不同水平單寧復(fù)合蛋白對黃羽肉雞免疫功能、抗氧化能力以及脂代謝的影響

范秋麗 陳志龍 譚淑君 王君雁 茅沈麗 林澤鈴 蔣守群

(廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 動物科學(xué)研究所/畜禽育種國家重點(diǎn)實驗室/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部華南動物營養(yǎng)與飼料重點(diǎn)實驗室/ 廣東省畜禽育種與營養(yǎng)研究重點(diǎn)實驗室，廣州 510640)

自國內(nèi)禁止飼用促生長類的抗生素以來，各種可作為飼料添加劑的植物提取物的開發(fā)與應(yīng)用已成為研究熱點(diǎn)。其中單寧酸是一類植物提取的多酚化合物，因含酚羥基結(jié)構(gòu)，具有抗氧化、抑菌和抗病毒等生物活性功能：鼠料中添加0.3%和0.6%的單寧酸可升高青春期和成年期布氏田鼠機(jī)體抗氧化能力[1]；250和500 mg/kg單寧酸可降低黃曲霉毒素感染條件下42日齡肉雞盲腸大腸桿菌數(shù)量，提高乳酸桿菌數(shù)量[2]；單寧酸對甲型流感病毒、乳頭瘤病毒、單純皰疹病毒和諾如病毒等均具有生物活性[3]。雖然單寧酸具有以上正向的生物學(xué)功能，但也有研究表明其與唾液蛋白結(jié)合，可在口腔中產(chǎn)生澀味，降低采食量，需與蛋白質(zhì)結(jié)合形成單寧復(fù)合蛋白以緩解此負(fù)面影響[4]。單寧復(fù)合蛋白是天然植物提取的單寧酸和蛋白質(zhì)沉淀結(jié)合形成的復(fù)合物，又名鞣酸蛋白或植物多酚蛋白，外觀呈淡棕色或淡黃色粉末，無臭無味，具有收斂作用，其與腸黏膜表面蛋白凝固形成保護(hù)膜，可緩解腸道刺激、減少滲出，已被開發(fā)為各種產(chǎn)品應(yīng)用于預(yù)防和治療不同原因引起的小兒腸炎和腹瀉[5-6]。目前，在畜牧生產(chǎn)方面，單寧復(fù)合蛋白的應(yīng)用研究主要集中在斷奶仔豬抗腹瀉方面，宋妍妍[7]在研究單寧復(fù)合蛋白在斷奶仔豬上的有效性和耐受性時發(fā)現(xiàn)，0.2%～0.8%單寧復(fù)合蛋白均顯著降低仔豬腹瀉率和腹瀉指數(shù)，但關(guān)于單寧復(fù)合蛋白在肉雞生產(chǎn)中的研究目前尚無報道。因此，本研究以1～48日齡快大型麻黃肉雞為對象，研究了小麥豆粕花生粕型飼糧中添加不同水平的單寧復(fù)合蛋白對其生長性能、血漿生化指標(biāo)、免疫功能、抗氧化能力以及脂代謝的影響，為其在肉雞健康養(yǎng)殖中的應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1日齡快大型麻黃肉公雛購自佛山市某雞苗公司。單寧復(fù)合蛋白有效含量≥85%，由單寧和大豆蛋白在體外沉淀復(fù)合，經(jīng)干燥而成的單寧蛋白復(fù)合物，由肇慶市某生物科技有限公司提供。飼用復(fù)合小麥酶購自武漢某生物股份有限公司。

1.2 試驗設(shè)計

540只初始體重為(40.33±0.05) g且健康狀況良好的1日齡快大型麻黃肉公雛，根據(jù)體重一致原則隨機(jī)分為3個處理組，分別為基礎(chǔ)飼糧添加0、300和500 mg/kg單寧復(fù)合蛋白，每組6個重復(fù)，每個重復(fù)30只，每重復(fù)為1欄。試驗期48 d，分前期1～21日齡、中期22～42日齡和后期43～48日齡3個階段飼養(yǎng)。

