色烯衍生物的合成及其在生物硫醇檢測(cè)中的應(yīng)用

陰彩霞，岳永康，霍方俊

(1.化學(xué)生物學(xué)與分子工程教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,能量轉(zhuǎn)換與存儲(chǔ)材料山西省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,山西大學(xué) 分子科學(xué)研究所,山西 太原 030006;2.山西大學(xué) 應(yīng)用化學(xué)研究所,山西 太原 030006)

色烯衍生物的合成及其在生物硫醇檢測(cè)中的應(yīng)用

陰彩霞1，岳永康2，霍方俊2

(1.化學(xué)生物學(xué)與分子工程教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,能量轉(zhuǎn)換與存儲(chǔ)材料山西省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,山西大學(xué) 分子科學(xué)研究所,山西 太原 030006;2.山西大學(xué) 應(yīng)用化學(xué)研究所,山西 太原 030006)

合成了一個(gè)色烯衍生物并將其應(yīng)用于生物硫醇的識(shí)別檢測(cè)?；凇傲虼?色烯點(diǎn)擊化學(xué)”,該探針對(duì)生物硫醇表現(xiàn)出高的特異性和靈敏性,其對(duì)Hcy的檢出限為7.6×10-6mol/L。

色烯;硫醇;點(diǎn)擊化學(xué)

0 引言

生物小分子硫醇包括半胱氨酸(Cys)、同型半胱氨酸(Hcy)和谷胱甘肽(GSH),它們?cè)诰S持人體代謝中扮演著重要的角色[1-3]。Cys是細(xì)胞內(nèi)含硫衍生物的代謝中心,其與胱氨酸的轉(zhuǎn)化能夠調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)活性氧的水平,起到抗衰老的作用[4-5]。Hcy是蛋氨酸酶促生成Cys的中間產(chǎn)物,其正常血漿總濃度為9～13 μmol,過高的血Hcy含量與腎病、心血管和腦血管疾病密切相關(guān)[6]。目前,人體血漿中總Hcy的水平已經(jīng)成為臨床預(yù)測(cè)患心臟病、中風(fēng)和老年癡呆癥的主要指標(biāo)。GSH是細(xì)胞內(nèi)主要的還原性物質(zhì)之一,其與氧化型谷胱甘肽的轉(zhuǎn)變能夠有效特異地清除細(xì)胞內(nèi)自由基,起到保健、抗衰老的作用。同時(shí),GSH的三肽結(jié)構(gòu)能夠與鉛、汞、砷等重金屬離子生成穩(wěn)定的配合物從體內(nèi)排出,起到解毒、維持正常的新陳代謝過程和免疫系統(tǒng)的功能[7]。

為了深化三種生物小分子硫醇在體內(nèi)的生理學(xué)和病理學(xué)研究,非侵入性的熒光探針技術(shù)受到了廣泛的關(guān)注。目前,已報(bào)道的生物硫醇熒光探針反應(yīng)類型主要包括硫醇-探針親核加成反應(yīng)[8-10]、硫醇-探針親核取代反應(yīng)[11-13]和硫醇-探針親核取代-分子內(nèi)取代反應(yīng)[14-19]?；谶@些反應(yīng)類型設(shè)計(jì)發(fā)展的硫醇熒光探針能夠?qū)崿F(xiàn)小分子硫醇的特異性識(shí)別。但是,用于可逆識(shí)別生物硫醇的探針卻鮮有報(bào)道。這極大地限制了生物硫醇在體內(nèi)的濃度變化研究。

2009年,我們將色烯分子用于生物硫醇的特異性檢測(cè),并將該識(shí)別反應(yīng)命名為“硫醇-色烯點(diǎn)擊反應(yīng)”[9]。該反應(yīng)在重金屬離子誘導(dǎo)下可以實(shí)現(xiàn)色烯分子的再生[7,20]?；诖?我們進(jìn)一步以色烯為熒光團(tuán),發(fā)展了一個(gè)色烯衍生物(CHMPC)用于生物硫醇的特異性識(shí)別。CHMPC對(duì)生物硫醇表現(xiàn)出高的特異性,能夠用于生物硫醇的比色、熒光雙通道檢測(cè)。探針對(duì)生物硫醇的響應(yīng)機(jī)理如圖1所示。

