粘度刺激響應(yīng)的熒光探針研究進(jìn)展

王孔琛， 馮楊振， 陳杜剛

(武漢工程大學(xué)，化工與制藥學(xué)院，湖北武漢 430205)

1 引言

細(xì)胞微環(huán)境與細(xì)胞的新陳代謝，增殖分化等密不可分，是反映細(xì)胞生理活動(dòng)是否正常進(jìn)行的重要因素[1,2]。粘度作為細(xì)胞微環(huán)境的重要指標(biāo)之一，影響著細(xì)胞內(nèi)分子擴(kuò)散、信號(hào)傳遞以及化學(xué)物質(zhì)的運(yùn)輸。粘度的異常變化常預(yù)示著細(xì)胞的功能發(fā)生障礙，從而誘發(fā)一系列疾病。同時(shí)，由于細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞器的作用不一，細(xì)胞內(nèi)各區(qū)域的粘度也不盡相同。線粒體作為細(xì)胞內(nèi)部的“動(dòng)力車間”，除了給細(xì)胞供能以外，還參與諸如細(xì)胞分化、細(xì)胞信息傳遞和細(xì)胞凋亡等過(guò)程，并具有調(diào)控細(xì)胞生長(zhǎng)和細(xì)胞周期的功能[3]。研究表明，粘度的異常變化可能導(dǎo)致線粒體功能失調(diào)，并導(dǎo)致一系列癥狀，例如動(dòng)脈硬化、癌癥和心機(jī)能不全[4 - 6]。溶酶體是細(xì)胞內(nèi)部的“消化車間”，其作為一種動(dòng)態(tài)的細(xì)胞器，參與老化細(xì)胞器的清除、殺死病毒和病變以及細(xì)胞內(nèi)信號(hào)的傳遞等等生理活動(dòng)，對(duì)維持細(xì)胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)有重大意義[7]。溶酶體粘度的異?？赡軐?dǎo)致細(xì)胞微環(huán)境紊亂，從而影響生物正常生理活動(dòng)，引起炎癥甚至癌癥等疾病。因此，精確監(jiān)測(cè)細(xì)胞內(nèi)不同部位的粘度變化，以揭示粘度與疾病的病理過(guò)程之間的微觀機(jī)理，對(duì)于疾病的探索極其重要。

傳統(tǒng)的粘度檢測(cè)工具包括落球粘度計(jì)、振動(dòng)式粘度計(jì)、旋轉(zhuǎn)式粘度計(jì)和毛細(xì)管粘度計(jì)，但是這些工具只能用于宏觀粘度的檢測(cè)，而不適用于微觀環(huán)境。近年來(lái)，熒光成像因具有靈敏度高、侵入性小，時(shí)間分辨率好等優(yōu)點(diǎn)而被研究者們廣泛關(guān)注，并大量用于細(xì)胞內(nèi)活性分子的檢測(cè)、活體成像和成像引導(dǎo)的光療等領(lǐng)域。根據(jù)現(xiàn)有研究，開(kāi)發(fā)對(duì)細(xì)胞內(nèi)粘度有特異性響應(yīng)能力的熒光探針，通過(guò)熒光成像的方式實(shí)時(shí)反映并跟蹤粘度的變化，是監(jiān)測(cè)細(xì)胞內(nèi)粘度變化的有效手段。本文將從熒光探針的設(shè)計(jì)結(jié)構(gòu)和機(jī)理出發(fā)，主要介紹近5年來(lái)報(bào)道的部分靶向不同細(xì)胞器的粘度熒光探針，并探討結(jié)構(gòu)-性能關(guān)系和生物成像應(yīng)用。最后就該領(lǐng)域的現(xiàn)狀做出總結(jié)并對(duì)未來(lái)的發(fā)展提出展望，希望對(duì)開(kāi)發(fā)性能更好的熒光探針用于細(xì)胞微環(huán)境粘度的探測(cè)提供參考。

2 粘度熒光探針簡(jiǎn)介

2.1 粘度熒光探針的結(jié)構(gòu)