1.3 試驗飼糧

試驗飼糧為小麥-豆粕-花生粕型，營養(yǎng)水平參考《黃羽肉雞營養(yǎng)需要量》(NY/T 3645—2020)中的飼料原料營養(yǎng)成分含量和快速型商品黃羽肉雞各生長階段營養(yǎng)需要標(biāo)準(zhǔn)科學(xué)配制，不同處理組相同飼養(yǎng)階段營養(yǎng)水平保持一致(表1)，各階段預(yù)混料中分別添加300 mg/kg飼用復(fù)合小麥酶。

1.4 飼養(yǎng)管理

試驗于2021年12月1日在廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院動物科學(xué)研究所試驗場開展，試雞平養(yǎng)于封閉式雞舍，地面鋪放谷殼，自由采食顆粒料和飲水，各處理組飼養(yǎng)管理和環(huán)境條件一致，每天自然通風(fēng)，保持雞舍清潔衛(wèi)生。按照常規(guī)操作程序和免疫流程進(jìn)行飼養(yǎng)和免疫。每天觀察雞只健康狀況、糞便情況、采食量、死亡只數(shù)、死亡雞重量以及死亡原因，記錄雞舍每天的天氣情況以及8:00、12:00和17:30的溫度、濕度情況。

1.5 樣品采集與制備

2022年1月17日試驗結(jié)束當(dāng)天20:00斷料供水，次日08:00以重復(fù)欄為單位稱肉雞空腹重量，稱重當(dāng)天每欄挑選2只接近平均重的雞翅靜脈采集全血4 mL于加有肝素鈉的抗凝管中，3 500 rpm/min離心10 min，取血漿分裝于0.5 mL離心管中備測血漿生化指標(biāo)、細(xì)胞因子含量、抗氧化指標(biāo)和脂代謝相關(guān)指標(biāo)。

采血后試雞頸部放血致死，剖取空腸，距中間部位10 cm處剪開，磷酸鹽緩沖液沖洗內(nèi)容物后平鋪于干凈的濾紙上，載玻片刮取黏膜組織于1.5 mL滅菌離心管中備測細(xì)胞因子含量。取肝臟組織，每只雞取相同肝臟部位約1 g裝于滅菌的1.5 mL離心管中備測抗氧化和脂代謝相關(guān)指標(biāo)。以上血漿、空腸黏膜組織、肝臟組織樣品采集時置于液氮中速凍，樣品采集結(jié)束后當(dāng)天轉(zhuǎn)移至-80 ℃冰箱保存。

1.6 指標(biāo)測定

1.6.1生長性能指標(biāo)測定

48日齡試驗結(jié)束前1天18:00斷料供水，次日07:00以欄為重復(fù)單位稱重，計算體重(BW)、平均日增重(ADG)、平均日采食量(ADFI)、料重比(F/G)和死亡率(Mortality)等生長性能指標(biāo)，具體計算參考范秋麗等[8]所述方法。

1.6.2血漿生化指標(biāo)測定

采樣結(jié)束后-80 ℃冰箱取出血漿樣品，冰上解凍后測定血漿生化指標(biāo)。谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)、尿酸(UA)、肌酐(Cr)、葡萄糖(GLU)、總膽紅素(TBIL)等血漿生化指標(biāo)測定試劑盒均購買于南京建成生物工程研究所，詳細(xì)測定步驟和結(jié)果計算方法參照試劑盒說明書，各指標(biāo)讀數(shù)均在多功能酶標(biāo)儀(SYNERGY H1，BioTek公司，美國)上操作。

1.6.3血漿和空腸黏膜細(xì)胞因子含量測定

采樣結(jié)束后-80 ℃冰箱取出血漿樣品，冰上解凍后測定血漿細(xì)胞因子含量。γ干擾素(IFN-γ)、腫瘤壞死因子α(TNF-α)、白細(xì)胞介素1β(IL-1β)和白細(xì)胞介素6(IL-6)等血漿細(xì)胞因子測定試劑盒購買于北京方程生物科技有限公司，各指標(biāo)具體測定方法和結(jié)果計算依據(jù)說明書進(jìn)行。