Fig.1 Structure and sensing mechanism of CHMPC toward thiols圖1 CHMPC的結(jié)構(gòu)及其對(duì)硫醇的識(shí)別機(jī)理

1 基本原理

1.1 實(shí)驗(yàn)儀器與試劑

梅特勒托萊多FE20 pH計(jì),上海華美實(shí)驗(yàn)器材PO-120(10 mm)石英比色皿,熒光光譜儀Cary Eclipse,紫外-可見分光光度計(jì)Cary 50 Bio,液質(zhì)相色譜儀waters UPLC,質(zhì)譜儀LC-MS 2010A (Shimadzu),核磁共振儀Bruker DRX-300 MHz核磁共振儀,X射線單晶衍射儀R-AXIS Rapid IP (Rigaku)。所用試劑均為分析純?cè)噭?水為去離子水。

1.2 探針的合成

合成路線如圖2所示[21]。

Fig.2 Synthesis of CHMPC圖2 CHMPC的合成

CHMPC:1H NMR (300 MHz, 25℃, CDCl3): δ 7.30 (s, 1H), 7.13 (s, 1H), 7.09 (s, 1H), 5.28 (t, 1H), 4.60-4.65 (m, 2H), 2.54-2.72 (m, 2H), 2.13-2.39 (m, 3H);EI-MS m/z 250[M]+.晶體數(shù)據(jù):C13H11ClO3, FW=250.67,晶體大小: 0.3×0.2×0.2 mm,三斜晶體,空間群P-1 (No.61),a=8.180 9(9) ?,b=10.338 7(12) ?,c=14.147 9(16) ?,α=109.808(2),β=91.556(2),γ=96.558(2),V=1 115.7(2) ?3,Z=4,T=296 K,θmax=25.00°, 11 915 reflections measured,3 935 unique(Rint=0.047 7).最終殘留I> 2σ(I)的309個(gè)參數(shù)和3 935次反射:R1=0.049,wR2=0.119 5和GOF=1.014.

Fig.3 Crystal structure of CHMPC圖3 CHMPC的晶體結(jié)構(gòu)

1.3 光譜測(cè)定

配置2 mmol/L CHMPC的乙醇儲(chǔ)備液,取10 μL儲(chǔ)備液于含有2 mL Hepes(pH 7.0)溶液的石英比色皿中混勻。在室溫下,分別向其中加入各種氨基酸溶液混勻,放置5 min后進(jìn)行光譜測(cè)試。

2 結(jié)果與討論

2.1 探針的選擇性研究

為了檢驗(yàn)探針CHMPC對(duì)生物硫醇的選擇性,我們首先在含有10 μmol/L CHMPC的Hepes(pH 7.0)體系中分別加入終濃度為0.2 mmol/L Cys、Hcy、GSH、丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、甘氨酸、組氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、賴氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、色氨酸、纈氨酸、氰根、焦磷酸根、硫氫根、氟離子、氯離子、溴離子、碘離子、磷酸根、草酸根、硝酸根、次氯酸根,避光放置5 min后,分別測(cè)試其紫外吸收光譜。如圖4所示,CHMPC與硫醇作用后,體系在306 nm和382 nm處的紫外吸收強(qiáng)度降低。該體系與其他氨基酸和陰離子作用后無明顯紫外吸收光譜變化。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,探針CHMPC可用于生物硫醇的特異性比色檢測(cè)。由于CHMPC對(duì)Hcy響應(yīng)較為明顯,我們后續(xù)測(cè)定主要針對(duì)Hcy進(jìn)行。

Fig.4 UV-vis spectra of CHMPC toward thiols, various amino acids and anions, respectively圖4 CHMPC對(duì)生物硫醇、各種氨基酸及陰離子的紫外吸收光譜響應(yīng)