常見(jiàn)的熒光團(tuán)如香豆素類、萘酰亞胺類、羅丹明類、BODIPY類、花菁類、黃酮類和喹啉類等，它們具有諸多優(yōu)異的光學(xué)性質(zhì)，如光譜半峰寬較窄、摩爾消光系數(shù)大和熒光效率高，因而常被用來(lái)構(gòu)建粘度刺激響應(yīng)的熒光探針。這些染料分子大多是平面共軛性好的親脂性基團(tuán)，由其所構(gòu)建的熒光探針具有良好的脂溶性。為了提高探針的親水性，并賦予探針特定的細(xì)胞內(nèi)靶向功能，通常在熒光染料上引入吡啶/三苯基膦陽(yáng)離子或嗎啉基團(tuán)等，可使探針?lè)謩e定位到線粒體和溶酶體，并提高探針的生物相容性。

2.2 粘度熒光探針的識(shí)別機(jī)理

2.2.1 扭轉(zhuǎn)的分子內(nèi)電荷轉(zhuǎn)移(TICT)從分子結(jié)構(gòu)來(lái)講，大多粘度響應(yīng)的熒光探針都是電子給體-共軛π橋-電子受體(D-π-A)型。當(dāng)分子中的D和A非常強(qiáng)，且分子有一定的柔性時(shí)，在激發(fā)態(tài)下，分子內(nèi)旋轉(zhuǎn)導(dǎo)致D和A處在正交的構(gòu)象上，從而發(fā)生扭曲的分子內(nèi)電荷轉(zhuǎn)移(TICT)作用，使得探針的熒光猝滅。而當(dāng)細(xì)胞環(huán)境發(fā)生變化，如粘度升高時(shí)，分子內(nèi)的運(yùn)動(dòng)會(huì)受到限制，從而抑制TICT，恢復(fù)探針的發(fā)光。由于粘度變化的幅度不同，熒光恢復(fù)的程度不一，據(jù)此實(shí)現(xiàn)對(duì)粘度的特異性識(shí)別。

2.2.2 聚集誘導(dǎo)發(fā)光(AIE)與傳統(tǒng)熒光染料不同，AIE分子在單分散態(tài)下不發(fā)光，而在聚集態(tài)下顯現(xiàn)出強(qiáng)熒光。這種獨(dú)特的發(fā)光模式使得該類型分子在聚集態(tài)下具有高的熒光亮度和優(yōu)異的光穩(wěn)定性，非常有利于其在生物環(huán)境的應(yīng)用。在低粘性介質(zhì)中，AIE分子內(nèi)基團(tuán)的自由運(yùn)動(dòng)耗散了激發(fā)態(tài)的能量，使得分子不發(fā)光；而當(dāng)粘度升高時(shí)，分子內(nèi)的運(yùn)動(dòng)受限，從而開(kāi)啟熒光，因此可實(shí)現(xiàn)對(duì)粘度的檢測(cè)。

2.2.3 光致電子轉(zhuǎn)移(PET)該種類型的熒光探針一般由熒光染料和受體部分組成，在光激發(fā)下，熒光染料和受體之間會(huì)發(fā)生電子轉(zhuǎn)移作用，從而導(dǎo)致熒光發(fā)生猝滅。當(dāng)熒光探針與目標(biāo)分析物作用后，受體部分被破壞或者從分子中裂解，則可恢復(fù)熒光染料的熒光。當(dāng)所選的熒光染料本身對(duì)粘度有靈敏的響應(yīng)時(shí)，依據(jù)此機(jī)理可設(shè)計(jì)同時(shí)檢測(cè)粘度和其它分析物的多功能熒光探針。