采樣結(jié)束后-80 ℃冰箱取出空腸黏膜樣品，冰上解凍后制備空腸黏膜勻漿液，空腸黏膜10%勻漿液的制備和總蛋白含量的測定參考范秋麗等[8]所述方法，主要用儀器為全自動樣品冷凍研磨儀和離心機(jī)。IFN-γ、TNF-α、IL-1β、IL-6和白細(xì)胞介素22(IL-22)含量測定方法同血漿細(xì)胞因子含量測定方法，各指標(biāo)讀數(shù)均在多功能酶標(biāo)儀上操作。

1.6.4血漿和肝臟抗氧化指標(biāo)測定

采樣結(jié)束后-80 ℃冰箱取出血漿樣品，冰上解凍后測定血漿抗氧化指標(biāo)。血漿微量丙二醛(MDA)和還原型谷胱甘肽(GSH)含量以及總超氧化物歧化酶(T-SOD)活性和總抗氧化能力(T-AOC)的測定參考范秋麗等[8]所述方法，試劑盒均購買于南京建成生物工程研究所。采樣結(jié)束后-80 ℃冰箱取出肝臟樣品，冰上解凍后制備肝臟勻漿液，10%肝臟勻漿液的制備方法和總蛋白含量測定方法同空腸黏膜，抗氧化指標(biāo)測定方法同血漿，各指標(biāo)讀數(shù)均在多功能酶標(biāo)儀上操作。

1.6.5血漿和肝臟脂代謝相關(guān)指標(biāo)測定

采樣結(jié)束后-80 ℃冰箱取出血漿樣品和制備好的10%肝臟勻漿液，測定脂代謝相關(guān)指標(biāo)。血漿和肝臟雌二醇(E2)含量以及脂肪合成酶(FAS)活性試劑盒購自江蘇酶免實業(yè)有限公司，測定步驟和方法參考說明書。甘油三酯(TG)、總膽固醇(TC)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)和低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)含量的測定參考Cui等[9]所述方法，各指標(biāo)讀數(shù)均在多功能酶標(biāo)儀上操作。

1.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

采用SAS 9.2軟件中的GLM程序?qū)υ囼灁?shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析，當(dāng)處理效應(yīng)差異顯著(P<0.05)時進(jìn)行Duncan氏多重比較。各表格中數(shù)據(jù)以平均值和均值標(biāo)準(zhǔn)誤表示。

表1 基礎(chǔ)飼糧原料組成及營養(yǎng)水平(干物質(zhì)基礎(chǔ))Table 1 Ingredients composition and nutrient levels of basal diets (DM basis)

2 結(jié)果與分析

2.1 不同水平的單寧復(fù)合蛋白對1～48日齡黃羽肉雞生長性能的影響

由表2可知，對照組、單寧復(fù)合蛋白1、2組之間肉雞體重、平均日增重、平均日采食量、料重比和死亡率均差異不顯著(P>0.05)。

2.2 不同水平的單寧復(fù)合蛋白對48日齡黃羽肉雞血漿生化指標(biāo)的影響

由表3可知，單寧復(fù)合蛋白1、2組肉雞血漿中ALT酶活性和UA含量均顯著高于對照組(P<0.05)，單寧復(fù)合蛋白2組血漿中GLU含量顯著低于對照組(P<0.05)，單寧復(fù)合蛋白1組血漿中TBIL含量顯著低于對照組(P<0.05)。不同處理組之間肉雞血漿中AST酶活性和Cr含量均差異不顯著(P>0.05)。

表2 不同水平的單寧復(fù)合蛋白對1～48日齡黃羽肉雞生長性能的影響Table 2 Effects of different levels of tannalbin on growth performance of yellow-feathered chickens at 1 to 48 days of age

表3 不同水平的單寧復(fù)合蛋白對48日齡黃羽肉雞血漿生化指標(biāo)的影響Table 3 Effects of different levels oftannalbin on plasma biochemical indices of yellow-feathered chickens at 48 days of age

