柱前熒光衍生-離子液體微萃取-高效液相色譜法測(cè)定發(fā)酵食品中生物胺

李 宏， 史 巧， 王馨蕊， 陳駿飛， 肖飛健， 楊亞玲*

(1.云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所，云南昆明 650033；2.昆明理工大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，云南昆明 650500)

生物胺(Biogenic amines，BAs)是一類(lèi)低分子量、具有生物活性的有機(jī)堿，主要由醛、酮類(lèi)物質(zhì)在轉(zhuǎn)氨酶的作用下形成，或者游離氨基酸在微生物的脫羧作用下產(chǎn)生，常見(jiàn)的生物胺包括酪胺、組胺、腐胺、尸胺、色胺、苯乙胺、精胺和亞精胺等[1,2]。生物胺廣泛存在于食品中，尤其是釀造醬油、植物酵素、酒類(lèi)等發(fā)酵食品中。攝入過(guò)量的生物胺，會(huì)對(duì)人體健康造成不良影響[3,4]，目前生物胺測(cè)定方法有高效液相色譜法(HPLC)、液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法(HPLC-MS)、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法(GC-MS)、薄層色譜法(TLC)等[5 - 8]。高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法具有檢測(cè)靈敏度高、分析速度快等優(yōu)點(diǎn)，但對(duì)儀器和技術(shù)要求高。由于生物胺類(lèi)具有熱不穩(wěn)定性，氣相色譜法和氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法的應(yīng)用也受到限制，因此高效液相色譜法是檢測(cè)生物胺含量的主要手段。多數(shù)生物胺除組胺之外無(wú)發(fā)光基團(tuán)和熒光反應(yīng)，需要對(duì)其進(jìn)行衍生化處理，才能在色譜儀上進(jìn)行檢測(cè)，常用的衍生試劑有丹磺酰氯、苯甲酰氯、鄰苯二甲醛等，其中丹磺酰氯(Dns-Cl)是生物胺檢測(cè)中最常用的衍生試劑，所得衍生物性質(zhì)穩(wěn)定且保存時(shí)間長(zhǎng)，但其衍生過(guò)程繁瑣復(fù)雜，且耗時(shí)較長(zhǎng)，不利于樣品的快速測(cè)定[9 - 13]。熒光胺能與化合物中的芳伯胺基生成高度熒光衍生物，且反應(yīng)條件簡(jiǎn)單，反應(yīng)迅速。Akiko K等人在研究中采用熒光胺對(duì)生物胺進(jìn)行衍生，然后利用液相色譜進(jìn)行分離檢測(cè)，為本研究提供了較好的參考價(jià)值[14,15]。

食品樣品中生物胺的測(cè)定需要進(jìn)行樣品制備，以除去樣品基質(zhì)的干擾，并在HPLC分析前對(duì)分析物進(jìn)行預(yù)濃縮[16]，液液萃取(LLE)[17]和液相微萃取(LPME)[18]是樣品前處理最常用的方法。分散液液微萃取是一種集采樣、萃取和濃縮于一體的樣品前處理技術(shù)，具有操作快速、所需儀器簡(jiǎn)單、萃取費(fèi)用低、對(duì)環(huán)境友好等優(yōu)點(diǎn)。離子液體作為一種新型的極性溶劑，幾乎不需要較高的萃取溫度，并且具有不可燃性、非揮發(fā)性、良好的化學(xué)穩(wěn)定性和熱穩(wěn)定性，且離子液體可循環(huán)利用，對(duì)環(huán)境友好，故稱(chēng)之為“綠色”化學(xué)溶劑，可以用來(lái)代替?zhèn)鹘y(tǒng)的易揮發(fā)有毒溶劑，在食品樣品前處理及分析中備受關(guān)注[19,20]。

本研究報(bào)道了一種柱前熒光衍生-離子液體液液微萃取(IL-DLLME)結(jié)合HPLC測(cè)定發(fā)酵食品中生物胺的新方法。生物胺與熒光胺反應(yīng)形成具有強(qiáng)烈熒光的衍生物(圖1)，以乙腈-甲醇-乙酸緩沖液作為流動(dòng)相，并且以疏水性1-辛基-3-甲基咪唑六氟磷酸鹽作為萃取劑，1-己基-3-甲基咪唑四氟硼酸鹽作為分散劑，進(jìn)行生物胺的熒光胺衍生物萃取，由于衍生物與萃取劑良好的極性匹配性，可以達(dá)到較好的萃取效果，不僅降低基質(zhì)的干擾，還可以提高檢測(cè)靈敏度，可用于發(fā)酵食品中生物胺的測(cè)定。

圖1 IL-DLLME-HPLC測(cè)定生物胺示意圖Fig.1 Schematic illustration of IL-DLLME-HPLC detection of BAs