3 粘度熒光探針的應(yīng)用

3.1 檢測(cè)細(xì)胞質(zhì)內(nèi)粘度的熒光探針

香豆素類染料具有Stokes位移大、光穩(wěn)定性好、生物相容性好等優(yōu)點(diǎn)。2020年，本課題組將茚二酮與二乙胺香豆素基團(tuán)共軛連接合成了近紅外熒光探針ACI[8]。在低粘度環(huán)境下，茚二酮與二乙胺香豆素之間單鍵的自由旋轉(zhuǎn)引起TICT現(xiàn)象，導(dǎo)致熒光猝滅(圖1)；而隨著環(huán)境粘度的增加，單鍵的旋轉(zhuǎn)受到抑制，從而使得分子的熒光增強(qiáng)。我們通過(guò)探針ACI檢測(cè)了經(jīng)制霉菌素干預(yù)的HeLa細(xì)胞環(huán)境的粘度變化。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，ACI的光穩(wěn)定性和生物相容性好，同時(shí)具有長(zhǎng)的激發(fā)波長(zhǎng)和發(fā)射波長(zhǎng)，在活體成像中應(yīng)用時(shí)有望表現(xiàn)出高的信噪比。2017年，孟祥明課題組設(shè)計(jì)合成了以喹啉為骨架的雙光子熒光探針MCN(圖1)[9]。該探針在470 nm處熒光強(qiáng)度隨著粘度的增大而增強(qiáng)90倍，且不受pH、極性的影響。該課題組通過(guò)MCN監(jiān)測(cè)了經(jīng)依托泊苷誘導(dǎo)的HeLa細(xì)胞凋亡期間的粘度變化，并通過(guò)熒光壽命成像觀察了大鼠組織切片以及斑馬魚(yú)的粘度分布情況。

圖1 探針ACI和MCN的結(jié)構(gòu)[8,9]Fig.1 Structure of probes of ACI and MCN[8,9]

3.2 檢測(cè)線粒體內(nèi)粘度的熒光探針

線粒體基質(zhì)中存在大量的酶和蛋白質(zhì)。當(dāng)環(huán)境粘度異常變化時(shí)，線粒體嵴將會(huì)發(fā)生堆積[10]，影響酶和蛋白質(zhì)擴(kuò)散的速率，最終導(dǎo)致神經(jīng)退行性疾病、糖尿病和細(xì)胞惡性腫瘤等多種癥狀的發(fā)生[11 - 14]。因此，對(duì)線粒體內(nèi)的粘度進(jìn)行監(jiān)測(cè)意義重大。

菁類染料一般具有長(zhǎng)發(fā)射波長(zhǎng)，且分子中有陽(yáng)離子基團(tuán)如吲哚鹽，能有效地定位在線粒體，常被選用來(lái)構(gòu)建靶向線粒體的熒光探針。2019年，王慧課題設(shè)計(jì)合成了基于半花菁染料的水溶性熒光探針L(圖2)[15]，分子中引入二乙酸酯基團(tuán)以提高生物相容性，并可以通過(guò)對(duì)該部分的細(xì)微調(diào)節(jié)使得發(fā)射光譜紅移。隨著溶液粘度的增加，L在590 nm處熒光強(qiáng)度增大23倍，同時(shí)熒光量子產(chǎn)率增大20倍。課題組通過(guò)L成功觀察了老鼠組織切片的粘度分布情況。2020年，葛健鋒課題組基于半花菁染料設(shè)計(jì)合成了三個(gè)定位線粒體的粘度探針1d-1f(圖2)[16]。相比于探針L，1d-1f的發(fā)射波長(zhǎng)紅移至近紅外區(qū)間(652～690 nm)，在生物領(lǐng)域應(yīng)用時(shí)具有光損傷小，背景干擾小的優(yōu)點(diǎn)。

圖2 探針L、1d-1f、MitoSN和L1-L3的結(jié)構(gòu)[15 - 18]Fig.2 Structure of probes of L,1d-1f,MitoSN and L1-L3[15 - 18]

除了吲哚陽(yáng)離子之外，其它含陽(yáng)離子的結(jié)構(gòu)也能靶向線粒體。2018年，王慧課題組報(bào)道了以噻唑陽(yáng)離子作為線粒體定位基團(tuán)的粘度熒光探針MitoSN(圖2)[17]。該探針已成功應(yīng)用于觀察活體斑馬魚(yú)幼蟲(chóng)的微粘度。2019年該課題組又制備了一系列以喹啉陽(yáng)離子為受體的熒光探針L1-L3(圖2)[18]。與MitoSN相比，L2、L3對(duì)粘度表現(xiàn)出了更高的敏感性，其中，L2在576 nm處熒光強(qiáng)度隨著粘度增強(qiáng)180倍，熒光量子產(chǎn)率增大280倍。L1-L3已經(jīng)成功用于監(jiān)測(cè)經(jīng)藥物刺激后HeLa細(xì)胞中粘度的變化。

