非洲豬瘟弱毒疫苗研究進(jìn)展

李 偉

（河南省鄲城縣農(nóng)業(yè)農(nóng)村局，河南 鄲城 477150）

非洲豬瘟（ASF）是由非洲豬瘟病毒（ASFV）感染引起的豬的一種急性、出血性傳染，導(dǎo)致很高的發(fā)病率和致死率，是世界動(dòng)物衛(wèi)生組織（WHO）法定報(bào)告的動(dòng)物疫病。ASFV基因組是雙鏈DNA病毒，基因組約為170～190 kbp，編碼150～200 種蛋白質(zhì)[1]。1921年在肯尼亞首次發(fā)現(xiàn)ASF疫情，迄今已有100年的流行歷史，遍及歐洲、美洲和亞洲，給全球養(yǎng)豬業(yè)造成巨大經(jīng)濟(jì)損失[2]。然而，由于ASFV復(fù)雜的免疫保護(hù)和免疫逃避機(jī)制，迄今為止還沒(méi)有安全、有效的疫苗問(wèn)世。隨著分子生物學(xué)技術(shù)和免疫學(xué)技術(shù)的發(fā)展，ASF疫苗的研究取得重要進(jìn)展，先后有滅活疫苗、重組亞單位疫苗、弱毒疫苗等不同技術(shù)路線研制的疫苗，均獲得一定的免疫保護(hù)。本文基于弱毒疫苗顯示的很強(qiáng)免疫保護(hù)能力的特點(diǎn)，對(duì)近年來(lái)ASF弱毒疫苗的研究進(jìn)展進(jìn)行綜述，以期為ASF的研發(fā)提供參考。

1 ASFV自然分離株弱毒疫苗

科研人員從軟蜱和慢性感染ASFV的豬中分離到一些自然弱毒的ASFV毒株，例如OUR T88/3 和NH/P68[3-4]，這兩株自然分離弱毒ASFV毒株對(duì)同源毒株的免疫保護(hù)率在66%～100%不等，其保護(hù)率與攻毒毒株的特性、免疫劑量和免疫途徑等不同因素有關(guān)。從完全保護(hù)的免疫數(shù)據(jù)分析，發(fā)現(xiàn)免疫后抗體水平和細(xì)胞毒性CD8+T 細(xì)胞在免疫保護(hù)中發(fā)揮重要作用。研究發(fā)現(xiàn)，自然分離弱毒株NH/P68（基因型I）能夠100%保護(hù)強(qiáng)毒株L60（基因型I）的攻擊，而且還能夠抵抗Arm/07（基因型Ⅱ）的異源毒株的攻擊，但是該毒株免疫后的缺點(diǎn)是能夠引起一定的副反應(yīng)。使用弱毒株OUR T88/3 疫苗進(jìn)行初始免疫，再用OUR T88/1 毒株加強(qiáng)免疫,對(duì)Benin 97/1和Uganda 1965強(qiáng)毒株攻擊豬的免疫保護(hù)率分別為85.7%～100%，首次證明該疫苗具有交叉保護(hù)作用，可以抵抗非同源ASFV 毒株的攻擊[5]。但是，自然分離的弱毒株疫苗免疫后引起許多不良反應(yīng)，例如，在用NH/P68 毒株免疫后，約25%～47% 的豬出現(xiàn)慢性感染的癥狀，接種OUR T88/3 的豬出現(xiàn)發(fā)燒和關(guān)節(jié)腫脹等癥狀[6]。Gallardo 等人[7]報(bào)道了一種（non-HAD）ASFV 基因型Ⅱ毒株，該毒株系2017 年拉脫維亞野豬中分離的病毒，命名為L(zhǎng)v/17/WB/Rie1。該毒株的基因組序列的特征在于EP402R基因存在單核苷酸缺失，導(dǎo)致該蛋白功能喪失。實(shí)驗(yàn)感染豬臨床癥狀不明顯，有的甚至無(wú)癥狀，表現(xiàn)為間歇性病毒血癥和高抗體反應(yīng)。兩個(gè)月后，當(dāng)這些動(dòng)物暴露于感染了強(qiáng)毒株基因型ⅡASFV的其他動(dòng)物時(shí)，這些動(dòng)物沒(méi)有受到病毒的感染而獲得完全保護(hù)。雖然實(shí)驗(yàn)動(dòng)物數(shù)量不多，但上述結(jié)果表明，Lv17/WB/Rie1毒株的疫苗具有成為減毒活疫苗的潛力。