2.2 CHMPC對(duì)Hcy的滴定梯度及檢出限研究

圖5a是在含有10 μmol/L CHMPC的Hepes(pH 7.0)體系中逐漸加入Hcy(0～0.18 mmol/L)后的紫外光譜變化圖。體系在306 nm和382 nm處紫外吸收強(qiáng)度逐漸降低,體系顏色由黃色變?yōu)闊o色,這意味著Hcy的加入打開了探針分子的共軛結(jié)構(gòu)[20]。對(duì)應(yīng)的熒光光譜變化如圖5b所示,CHMPC在532 nm(λex=425 nm)處有熒光發(fā)射,Hcy的加入使得體系熒光逐漸猝滅。我們進(jìn)一步在探針體系中分別加入0.025、0.05、0.075、0.1、0.125、0.15、0.175 mmol/L Hcy。如圖5c所示,其對(duì)應(yīng)紫外吸收強(qiáng)度與Hcy濃度所得線性擬合方程為A=0.554-0.179C(C為加入Hcy后的終濃度,A為對(duì)應(yīng)306 nm處紫外吸收強(qiáng)度),計(jì)算得到CHMPC對(duì)Hcy的檢出限為7.6×10-6mol/L。

Fig.5 Titration experiments of CHMPC toward Hcy圖5 CHMPC對(duì)Hcy的紫外吸收梯度和熒光滴定梯度圖

Fig.6 UV-vis absorption at 306 nm of CHMPC and the Hcy added system in different pH values圖6 不同pH環(huán)境中CHMPC和CHMPC-Hcy在306 nm處的紫外吸收強(qiáng)度

2.3 pH對(duì)CHMPC識(shí)別Hcy的影響研究

為了研究CHMPC用于檢測(cè)Hcy的pH適用范圍,我們?cè)诓煌琾H的Hepes緩沖溶液(pH 3～12)中分別測(cè)試了Hcy加入前后CHMPC的紫外吸收光譜。如圖6所示,在pH 3～11的條件下,CHMPC在306 nm處吸收較為穩(wěn)定。加入Hcy后,pH 5～10體系中306 nm處吸收出現(xiàn)明顯降低,其中,在pH 7環(huán)境中變化最明顯。

2.4 CHMPC檢測(cè)Hcy的機(jī)理研究

三種生物硫醇相似的結(jié)構(gòu)導(dǎo)致目前大多數(shù)硫醇探針無法實(shí)現(xiàn)其三者的區(qū)分識(shí)別。近期,我們發(fā)展的香豆素衍生物用于生物硫醇的區(qū)分識(shí)別結(jié)果表明,三種生物硫醇的活性受到pH的調(diào)控,在相同pH條件下其活性為Cys>Hcy>GSH[22]。為了進(jìn)一步解釋CHMPC對(duì)Hcy表現(xiàn)出較Cys高的活性,我們基于密度泛函理論在m062x/6-31+G(d)水平對(duì)其作用的過程進(jìn)行了模擬計(jì)算研究。如圖7所示,過渡態(tài)中S…C1和O…H鍵長縮短到2.347～2.351和1.946～1.981 ?,O…C2鍵長增長到2.893～2.894 ?。此結(jié)果表明,探針與硫醇作用后,S…C1和O…H鍵形成而O…C2鍵斷裂(圖1)。另外,CHMPC與Cys和Hcy作用的活化能壘分別為40.24和33.89 kcal/mol,因此,CHMPC與Hcy作用較Cys表現(xiàn)出更高的活性。

Fig.7 Optimized transition state structures for CHMPC reaction withCys (a) and Hcy (b) n gas phase. Selected interatomic distances (in ?) are indicated圖7 CHMPC與Cys和Hcy反應(yīng)的過渡態(tài)結(jié)構(gòu)優(yōu)化