2019年，劉志洪課題組設(shè)計(jì)合成了近紅外熒光探針NI-VIS(圖3a)[19]。NI-VIS對(duì)粘度具有很高的靈敏度，隨著體系環(huán)境由水變?yōu)?9%甘油，其熒光強(qiáng)度增大167倍。該探針已成功用于區(qū)分肝硬化組織與正常組織。2021年，唐波課題組基于吡啶陽(yáng)離子構(gòu)建了線粒體靶向熒光探針Mito-NV(圖3a)[20]。該課題組以Mito-NV為工具發(fā)現(xiàn)環(huán)境中存在過(guò)量的H2O2會(huì)使得粘度上升，而過(guò)量的陽(yáng)離子如Pd2+，Cu2+會(huì)使得粘度下降。

圖3 (a)探針NI-VIS、Mito-NV、HOTPy和CS-Py-BC的結(jié)構(gòu)[19-22]；(b)由左至右：HOTPy在對(duì)照組小鼠、經(jīng)酒精干預(yù)后1天、2天、3天的小鼠體內(nèi)生物成像[21]Fig.3 (a) Structure of probes of NI-VIS,Mito-NV,HOTPy and CS-Py-BC[19-22];(b) From left to right:In vivo imaging of mice in control group and mice with alcohol treatment in 1,2 and 3 days with HOTPy as the fluorescent probe[21]

上述的探針多數(shù)都是基于TICT機(jī)理構(gòu)建的，但該類探針容易受到環(huán)境極性的影響，或是環(huán)境中存在的親電物質(zhì)可能會(huì)破壞探針D-A結(jié)構(gòu)導(dǎo)致探針功能失效。近些年來(lái)聚集誘導(dǎo)發(fā)射(AIE)由于其具有較大的Stokes位移，優(yōu)異的光穩(wěn)定性而逐步進(jìn)入了研究人員的視野。2021年，本課題組基于熒光團(tuán)四苯乙烯設(shè)計(jì)合成了AIE粘度探針HOTPy(圖3a)[21]。通過(guò)結(jié)構(gòu)篩選發(fā)現(xiàn)，分子中引入助水溶性基團(tuán)羥基，能有效提高HOTPy對(duì)粘度的選擇性。隨著環(huán)境粘度的增大，探針在611 nm處的熒光強(qiáng)度增大128倍。該探針已經(jīng)成功用于急性酒精肝損傷小鼠模型的成像，以及經(jīng)SILY治療后，該病癥變化的即時(shí)示蹤(圖3b)。

為了增加探針在線粒體內(nèi)的滯留能力，2021年，董川課題組在分子內(nèi)引入芐基氯亞基制備了探針CS-Py-BC(圖3a)[22]，使得當(dāng)膜電位降低或消失時(shí)探針也不會(huì)失去對(duì)線粒體的靶向性，從而有效提高了檢測(cè)的準(zhǔn)確度。經(jīng)470 nm波長(zhǎng)激發(fā)，CS-Py-BC在650 nm處的熒光強(qiáng)度隨粘度增大了92倍。

3.3 檢測(cè)溶酶體內(nèi)粘度的熒光探針

溶酶體內(nèi)含有豐富的水解酶，主要用于分解和代謝細(xì)胞內(nèi)的蛋白和大分子。當(dāng)外界物種進(jìn)入溶酶體后，溶酶體內(nèi)的水解酶會(huì)發(fā)揮作用將外來(lái)物種分解為細(xì)胞所需的物質(zhì)。溶酶體內(nèi)水解酶缺失或其功能發(fā)生異常變化時(shí)將會(huì)引起大量底物在溶酶體體內(nèi)堆積，使得溶酶體內(nèi)部粘度發(fā)生變化，最終導(dǎo)致各種疾病的發(fā)生，例如溶酶體貯積病、龐貝氏病、粘多糖疾病等。因此，對(duì)溶酶體粘度的變化進(jìn)行檢測(cè)同樣具有重要的意義。