2.3 不同水平的單寧復(fù)合蛋白對48日齡黃羽肉雞血漿和空腸黏膜細(xì)胞因子含量的影響

由表4可知，與對照組相比，單寧復(fù)合蛋白1組空腸黏膜中IL-1β含量降低，單寧復(fù)合蛋白2組空腸黏膜中IL-1β含量升高，但差異均不顯著(P>0.05)；單寧復(fù)合蛋白1組空腸黏膜中IL-6含量顯著降低(P<0.05)。不同處理組之間血漿中細(xì)胞因子IFN-γ、TNF-α、IL-1β和IL-6含量均差異不顯著(P>0.05)，同時，空腸黏膜中IFN-γ、TNF-α和IL-22含量在不同處理組之間也差異不顯著(P>0.05)。

表4 不同水平的單寧復(fù)合蛋白對48日齡黃羽肉雞血漿和空腸黏膜細(xì)胞因子含量的影響Table 4 Effects of different levels of tannalbin on cytokine content in jejunal mucosa of yellow-feathered chickens at 48 days of age

2.4 不同水平的單寧復(fù)合蛋白對48日齡黃羽肉雞血漿和肝臟抗氧化能力的影響

由表5可知，與對照組相比，單寧復(fù)合蛋白2組肉雞血漿中MDA含量顯著降低，同時肝臟中T-AOC 能力和GSH含量均顯著升高(P<0.05)。不同處理組之間血漿中T-SOD酶活性、T-AOC能力、GSH含量和肝臟中MDA含量以及T-SOD酶活性均差異不顯著(P>0.05)。

表5 不同水平的單寧復(fù)合蛋白對48日齡黃羽肉雞血漿和肝臟抗氧化能力的影響Table 5 Effects of different levels of tannalbin on plasma and liver antioxidant capacity of yellow-feathered chickens at 48 days of age

2.5 不同水平的單寧復(fù)合蛋白對48日齡黃羽肉雞血漿和肝臟脂質(zhì)代謝的影響

由表6可知，與對照組相比，單寧復(fù)合蛋白1、2組肉雞肝臟中E2、TG、TC和LDL-C含量以及FAS活性均顯著降低(P<0.05)。不同處理組之間血漿中E2、TG、TC、LDL-C、HDL-C含量、FAS活性以及肝臟中HDL-C含量均差異不顯著(P>0.05)。

表6 不同水平的單寧復(fù)合蛋白對48日齡黃羽肉雞血漿和肝臟脂質(zhì)代謝的影響Table 6 Effects of different levels of tannalbin on plasma and liver lipid metabolism of yellow-feathered chickens at 48 days of age

3 討 論

3.1 不同水平的單寧復(fù)合蛋白對1～48日齡黃羽肉雞生長性能的影響

雖然形成不同單寧復(fù)合蛋白的單寧酸因來源不同化學(xué)結(jié)構(gòu)也不同，但其與蛋白質(zhì)結(jié)合的性質(zhì)是統(tǒng)一的，且在動物腸道內(nèi)主要由單寧酸發(fā)揮生理功能[10]。單寧酸能夠減緩腸道蠕動，增加飼料在動物腸道內(nèi)的停留時間，在一定程度上緩解了由于單寧酸與消化酶或多糖結(jié)合，減少了腸道對飼糧中養(yǎng)分消化吸收的不利影響[11]。宋妍妍[7]研究單寧復(fù)合蛋白在斷奶仔豬上的有效性和耐受性，結(jié)果表明，0.1%～0.8%單寧復(fù)合蛋白對生長性能影響不顯著。李軍輝等[12]研究飼糧分別添加200和400 mg/kg單寧酸對1～42日齡AA肉雞影響，結(jié)果表明，單寧酸的添加對生長性能影響不顯著。本研究結(jié)果顯示，不同水平單寧復(fù)合蛋白對1～48日齡肉雞生長性能影響不顯著，此結(jié)果與前人研究結(jié)果一致，說明單寧復(fù)合蛋白在改善肉雞生長性能方面無顯著效果。