2 ASFV傳代弱毒疫苗

ASFV通過(guò)敏感細(xì)胞傳代培養(yǎng)可以降低病毒致病性，常用細(xì)胞有豬肺泡巨噬細(xì)胞、Vero細(xì)胞和COS-1細(xì)胞系。在1960年，Manso等通過(guò)使用豬骨髓細(xì)胞對(duì)ASFV進(jìn)行傳代致弱，發(fā)現(xiàn)豬在接種減毒株后能夠抵抗強(qiáng)毒株的攻擊。但是之后，在西班牙和葡萄牙，使用減毒株進(jìn)行的田間試驗(yàn)造成了災(zāi)難性的后果，免疫動(dòng)物出現(xiàn)肺炎、流產(chǎn)和死亡等嚴(yán)重的副反應(yīng)。Tabar’es等[8]比較了ASFV在豬白細(xì)胞傳代（毒株E70 L6）和在Vero細(xì)胞傳代（毒株E70MS14）后病毒基因組酶切圖譜變化情況，結(jié)果顯示，在適應(yīng)Vero細(xì)胞生長(zhǎng)之前，ASFV毒株E70 L6的DNA大小為l73 kb，傳代適應(yīng)后DNA僅為156 kb，缺失了17 kb。Krug等人將ASFV-G 毒株在Vero 細(xì)胞中進(jìn)行傳代培養(yǎng)，傳到第110代時(shí)毒力完全喪失，病毒的復(fù)制能力增強(qiáng)，但是，豬接種該疫苗后未獲得相應(yīng)的免疫保護(hù)[9]。通過(guò)毒株序列測(cè)定，表明該毒株基因組末端出現(xiàn)了大片段的基因缺失和突變，這種突變可能是其適應(yīng)Vero細(xì)胞的原因，但它改變了ASFV-G/V的抗原性，未能誘導(dǎo)保護(hù)性免疫反應(yīng)。