溶酶體是細(xì)胞微環(huán)境中酸度最高的細(xì)胞器，有與堿性物質(zhì)結(jié)合的傾向，故常選用含有氨基的堿性嗎啉作為溶酶體的靶向基團(tuán)。2018年，黃楚森課題設(shè)計(jì)合成了一個(gè)基于綠色熒光蛋白GFP的粘度探針Lys-V(圖4)[23]。該探針引入了對(duì)羥基苯甲醛以增大體系的共軛程度。研究發(fā)現(xiàn)該探針在515 nm處熒光強(qiáng)度與粘度之間存在良好的線性關(guān)系。并已經(jīng)成功檢測(cè)了經(jīng)地塞米松刺激后MCF-7細(xì)胞中溶酶體粘度變化。

圖4 探針Lys-V、Lys-CzFP和Lyso-NP的結(jié)構(gòu)[23 - 25]Fig.4 Structure of probes of Lys-V,Lys-CzFP,and Lyso-NP[23 - 25]

2020年，錢鷹課題組報(bào)道了選用咔唑基團(tuán)為單元合成的GFP粘度熒光探針Lys-CzFP(圖4)[24]。該探針具有較長(zhǎng)的發(fā)射波長(zhǎng)(560 nm)與較大的Stokes位移(78 nm)，同時(shí)具有優(yōu)異的粘度響應(yīng)能力。探針Lys-CzFP在560 nm處熒光強(qiáng)度隨著粘度增加了98倍，熒光量子產(chǎn)率從0.003增至0.253，熒光壽命由0.25 ns延長(zhǎng)至1.12 ns。Lys-CzFP已成功用于檢測(cè)經(jīng)地塞米松刺激后Bel-7402細(xì)胞內(nèi)溶酶體粘度的變化。

上述探針雖然有著優(yōu)異的光穩(wěn)定性與較好的粘度響應(yīng)，但是仍然存在著諸如激發(fā)和發(fā)射波長(zhǎng)較短，穿透能力不夠，且易受到自熒光影響等問(wèn)題。雙光子熒光成像因激發(fā)波長(zhǎng)更長(zhǎng)，能夠避免自熒光的干擾，同時(shí)具有更深的穿透效果，有望解決上述問(wèn)題。2020年，孟祥明課題組以苯乙炔取代的萘胺基為TP熒光團(tuán)合成了雙光子探針Lyso-NP(圖4)[25]。該探針在515 nm處的熒光強(qiáng)度與粘度之間有著良好的線性關(guān)系，且在860 nm處的雙光子吸收截面值隨著粘度的增加而增大。此外，探針的熒光壽命不隨pH而變化，可以通過(guò)熒光壽命成像來(lái)對(duì)環(huán)境的粘度進(jìn)行檢測(cè)。

BODIPY類染料一般能系較低，很容易表現(xiàn)出長(zhǎng)波長(zhǎng)的信號(hào)。2018年，余孝其課題組基于BODIPY結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)合成了雙光子熒光探針Lyso-B(圖5)[26]。該探針在環(huán)境pH<5時(shí)才會(huì)對(duì)粘度產(chǎn)生響應(yīng)。在pH較高時(shí)，嗎啉基團(tuán)因PET的機(jī)理猝滅了探針本身的熒光，而pH降低時(shí)，嗎啉基團(tuán)被質(zhì)子化，PET過(guò)程消失，探針的熒光開(kāi)啟。經(jīng)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，pH=2時(shí)，探針在甘油中的熒光強(qiáng)度比在水中高63倍，而比在pH=7.4的水高15 600倍。目前，Lyso-B已成功用于HeLa細(xì)胞中溶酶體的粘度檢測(cè)，Lyso-NP已經(jīng)成功用于MCF-7細(xì)胞內(nèi)溶酶體自噬過(guò)程的粘度檢測(cè)。