3.2 不同水平的單寧復(fù)合蛋白對48日齡黃羽肉雞血漿生化指標(biāo)的影響

血液生化指標(biāo)可在一定程度上反映營養(yǎng)物質(zhì)在機(jī)體中的代謝情況[13]。ALT酶和AST酶均在肝細(xì)胞漿中合成，其活性的高低可用來評估機(jī)體肝臟的損傷情況，當(dāng)肝細(xì)胞受到損壞時，此兩者酶在血液中活性增加[14]。Zhang等[2]研究表明，250和500 mg/kg單寧酸可分別降低黃曲霉毒素B1誘導(dǎo)下21和42日齡肉雞血漿中ALT酶活性。Mansoori等[15]研究表明，20 g/kg單寧酸可降低肉雞血清中ALT酶和AST酶活性。本研究結(jié)果顯示，相比300 mg/kg單寧復(fù)合蛋白，500 mg/kg單寧復(fù)合蛋白的添加可顯著升高48日齡肉雞血漿中ALT酶活性，與前人研究結(jié)果不同之處可能與添加物的有效成分含量和試驗處理方法不同有關(guān)。UA是禽類嘌呤代謝的終產(chǎn)物，其濃度的高低反映了動物體內(nèi)蛋白質(zhì)和氨基酸的平衡狀況[16]。本研究結(jié)果顯示，300和500 mg/kg單寧復(fù)合蛋白的添加均顯著升高了肉雞血漿UA含量，此結(jié)果與宋妍妍[7]研究的0.8%的單寧復(fù)合蛋白顯著降低斷奶仔豬粗蛋白質(zhì)消化率結(jié)果相似，說明本試驗條件下，單寧復(fù)合蛋白的添加使肉雞體內(nèi)蛋白質(zhì)代謝受到抑制。血液GLU、Cr和TBIL含量升高，機(jī)體對葡萄糖的代謝減緩，且腎臟和肝臟存在一定程度代謝障礙，導(dǎo)致機(jī)體無法代謝肌酐和膽紅素，從而使其在血液中含量增加[17]。茍昌勇[18]研究了700、1 200和1 700 mg/kg五倍子單寧酸對斷奶仔豬的影響，結(jié)果表明，不同水平的單寧酸對血清GLU含量影響不顯著。本研究結(jié)果顯示，500 mg/kg單寧復(fù)合蛋白顯著降低了血漿GLU含量，同時300 mg/kg單寧復(fù)合蛋白降低了血漿TBIL含量，說明不同水平的單寧復(fù)合蛋白對肉雞養(yǎng)分代謝均有一定的負(fù)面影響，但高劑量的單寧復(fù)合蛋白可改善肉雞糖代謝。

3.3 不同水平的單寧復(fù)合蛋白對48日齡黃羽肉雞免疫功能的影響

炎癥反應(yīng)是正常免疫反應(yīng)的重要組成部分，是機(jī)體對病原微生物感染、創(chuàng)傷和變態(tài)反應(yīng)等發(fā)生的細(xì)胞反應(yīng)，其中促炎細(xì)胞因子如IFN-γ、TNF-α、IL-1β、IL-6和抗炎細(xì)胞因子如IL-10、IL-22的平衡反映了炎癥反應(yīng)的凈效應(yīng)[19]，促炎細(xì)胞因子升高，炎癥反應(yīng)增強(qiáng)，機(jī)體免疫功能下降[20]。研究表明，單寧酸降低炎癥反應(yīng)的途徑主要有2種：一種是抑制炎癥信號通路和肥大細(xì)胞的活化[21-22]；另一種是單寧酸與腸道內(nèi)蛋白質(zhì)結(jié)合，對黏膜形成保護(hù)屏障，從而降低組織損傷和炎癥反應(yīng)[23]。Kawano等[24]體外研究表明，單寧酸通過減少結(jié)腸免疫細(xì)胞分泌IFN-γ和IL-1β抑制結(jié)腸炎炎癥反應(yīng)。本研究結(jié)果顯示，300 mg/kg單寧復(fù)合蛋白可降低48日齡肉雞空腸黏膜促炎細(xì)胞因子IL-1β和IL-6含量，說明單寧復(fù)合蛋白可通過抑制炎癥反應(yīng)提高肉雞免疫功能，但有關(guān)作用機(jī)理還需進(jìn)一步探究。