3 結(jié)論

本文基于Baylis-Hillman反應(yīng)合成了一個(gè)色烯衍生物(CHMPC),并將其應(yīng)用于生物硫醇的比色、熒光識(shí)別檢測(cè)。隨著硫醇的加入,CHMPC在306 nm和382 nm處紫外吸收強(qiáng)度逐漸降低。同時(shí),體系在532 nm處熒光發(fā)射逐漸猝滅。CHMPC對(duì)生物硫醇表現(xiàn)出高的靈敏性和選擇性。其中,與Hcy作用最為靈敏。CHMPC對(duì)Hcy的檢出限為7.6×10-6mol/L?；诶碚撚?jì)算,我們對(duì)CHMPC識(shí)別生物硫醇的作用機(jī)理和反應(yīng)活性進(jìn)行了研究。

[1] Yin C X,Huo F J,Zhang J J,etal.Thiol-Addition Reactions and Their Applications in Thiol Recognition[J].ChemSocRev,2013,42:6032-6059.DOI:10.1039/c3cs60055f.

[2] Niu L Y,Chen Y Z,Zheng H R,etal.Design Strategies of Fluorescent Probes for Selective Detection among Biothiols[J].ChemSocRev,2015,44:6143-6160.DOI:10.1039/c5cs00152h.

[3] Jung H S,Chen X Q,Kim J S,etal.Recent Progress in Luminescent and Colorimetric Chemosensors for Detection of Thiols[J].ChemSocRev,2013,42:6019-6031.DOI:10.1039/c3cs60024f.

[4] Yue Y K,Huo F J,Yin C X.Thiol Nucleophilic Reactions and Their Applications in Thiol Fluorescent Recognition[J].SciSinChim,2016,47:249-257.DOI:10.1360/N032016-00138.

[5] Yue Y K,Huo F J,Ning P,etal.Dual-Site Fluorescent Probe for Visualizing the Metabolism of Cys in Living Cells[J].JAmChemSoc,2017,139:3181-3185.DOI:10.1021/jacs.6b12845.

[6] Zhang Y L,Shao X M,Wang Y,etal.Dual Emission Channels for Sensitive Discrimination of Cys/Hcy and GSH in Plasma and Cells[J].ChemCommun,2015,51:4245-4248.DOI:10.1039/c4cc08687b.

[7] Yang Y T,Huo F J,Yin C X,etal.Thiol-Chromene Click Chemistry:A Coumarin-Based Derivative and Its Use as Regenerable Thiol Probe and in Bioimaging Applications[J].BiosensBioelectron,2013,47:300-306.DOI:10.1016/j.bios.2013.03.007.

[8] Hoyle C E,Lowe A B,Bowman C N.Thiol-Click Chemistry:A Multifaceted Toolbox for Small Molecule and Polymer Synthesis[J].ChemSocRev,2010,39:1355-1387.DOI:10.1039/b901979k.

[9] Huo F J,Sun Y Q,Su J,etal.Colorimetric Detection of Thiols Using a Chromene Molecule[J].OrgLett,2009,11:4918-4921.DOI:10.1021/ol901951h.

[10] Yang X F,Guo Y X,Strongin R M.Conjugate Addition/Cyclization Sequence Enables Selective and Simultaneous Fluorescence Detection of Cysteine and Homocysteine[J].AngewChemIntEd,2011,50:10690-10693.DOI:10.1002/anie.201103759.

[11] Ma T,Ding H,Xu H J,etal.Dual-Functional Probes for Sequential Thiol and Redox Homeostasis Sensing in Live Cells[J].Analyst,2015,140:322-329.DOI:10.1039/c4an01441c.

[12] Yang L,Qu W S,Zhang X,etal.Constructing a FRET-Based Molecular Chemodosimeter for Cysteine over Homocysteine and Glutathione by Naphthalimide and Phenazine Derivatives[J].Analyst,2015,140:182-189.DOI:10.1039/c4an01732c.