除了嗎啉基團(tuán)之外，一些科研工作者還嘗試通過(guò)其它的基團(tuán)來(lái)構(gòu)造靶向溶酶體的熒光探針。2019年，郭煒課題組基于羅丹明染料設(shè)計(jì)合成了近紅外熒光探針BTP(圖5)[27]。隨著粘度的增加，苯并噻唑與吡羅紅之間的碳碳單鍵的旋轉(zhuǎn)被抑制，BTP在635 nm處的熒光強(qiáng)度增大83倍。此外，BTP能在較寬的pH范圍(pH=2～10)內(nèi)對(duì)粘度響應(yīng)，具有優(yōu)異的穩(wěn)定性。2020年，曾憲順課題組開(kāi)發(fā)了半花菁近紅外熒光探針Lyso-cy(圖5)[28]。該探針通過(guò)苯基硒定位溶酶體，并具有更高、更快速的粘度響應(yīng)，在710 nm處的熒光強(qiáng)度隨著粘度的增加而增大122倍。在不同pH中，Lyso-cy的結(jié)構(gòu)存在酚式、旋酮式、酮式之間轉(zhuǎn)換，因此發(fā)射波長(zhǎng)會(huì)隨著pH而變化。目前該探針已經(jīng)成功監(jiān)測(cè)經(jīng)地塞米松刺激的HeLa細(xì)胞中溶酶體的粘度變化。

2020年，蔣健暉課題組設(shè)計(jì)合成了一個(gè)靶向溶酶體的探針Lyso-VR1(圖5)[29]。隨著環(huán)境粘度增加，Lyso-VR1在550 nm處熒光強(qiáng)度增大83倍。此外，該探針不受極性影響，能在pH=4～7.3的范圍內(nèi)使用。值得一提的是，課題組通過(guò)Lyso-VR1與其同期研發(fā)的Mito-VR2首次實(shí)現(xiàn)了自噬過(guò)程中線粒體和溶酶體粘度變化的同時(shí)監(jiān)測(cè)，發(fā)現(xiàn)此過(guò)程中兩者內(nèi)部粘度都增加。

圖5 探針Lys-B、BTP、Lyso-cy和Lyso-VR1的結(jié)構(gòu)[26 - 29]Fig.5 Structure of probes of Lys-B,BTP,Lyso-cy and Lyso-VR1[26 - 29]

4 多功能的熒光粘度探針

許多疾病導(dǎo)致的細(xì)胞微環(huán)境的變化不僅僅與粘度相關(guān)，還可能與許多化學(xué)物質(zhì)水平的變化相聯(lián)系，能夠?qū)崿F(xiàn)對(duì)這些化學(xué)物質(zhì)含量的檢測(cè)對(duì)疾病的預(yù)防與臨床治療具有重大意義。因此除了上述能夠單獨(dú)靶向線粒體或者溶酶體的探針，科研工作者還設(shè)計(jì)合成了許多多功能型的水溶性粘度探針。

2020年，馮國(guó)強(qiáng)課題組基于喹啉設(shè)計(jì)合成了粘度與ONOO-雙重響應(yīng)的近紅外熒光探針VO[30]。該探針的粘度響應(yīng)基于TICT機(jī)理，并引入了苯硼酸作為ONOO-的識(shí)別基團(tuán)(圖6a)。隨著環(huán)境粘度的增大，770 nm處的熒光強(qiáng)度增大36倍；當(dāng)ONOO-加入后，探針顏色由藍(lán)色轉(zhuǎn)變?yōu)辄S色，635 nm處熒光強(qiáng)度增大288倍，且在5 min內(nèi)達(dá)到最大值。VO不受其它活性氧或活性氮等的干擾，能在pH=6～11的范圍內(nèi)使用。同時(shí)，VO還可以檢測(cè)內(nèi)源性與外源性的ONOO-，目前已經(jīng)在斑馬魚(yú)和小鼠體內(nèi)成功應(yīng)用。課題組通過(guò)VO進(jìn)行生物實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)過(guò)量的對(duì)乙酰氨基酚(APAP)會(huì)引起ONOO-含量增多，導(dǎo)致藥物誘導(dǎo)的肝毒性增加(圖6b)。