3.4 不同水平的單寧復(fù)合蛋白對48日齡黃羽肉雞抗氧化能力的影響

機(jī)體的酶促抗氧化系統(tǒng)和非酶促抗氧化系統(tǒng)可避免因外源性和內(nèi)源性自由基的攻擊對機(jī)體造成的損傷，其中T-SOD、T-AOC和GSH是酶抗氧化系統(tǒng)的組成部分[25]。因單寧酸含多元酚羥基結(jié)構(gòu)，可通過提供氫離子和調(diào)控細(xì)胞Nrf2/ARE信號通路有效地清除自由基[26-27]，所以，可判斷單寧復(fù)合蛋白也具有抗氧化功能。研究表明，0.4%的單寧復(fù)合蛋白可提高斷奶仔豬血清中過氧化氫(CAT)酶活性，同時2%單寧復(fù)合蛋白可降低回腸黏膜中MDA含量[7]。本研究結(jié)果顯示，500 mg/kg單寧復(fù)合蛋白可降低血漿中MDA含量，同時升高肝臟中T-AOC酶活性和GSH含量，此結(jié)果與魏海峰等[28]在患有糖尿病大鼠上的研究結(jié)果相似，單寧酸可通過降低大鼠血清和腎臟MDA含量，升高T-SOD酶和CAT酶活性提高糖尿病大鼠抗氧化能力。同時，本研究中300和500 mg/kg單寧復(fù)合蛋白對肝臟T-SOD活性有升高的趨勢，說明單寧復(fù)合蛋白的添加可提高肉雞總抗氧化能力，且高劑量組效果優(yōu)于低劑量組。

3.5 不同水平的單寧復(fù)合蛋白對48日齡黃羽肉雞脂質(zhì)代謝的影響

肝臟是禽類脂肪代謝的重要場所，肝臟中TG、TC、HDL-C和LDL-C含量可作評價機(jī)體脂肪代謝的重要指標(biāo)，且多酚類化合物可通過降低雌激素維持的高血脂作用，達(dá)到降脂目的[29]。聶方園[30]研究發(fā)現(xiàn)，單寧酸可抑制細(xì)胞內(nèi)脂肪酸合酶的活力及表達(dá)，同時抑制細(xì)胞活力，從而調(diào)控脂代謝。本研究結(jié)果顯示，300和500 mg/kg單寧復(fù)合蛋白均可顯著降低肝臟中雌二醇含量和脂肪合成酶活性，與上述研究結(jié)果相似。曾麗榮[31]研究表明，50和150 mg/kg/d單寧酸以劑量依賴性顯著降低高脂飲食小鼠肝臟和脂肪組織重量，同時降低血清TG、TC、HDL-C和LDL-C含量。本研究結(jié)果顯示，300和500 mg/kg單寧復(fù)合物均可顯著降低48日齡肉雞肝臟中TG、TC和LDL-C含量，與前人研究結(jié)果相似，說明單寧復(fù)合蛋白可通過降低肝臟內(nèi)雌二醇含量和脂肪酶合成酶活性調(diào)節(jié)肉雞脂代謝，但300 mg/kg單寧復(fù)合蛋白和500 mg/kg單寧復(fù)合蛋白在調(diào)節(jié)脂代謝方面的效果差異不顯著。

4 結(jié) 論

①小麥豆粕型飼糧添加不同水平的單寧復(fù)合蛋白對1～48日齡快大型黃羽肉雞生長性能影響不顯著。

②綜合生長性能、免疫功能和脂代謝相關(guān)指標(biāo)，本試驗條件下，小麥豆粕型飼糧中單寧復(fù)合蛋白的適宜添加量為300 mg/kg。