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

Agilent 1260高效液相色譜儀，附熒光檢測(cè)器(美國(guó)，Agilent Technologies)，帶C18反相分析柱(150 mm×4.6 mm,5 μm)；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海亞榮生化儀器廠)；XW-800快速混勻器(上海汗諾儀器有限公司)；HC-3018R型高速離心機(jī)(安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司)；電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱(上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司)；pHS-3B精密酸度計(jì)(德國(guó)賽多利)；78-1型磁力加熱攪拌器(上海南匯電訊器材廠)；AB204-S電子分析天平(梅特勒-托利多)。

組胺、尸胺、腐胺鹽酸鹽(國(guó)家有色金屬及電子材料分析測(cè)試中心)；1-辛基-3-甲基咪唑六氟磷酸鹽([C8MIm][PF6]，上海國(guó)藥)；1-己基-3-甲基咪唑四氟硼酸鹽([C4MIm]BF4，上海國(guó)藥)；熒光胺(西格瑪奧德里奇(上海)貿(mào)易有限公司)。所用試劑均為分析純，實(shí)驗(yàn)用水均為去離子水(18.25 MΩ·cm)。

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1.2 色譜條件

色譜柱：C18色譜柱(150 mm×4.6 mm，5 μm)；熒光檢測(cè)波長(zhǎng)：激發(fā)波長(zhǎng)388 nm，發(fā)射波長(zhǎng)490 nm；進(jìn)樣量：20 μL；柱溫：40 ℃；流速：1 mL/min。流動(dòng)相A：乙腈-甲醇(體積比為1∶1)；流動(dòng)相B：HAc-NaAc緩沖溶液；梯度洗脫：0～16 min，30%～60%A；16.00～16.10 min，60%～90%A；16.10～22.00 min，90%A；22.00～22.10 min，90%～30%A；22.10～25.00 min，30%A。

1.3 衍生化方法

液相小瓶中依次加入200 μL生物胺混合標(biāo)準(zhǔn)溶液(或?qū)嶋H樣品提取液)、200 μL 3.0 mol/L NaAc及100 μL 0.2%熒光胺丙酮溶液，渦旋混勻30 s，暗處衍生20 min，衍生后體系由無(wú)色變?yōu)辄S色，且?guī)в袕?qiáng)烈的黃色熒光，衍生化反應(yīng)如下：

1.4 IL-DLLME方法

將衍生溶液用去離子水定容到10 mL，快速注入150 μL [C8MIM]PF6和300 μL[C6MIM]BF4的混合液，旋渦混合1 min，此時(shí)管內(nèi)形成黃白色乳濁液，以8 000 r/min離心5 min，管內(nèi)溶液分層，離子液體沉積到下層，且呈黃色。用注射器針尖取出黃色層溶液，用乙腈定容至1 mL，過(guò)0.22 μm濾膜后，取20 μL供HPLC分析。其測(cè)定示意圖如圖1所示。

1.5 樣品前處理方法

稱(chēng)取泡小米辣、榨菜和醬腌菜經(jīng)勻漿處理混勻樣品1.00 g于15 mL離心管中，加入5 mL HClO4，于30 ℃水浴溫度下超聲提取30 min，過(guò)濾不溶物，取濾液用Na2CO3溶液調(diào)節(jié)pH至中性，用去離子水定容后待衍生化。

2 結(jié)果與討論

2.1 液液微萃取條件優(yōu)化

2.1.1 萃取劑及分散劑的選擇對(duì)于生物胺的液液微萃取研究不多，有研究采用低共熔溶劑液液微萃取[21]，主要原因是生物胺是極性分子，在水中溶解度大，不能使用常規(guī)分散液液微萃取的萃取劑，如三氯甲烷、四氯化碳、氯苯、二硫化碳等進(jìn)行。將生物胺進(jìn)行熒光衍生后，其衍生物的極性減小，研究用無(wú)毒疏水性的離子液體作為萃取劑，考察了[C4MIM]PF6、[C5MIM]PF6、[C6MIM]PF6、[C7MIM]PF6及[C8MIM]PF6等5種離子液體。采用親水性離子液體作為分散劑，考察了[C4MIM]BF4及[C6MIM]BF4兩種離子液體對(duì)萃取效率的影響，如圖2。[C4MIM]PF6在水中有一定的溶解度，當(dāng)[C8MIM]PF6與[C6MIM]BF4組合后，既保證了極性的匹配，又有合適的粘度。實(shí)驗(yàn)中選擇此組合為萃取劑及分散劑，并同時(shí)考察了其用量(圖3)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，當(dāng)萃取劑體積小于150 μL時(shí)，萃取劑體積不足會(huì)導(dǎo)致萃取不完全；當(dāng)萃取劑用量大于150 μL，萃取效率變化不明顯，遵循環(huán)保經(jīng)濟(jì)的原則，選擇萃取劑用量為150 μL。當(dāng)分散劑體積小于300 μL時(shí)，隨著用量增加分散劑能使萃取劑與樣品溶液接觸幾率增加，萃取效率不斷增強(qiáng)；當(dāng)分散劑體積大于300 μL時(shí)，萃取效率反而降低，可能是因?yàn)榉稚┯昧窟^(guò)多稀釋樣品溶液，從而間接影響了萃取效率，因此選用萃取劑體積為150 μL，分散劑體積為300 μL。