圖6 (a)探針VO和A-1的結(jié)構(gòu)[30-31]；(b)探針VO在小鼠肝組織上的成像[30]Fig.6 (a)Structure of probes of VO and A-1[30-31];(b) Imaging of the mouse livers with VO[30]

2021年，Lee課題組設(shè)計(jì)合成了粘度與NO雙重檢測(cè)的探針A-1[31]。該探針中萘酰亞胺及其連接部分能夠?qū)φ扯犬a(chǎn)生響應(yīng)，而(4-硝基苯)氨基硫脲部分則對(duì)NO產(chǎn)生響應(yīng)(圖6a)。探針A-1在470 nm處與550 nm處的熒光強(qiáng)度分別隨著粘度的升高、NO含量的增加而增強(qiáng)。該探針對(duì)粘度的響應(yīng)熒光為藍(lán)光，對(duì)NO的響應(yīng)熒光為綠光，因此實(shí)現(xiàn)了對(duì)粘度與NO的同時(shí)檢測(cè)。探針A-1不受諸如Cu2+、Mg2+等陽(yáng)離子，CN-、S2-等陰離子以及ONOO-、OH-等活性氧物質(zhì)的影響，能在pH=5～9范圍內(nèi)使用。此外，探針A-1可以檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)外源性/內(nèi)源性的NO，且課題組通過(guò)將A-1應(yīng)用于HeLa細(xì)胞中成功觀察到了制霉菌素刺激后粘度的升高、LPS刺激后NO水平的升高以及再經(jīng)過(guò)NO合成酶抑制劑氨基胍干預(yù)后NO水平的下降。

除了活性氧之外，對(duì)于細(xì)胞微環(huán)境內(nèi)含硫物質(zhì)的含量監(jiān)測(cè)也同樣十分重要。2020年，孔凡鵬課題組在已經(jīng)合成的近紅外粘度探針DCMN的基礎(chǔ)上進(jìn)一步對(duì)其羥基位點(diǎn)進(jìn)行修飾，連接了H2S靶向基團(tuán)2,4-二硝基苯磺酸酯，構(gòu)建了一種H2S和粘度雙激活的熒光探針DCO-V-H2S(圖7)[32]。該探針中，2,4-二硝基苯磺酸酯通過(guò)PET作用猝滅探針本身的熒光；盡管在高粘度甘油中探針的熒光信號(hào)有一定的增強(qiáng)，但并不明顯。而當(dāng)在甘油環(huán)境中加入H2S時(shí)，2,4-二硝基苯磺酸酯基團(tuán)發(fā)生斷裂，探針的熒光則顯著增強(qiáng)，因此該探針只有在硫化氫和高粘度條件同時(shí)滿足時(shí)才能被激活，發(fā)出近紅外熒光。在cH2S=20 μmol/L時(shí)，探針630 nm處的熒光強(qiáng)度隨著PBS-甘油體系中甘油的比例增大而增強(qiáng)90倍；在高粘度的環(huán)境中，對(duì)H2S的響應(yīng)限度高達(dá)40 μmol/L。此外，DCO-V-H2S還具有優(yōu)異的穩(wěn)定性，選擇性，良好的生物相容性，目前課題組已經(jīng)通過(guò)DCO-V-H2S成功實(shí)現(xiàn)了對(duì)HeLa細(xì)胞經(jīng)饑餓誘導(dǎo)與硫氫化鈉干預(yù)后粘度、H2S的雙重成像。

圖7 探針DCO-V-H2S、P-Py、Lyso-MC和B-1的結(jié)構(gòu)[32-35]Fig.7 Structure of probes of DCO-V-H2S,P-Py,Lyso-MC and B-1[32-35]

