì)效應(yīng)如圖3所示，結(jié)果表明，百菌清、氯酞酸甲酯、格螨酯、環(huán)螨酯、烯蟲乙酯和丙酯殺螨醇在3種茶葉中為弱基質(zhì)效應(yīng)；其余10種農(nóng)藥在3種基質(zhì)中基質(zhì)效應(yīng)為中等程度以上，特別是巴毒磷、抑草蓬、樂殺螨3種茶葉的基質(zhì)效應(yīng)較強(qiáng)，因通過凈化的手段無法完全克服所有基質(zhì)的基質(zhì)效應(yīng)，為了提高檢測方法的準(zhǔn)確性，本研究采用基質(zhì)匹配校準(zhǔn)的方法進(jìn)行基質(zhì)效應(yīng)的補(bǔ)償。

圖3 16種農(nóng)藥在不同茶葉基質(zhì)中的基質(zhì)效應(yīng)

2.4 方法學(xué)評價(jià)

2.4.1 線性范圍、相關(guān)系數(shù)和方法檢測限

按照研究建立的方法處理得空白基質(zhì)溶液，配制基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，按“1.2”的色譜質(zhì)譜條件進(jìn)行檢測，得到線性方程和相關(guān)系數(shù)，以S/N=10確定方法定量限（LOQ），相關(guān)數(shù)據(jù)見表2（線性方程為烏龍茶基質(zhì)中獲得）。結(jié)果顯示，16種農(nóng)藥的基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)工作液在各自范圍內(nèi)均呈良好的線性關(guān)系，方法定量限為0.5～10.0μg/kg，16種化合物的定量限均小于等于GB 2763—2021中限量要求。

表2 16種農(nóng)藥的回歸方程、相關(guān)系數(shù)、線性范圍和定量限

2.4.2 回收率和精密度

分別對紅茶、綠茶和烏龍茶空白樣品進(jìn)行了不同濃度的加標(biāo)回收試驗(yàn)，樣品添加混合標(biāo)準(zhǔn)溶液后，振蕩混勻并靜置1 h，以便添加的農(nóng)藥能被樣品充分吸收，按照“1.2”方法進(jìn)行前處理和儀器測定，平行處理6次。16種農(nóng)藥在不同茶葉基質(zhì)中的添加濃度及平均回收率見表3，紅茶、綠茶及烏龍茶空白樣品在4個水平加標(biāo)回收試驗(yàn)中的平均回收率為71.2%～128.2%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（n=6）為2.3%～9.2%。

表3 不同茶葉中16種農(nóng)藥4個水平添加量的平均加標(biāo)回收率和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(n=6)

2.4.3 實(shí)際樣品檢測

用本方法對福建省泉州市范圍內(nèi)采集的50份樣品（其中紅茶10份、綠茶10份、烏龍茶30份）進(jìn)行檢測，其中蟲螨腈檢出5項(xiàng)次，檢測值為0.15～0.58 mg/kg；百菌清檢出3項(xiàng)次，檢測值0.04 5～0.13 mg/kg。檢測值均遠(yuǎn)低于GB 2763—2021限量要求，說明茶葉質(zhì)量安全整體情況相對良好。

3 小結(jié)與討論

本研究建立了茶葉中16種農(nóng)藥殘留量的快速檢測分析方法，茶葉樣品經(jīng)乙酸乙酯提取，提取液用MWCNTs-COOH和PSA凈化，經(jīng)三重四極桿氣質(zhì)聯(lián)用儀測定，基質(zhì)匹配外標(biāo)法定量。建立的方法簡單、快速、靈敏度高、準(zhǔn)確度好，能滿足茶葉中相關(guān)農(nóng)藥殘留的檢測要求。