圖2 萃取劑種類(lèi)的選擇Fig.2 The effect of different extractant type

圖3 萃取劑用量(A)和分散劑用量(B)對(duì)萃取效率的影響Fig.3 Effect of extractant dosage(A) and dispersant dosage(B) on extraction efficiency

2.1.2 pH與溫度的影響大多數(shù)IL-DLLME方法是在中性條件下進(jìn)行的，但[C8MIM]PF6在中性條件下，萃取率較低。實(shí)驗(yàn)在pH 2.2～10范圍內(nèi)考察了pH對(duì)萃取效率的影響。結(jié)果如圖4A，在pH=3時(shí)，萃取率較大，而pH在4～10時(shí)，萃取率逐漸減小，可能高pH條件下會(huì)對(duì)衍生物的穩(wěn)定性產(chǎn)生影響，導(dǎo)致萃取回收率降低，故實(shí)驗(yàn)選擇pH=3條件下進(jìn)行反應(yīng)。

此外，實(shí)驗(yàn)還研究了溫度對(duì)萃取結(jié)果的影響,結(jié)果如圖4B所示，在室溫25 ℃下萃取率最高，因此本實(shí)驗(yàn)選擇室溫25 ℃下萃取。

圖4 不同pH值(A)和溫度(B)對(duì)萃取率的影響Fig.4 Effect of different pH value(A) and temperature(B) on the extraction efficiency

2.1.3 鹽效應(yīng)由于鹽能夠改變?nèi)芤旱碾x子強(qiáng)度，在IL-DLLME中加入一定濃度的NaCl溶液，研究發(fā)現(xiàn)鹽濃度對(duì)萃取體系回收率影響不大。

2.2 方法分析性能

圖5 標(biāo)準(zhǔn)樣品的IL-DLLME-HPLC-FLD色譜圖Fig.5 Chromatograms of BAs with the pre-column fluorescent derivatization and DLLME

2.2.1 線性回歸方程、檢出限與定量限分別取生物胺(組胺、腐胺、尸胺)混合標(biāo)準(zhǔn)使用液0.025、0.050、0.100、0.150、0.200 mL，按照衍生化方法進(jìn)行處理后，分別取各濃度混合標(biāo)準(zhǔn)工作液20 μL進(jìn)樣，加入離子液體進(jìn)行萃取，萃取前后色譜圖如圖5。由圖5可見(jiàn)，經(jīng)IL-DLLME處理后，檢測(cè)靈敏度得到較大提高。依據(jù)生物胺峰面積Y和生物胺含量X進(jìn)行線性回歸，所得各生物胺衍生物的線性回歸方程、相關(guān)系數(shù)、檢出限(S/N=3)和定量限(S/N=10)見(jiàn)表1，線性相關(guān)系數(shù)均大于0.996，檢出限為0.39～0.91 mg/kg，定量限為1.52～5.36 mg/kg，具有靈敏度高的特點(diǎn)，能夠用于生物胺的靈敏檢測(cè)。

表1 3種生物胺衍生物的線性回歸方程、相關(guān)系數(shù)、檢出限、定量限

2.2.2 方法回收率和精密度及樣品分析在優(yōu)化后的提取條件下，將所建立的方法用于腌菜、榨菜、小米辣中的生物胺分析，結(jié)果在3種樣品中均檢出生物胺(表2)。為評(píng)價(jià)方法的準(zhǔn)確度和適用性，設(shè)置添加濃度為5、25、50 mg/kg的3種生物胺，平行測(cè)定3次，計(jì)算其回收率。由表3可知，3種生物胺在腌菜、榨菜和小米辣中的回收率為81.0%～108.7%，表明該方法具有良好的準(zhǔn)確度和適用性。3種生物胺的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差均在1.7%到5.9%之間，表明該方法具有良好的精密度。

表2 腌制品中生物胺含量的測(cè)定結(jié)果(n=6)

表3 腌制品中生物胺含量加標(biāo)回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)

3 結(jié)論

建立了發(fā)酵食品中3種生物胺的測(cè)定方法，對(duì)提取液中的生物胺進(jìn)行衍生化處理后，采用離子液體作為萃取劑和分散劑對(duì)衍生產(chǎn)物進(jìn)行萃取，結(jié)果表明，樣品中的生物胺經(jīng)過(guò)衍生萃取進(jìn)行富集后，降低了檢測(cè)的檢出限。該方法具有簡(jiǎn)便、快速和靈敏度高等優(yōu)勢(shì)，且具有良好的適用性。