2019年，張雷課題組基于半花菁染料MC-1設(shè)計(jì)合成了對(duì)粘度與β-淀粉樣蛋白都能響應(yīng)的探針Lyso-MC(圖7)[34]，分子中引入了嗎啉基團(tuán)使其具有溶酶體的靶向能力。Lyso-MC在615 nm處熒光強(qiáng)度隨著粘度的增大而增強(qiáng)33倍，且不受pH、極性等條件的影響；當(dāng)Aβ1～42聚集體濃度上升至0.25 μmol/L時(shí)，探針在610 nm處熒光強(qiáng)度增強(qiáng)了10倍，且粘度的對(duì)數(shù)值、Aβ1～42聚集體濃度都與熒光強(qiáng)度線性相關(guān)。目前課題組已經(jīng)成功將該探針用于PC12、SH-SY5Y細(xì)胞中粘度與Aβ聚集體濃度的監(jiān)測(cè)。

2021年，李朝輝課題組設(shè)計(jì)合成了pH與粘度同時(shí)激活的探針B-1(圖7)[35]。該探針原結(jié)構(gòu)中的亞氨基部分帶有一定的堿性，因此能夠靶向識(shí)別溶酶體。在酸性的環(huán)境下亞氨基被質(zhì)子化成為氨基，此時(shí)其與吡咯紅之間的連接鍵可以自由旋轉(zhuǎn)，探針仍只表現(xiàn)出微弱的熒光，而在高粘度的環(huán)境中，分子內(nèi)旋轉(zhuǎn)受限，才會(huì)發(fā)出強(qiáng)熒光。探針在554 nm處熒光強(qiáng)度隨著環(huán)境粘度增大增強(qiáng)50倍，且不受極性、活性氧、活性氮、ONOO-等諸多因素的影響，具有優(yōu)異的選擇性。由于癌細(xì)胞內(nèi)的pH比正常細(xì)胞低、粘度比正常細(xì)胞高，因此探針B-1能夠成為區(qū)分癌細(xì)胞與正常細(xì)胞的工具。目前已成功通過(guò)探針B-1觀察到了HepG-2荷瘤小鼠腫瘤細(xì)胞與正常部位細(xì)胞之間粘度與pH的差異。

5 總結(jié)與展望

熒光成像技術(shù)由于具有靈敏度高、毒性低、可視化等優(yōu)點(diǎn)，被廣泛應(yīng)用于生物成像研究。目前，大多數(shù)粘度熒光探針是基于TICT機(jī)理來(lái)設(shè)計(jì)構(gòu)建，在對(duì)粘度檢測(cè)的過(guò)程中表現(xiàn)出了較高的靈敏度和優(yōu)異的生物相容性。借助雙光子技術(shù)和近紅外熒光團(tuán)，探針的吸收和發(fā)射信號(hào)都能紅移，達(dá)到生物光學(xué)透明區(qū)，不僅提高了組織穿透深度，還降低了背景干擾，對(duì)探針在活體中的應(yīng)用大有好處。隨著AIE概念的提出，具有AIE特性的粘度探針能夠克服傳統(tǒng)的小分子熒光探針在水溶液中易聚集而導(dǎo)致熒光猝滅的缺點(diǎn)，具備更高的光穩(wěn)定性和抗干擾能力，是熒光探針開(kāi)發(fā)的新方向。

粘度熒光探針的發(fā)展已取得了巨大的進(jìn)步，但仍存在一些問(wèn)題有待研究解決，如：(1)探針信號(hào)的保真度問(wèn)題。盡管很多探針因引入定位基團(tuán)可以有效靶向到特定的細(xì)胞器，但是在特定區(qū)域的滯留能力還有待研究；較長(zhǎng)時(shí)間的成像有利于跟蹤細(xì)胞內(nèi)的粘度變化，從而解決相關(guān)疾病的問(wèn)題，但是探針在細(xì)胞內(nèi)的遷移擴(kuò)散有可能導(dǎo)致假陽(yáng)性或假陰性信號(hào)的干擾。(2)具體癥狀或疾病的深入研究。粘度作為一個(gè)重要的細(xì)胞內(nèi)參數(shù)，其波動(dòng)反映著細(xì)胞功能的變化，如果能找到以粘度作為有效標(biāo)志物的特定病癥，將為粘度熒光探針開(kāi)啟醫(yī)學(xué)診斷的大門。希望本文能為后續(xù)的研究工作者們提供新的思路，開(kāi)發(fā)出更好的探針以滿足生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的需要。