[13] Zhang Q,Liu H,Pan Z Y.A General Approach for the Development of Fluorogenic Probes Suitable for No-Wash Imaging of Kinases in Live Cells[J].ChemCommun,2014,50:15319-15322.DOI:10.1039/c4cc07429g.

[14] Niu L Y,Guan Y S,Chen Y Z,etal.BODIPY-Based Ratiometric Fluorescent Sensor for Highly Selective Detection of Glutathione over Cysteine and Homocysteine[J].JAmChemSoc,2012,134:18928-18931.DOI:10.1021/ja309079f.

[15] Guo Z Q,Nam S W,Park S,etal.A Highly Selective Ratiometric Near-Infrared Fluorescent Cyanine Sensor for Cysteine with Remarkable Shift and Its Application in Bioimaging[J].ChemSci,2012,3:2760-2765.DOI:10.1039/c2sc20540h.

[16] Lee Y H,Ren W X,Han J Y,etal.Highly Selective Two-Photon Imaging of Cysteine in Cancerous Cells and Tissues[J].ChemCommun,2015,51:14401-14404.DOI:10.1039/c5cc06038a.

[17] Liu J,Sun Y Q,Huo Y Y,etal.Simultaneous Fluorescence Sensing of Cys and GSH from Different Emission Channels[J].JAmChemSoc,2014,136:574-577.DOI:10.1021/ja409578w.

[18] Lim S Y,Hong K H,Kim D I,etal.Tunable Heptamethine-Azo Dye Conjugate as an NIR Fluorescent Probe for the Selective Detection of Mitochondrial Glutathione over Cysteine and Homocysteine[J].JAmChemSoc,2014,136:7018-7025.DOI:10.1021/ja500962u.

[19] Yin J,Kwon Y,Kim D,etal.Cyanine-Based Fluorescent Probe for Highly Selective Detection of Glutathione in Cell Cultures and Live Mouse Tissues[J].JAmChemSoc,2014,136:5351-5358.DOI:10.1021/ja412628z.

[20] Huo F J,Sun Y Q,Su J,etal.Chromene “Lock”,Thiol “Key”,and Mercury(Ⅱ) Ion “Hand”:A Single Molecular Machine Recognition System[J].OrgLett,2010,12:4756-4759.DOI:10.1021/ol101771j.

[21] Yue Y K,Yin C X,Huo F J,etal.Thiol-Chromene Click Chemistry:A Turn-On Fluorescent Probe for Specific Detection of Cysteine and Its Application in Bioimaging[J].SensActuatorsB,2016,223:496-500.DOI:10.1016/j.snb.2015.09.127.

[22] Yue Y K,Huo F J,Li X Q,etal.pH-Dependent Fluorescent Probe That Can Be Tuned for Cysteine or Homocysteine[J].OrgLett,2017,19:82-85.DOI:10.1021/acs.orglett.6b03357.

The Synthesis of Chromene Derivate and Its Application in Biothiols Detection

YIN Caixia1,YUE Yongkang2,HUO Fangjun2

(1.Key Laboratory of Chemical Biology and Molecular Engineering of Ministry of Education,Key Laboratory of Materials for Energy Conversion and Storage of Shanxi Province,Institute of Molecular Science, Shanxi University,Taiyuan 030006,China;2.Research Institute of Applied Chemistry,Shanxi University,Taiyuan 030006,China)

A new chromene based chemodosimeter (CHMPC) for thiols has been developed by Baylis-Hillman reaction. Based on the thiols-chromene ‘click’reaction, CHMPC displayed colorimetric and fluorimetric responses toward thiols with high selectivity and sensitivity.

Chromene;thiols;click reaction

10.13451/j.cnki.shanxi.univ(nat.sci.).2017.03.017

2017-06-10；

2017-06-19

國家自然科學(xué)基金(21472118；21672131);山西省組織部拔尖人才專項(xiàng)基金(2014401)

陰彩霞(1978-)，女，博士，教授，主要從事熒光探針及其生物傳感方面的研究。E-mail:yincx@sxu.edu.cn

O436

A

0253-2395(2017)03-0527-06