3 ASFV重組弱毒疫苗

隨著分子生物學(xué)技術(shù)發(fā)展，使用同源重組方法，可以定點(diǎn)敲除病毒毒力基因或免疫抑制性或免疫逃逸相關(guān)基因以降低病毒的毒力，可在短時(shí)間內(nèi)獲得致弱毒株，該方法快速簡(jiǎn)便，其難點(diǎn)在于重組病毒的純化，使其不含親本病毒。目前，發(fā)現(xiàn)與ASFV毒力相關(guān)的基因主要包括：TK、UK、9 GL和CD2v，與免疫逃逸相關(guān)基因主要有MGF和A238L，與免疫抑制相關(guān)基因有A276R。Abrams等[10]從OUR T88/3 弱毒株中成功敲除了DP71L 和DP96R 基因獲得重組病毒OURT88/3ΔDP2，用缺失病毒OUR T88/3ΔDP2 和親本病毒OUR T88/3 對(duì)6 頭豬進(jìn)行免疫接種，并用強(qiáng)毒OUR T88/1 病毒進(jìn)行攻擊，結(jié)果基因缺失毒株免疫組OUR T88/3ΔDP2獲得了66%的保護(hù)，而親本病毒OUR T88/3提供了100%的保護(hù)。該研究結(jié)果表明，弱毒株OUR T88/3中敲除DP71L和DP96R兩個(gè)基因后，免疫豬后用強(qiáng)毒株攻擊時(shí)，其保護(hù)作用減弱，提示這兩個(gè)基于與免疫保護(hù)相關(guān)。Gallardo等[11]將PAM細(xì)胞傳代的NH/P68免疫豬能抵抗Arm07毒株的攻擊，但構(gòu)建的基因缺失株NH/P68△A276R不能抵抗Arm07毒株的攻擊。這也證實(shí)了A276R在ASFV的免疫保護(hù)中發(fā)揮著重要作用。O’Donnell等[12]從高加索地區(qū)和東歐流行的毒株中分離到一株強(qiáng)毒株Georgia 2007/1（ASFV-G），通過(guò)同源重組技術(shù)在原代豬肺巨噬細(xì)胞中構(gòu)建了缺失9GL的重組病毒（ASFV-GΔ9GL），用104個(gè)HAD50的劑量肌肉注射，可誘導(dǎo)豬產(chǎn)生與親本毒株ASFV-G一樣的臨床癥狀，用較低劑量（102～103HAD50）的ASFV-G-Δ9GL 感染豬不能誘導(dǎo)產(chǎn)生臨床癥狀，當(dāng)豬在感染后21或28天攻毒時(shí)，102HAD50的劑量組獲得部分保護(hù)，但103HAD50的劑量組在21天和28天攻毒均能獲得完全保護(hù)。該研究盡管通過(guò)同源重組技術(shù)獲得了致弱毒株，但是該弱毒株的免疫劑量和感染劑量不好控制，很難在臨床上使用。因此，在之前的基礎(chǔ)上，該研究團(tuán)隊(duì)又構(gòu)建了另一個(gè)基因UK（DP96R）缺失的毒株（ASFV-G-Δ9GL/ΔUK）[13]，以進(jìn)一步致弱毒株，用該毒株高劑量（106HAD5）0肌肉注射豬不會(huì)引起發(fā)病，當(dāng)接種104HAD50的劑量時(shí)可以保護(hù)豬免受強(qiáng)毒株ASFV-G的攻擊。Reis 等[14]通過(guò)敲除DP148R基因構(gòu)建重組病毒BeninΔDP148R，該病毒在豬體內(nèi)的毒力低于親本病毒，接種豬僅在免疫后顯示短暫的輕微臨床癥狀，用親本病毒攻擊后，所有通過(guò)肌內(nèi)途徑免疫的豬都存活下來(lái)，通過(guò)鼻內(nèi)途徑免疫的豬，除一只外，所有豬都存活下來(lái)。O’Donnell等[15]敲除Georgia 2007/1分離株（ASFV-G）的MGF505、MGF360-1R、MGF360-12L、MGF360 -13L、MGF360 -14L、MGF505 -2R 和MGF505-3R 6個(gè)基因，構(gòu)建重組病毒ASFV-GΔMGF。在原代豬肺巨噬細(xì)胞中，ASFV-G-ΔMGF 的復(fù)制效率與親代病毒一樣高。豬肌肉注射后，ASFVG-ΔMGF在體內(nèi)的復(fù)制效率完全減弱。用該弱毒疫苗免疫后，豬能抵抗親本毒株的攻擊。為了解決疫苗的安全問(wèn)題，他們又構(gòu)建了一個(gè)新的毒株ASFV-GΔ9G/ΔMGF[16]，與ASFV-G和ASFV-G-ΔMGF相比，ASFV-G-Δ9GL/ΔMGF在原代豬肺巨噬細(xì)胞中的復(fù)制能力降低，當(dāng)肌內(nèi)接種豬時(shí)，ASFV-G-Δ9GL/ΔMGF即使在106HAD50的高劑量下無(wú)致病性。用102～106HAD50劑量感染動(dòng)物，在感染后的任何時(shí)間血液中均未檢測(cè)到病毒水平，也未檢測(cè)到抗ASFV的抗體，不能抵抗強(qiáng)毒親本ASFV-G毒株的攻擊。Reis等[17]從ASFV Benin97/1分離株缺失了（MGF360-10L，11L，12L，13L，14L）和MGF530/505（MGF530/505-1R，2R and 3R）和中斷基因（MGF360-9L and MGF530/505-4R），命名為BeninΔMGF。BeninΔMGF毒株在豬肺巨噬細(xì)胞中的復(fù)制與親本病毒Benin 97/1和天然弱毒分離株OURT88/3沒(méi)有太大區(qū)別。用BeninΔMGF對(duì)豬進(jìn)行兩次免疫，然后用致死劑量的Benin 97/1進(jìn)行攻擊，所有豬都獲得保護(hù)。他們用不同劑量、不同免疫途徑研究該疫苗的保護(hù)效力，結(jié)果表明，使用高劑量（104TCID5）0的肌肉注射途徑是最佳的免疫選擇。Monteagudo等人[18]以BA71毒株為骨架構(gòu)建了缺失CD2v基因的重組病毒（BA71ΔCD2），該毒株在豬體內(nèi)高度減毒，接種BA71ΔCD2 的豬，不僅可以抵抗親本BA71 的攻擊，而且保護(hù)豬免受異源毒株E75（兩種基因型I株）和Georgia 2007/1（ASFV 基因型Ⅱ株）的攻擊。這表明BA71株CD2v基因缺失后，對(duì)I型和II型ASFV均能提供完全保護(hù)，具有交叉保護(hù)作用。國(guó)內(nèi)學(xué)者以我國(guó)流行的基因II 毒株ASFV HLJ/18為骨架構(gòu)建了系列基因缺失重組毒株，其中HLJ/18-7GD是缺失7個(gè)基因的重組毒株（MGF505-1R、MGF360-12L、MGF360 -13L、MGF360 -14L、MGF505 -2R、MGF505-3R 和CD2v 聯(lián)合缺失），目前，完成了該疫苗的安全性和免疫效力等試驗(yàn)[19]，該疫苗能否進(jìn)入市場(chǎng)還需嚴(yán)格的臨床試驗(yàn)。國(guó)內(nèi)還有研究表明，ASFV-SY18強(qiáng)毒株缺失CD2v 和UK基因后毒力顯著減弱，免疫豬后能夠抵抗親本強(qiáng)毒的攻擊，具有候選疫苗的潛力[20]。通過(guò)同源重組技術(shù)，還有許多敲除ASFV基因組其他位置基因的重組病毒的報(bào)道，但目前為止還沒(méi)商品化的疫苗問(wèn)世。

4 展望

自肯尼亞于1921年首次報(bào)告ASF疫情以來(lái)已有100年的歷史，科學(xué)家對(duì)ASF疫苗的研究從未中斷，近幾十年來(lái)ASF疫苗的研究取得了長(zhǎng)足的進(jìn)步，尤其是分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，對(duì)病毒基礎(chǔ)研究的深入，病毒毒力基因的發(fā)現(xiàn)、參與免疫逃逸基因和具有保護(hù)性抗原的基因的挖掘，對(duì)將來(lái)研究弱毒疫苗、病毒活載體疫苗、亞單位疫苗具有很大的幫助，相信在不久的將來(lái)，安全、有效的ASF疫苗會(huì)進(jìn)入市場(chǎng)，為畜牧業(yè)的健康發(fā)展提供服務(wù)。