檸檬色百合實時熒光定量PCR內(nèi)參基因篩選

梁 蕤 徐雷鋒 畢蒙蒙 王 靜 唐玉超 郝澤慧,4 劉一潔,5 楊盼盼 明 軍* 杜 方

(1.山西農(nóng)業(yè)大學(xué) 園藝學(xué)院，山西 太谷 030801； 2.山西農(nóng)業(yè)大學(xué) 城鄉(xiāng)建設(shè)學(xué)院，山西 太谷 030801； 3.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院 蔬菜花卉研究所，北京 100081； 4.北京農(nóng)學(xué)院 園林學(xué)院，北京 102206； 5.青島農(nóng)業(yè)大學(xué) 園林與林學(xué)院，山東 青島 266109)

花色是觀賞園藝植物最重要的觀賞性狀之一，其主要由類黃酮、類胡蘿卜素、甜菜色素和葉綠素這4大類化合物構(gòu)成，其中，類黃酮和類胡蘿卜素是百合花色的主要呈色物質(zhì)[1]。相比于類黃酮代謝研究，類胡蘿卜素代謝研究較少[2-3]，且類胡蘿卜素代謝更為復(fù)雜。類胡蘿卜素既作為色素在花和果實中積累呈色，也參與光合作用，參與植物生長發(fā)育和調(diào)控激素水平[4]。產(chǎn)自日本的檸檬色百合(Liliumleichtlinii)屬于百合科百合屬，其花被片背景富含類胡蘿卜素呈檸檬黃色，花1～5朵下垂，開放時花被片向上反卷，具有極高的觀賞價值，是研究百合類胡蘿卜素花色呈色機(jī)理的優(yōu)選材料[5]。

在以檸檬色百合為試驗材料揭示百合類胡蘿卜素分子調(diào)控機(jī)理的過程中，檢測類胡蘿卜素代謝關(guān)鍵基因表達(dá)是必不可少的環(huán)節(jié)。常規(guī)檢測基因表達(dá)的方法有Northern雜交(Northern blotting)、半定量RT-PCR(Semi-quantitative reverse transcription polymerase chain reaction)、實時熒光定量PCR(Reverse transcription real-time polymerase chain reaction， qRT-PCR)、微陣列分析(Microarrays analysis)、轉(zhuǎn)錄組測序(RNA sequencing)和原位雜交(In situ hybridization， ISH)等[6-7]。其中qRT-PCR技術(shù)憑借其高準(zhǔn)確度、高靈敏度、高通量和操作方便等優(yōu)點被廣泛應(yīng)用[8]，該技術(shù)支持絕對定量分析和相對定量分析。絕對定量常用來探究單個樣品的本質(zhì)屬性，相對定量常用來比較多個樣本間某一特定性質(zhì)[6,9]。試驗中通常運用相對定量探究不同樣本間同一基因表達(dá)情況。相對定量分析的準(zhǔn)確性受到RNA質(zhì)量和完整性、反轉(zhuǎn)錄效率和擴(kuò)增效率等因素的影響[10]。因此，需要使用1個或多個穩(wěn)定內(nèi)參基因(Reference genes)對目的基因的表達(dá)進(jìn)行均一化[11-13]。

內(nèi)參基因指的是在各個樣品中表達(dá)恒定的基因[14]，其穩(wěn)定性和可靠性直接關(guān)系到目的基因表達(dá)檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性和整體試驗研究的可靠性。在不同百合種(品種)、花發(fā)育過程、花被片不同部位、不同器官及不同處理下，大多使用Actin或GAPDH(Glyceraldehyde-3-phosphatedehydrogenase)作為內(nèi)參基因[15-20]；在研究百合體細(xì)胞胚的生長發(fā)育過程時也用到FP(F-boxfamilyprotein)作為內(nèi)參基因[21]。但幾種常用內(nèi)參基因在百合不同組織器官間、花發(fā)育過程、花遮光處理及葉、鱗片和根脅迫處理中的穩(wěn)定性是可能變化的。因此，具體百合種(品種)及研究條件下仍需重新篩選穩(wěn)定適宜的內(nèi)參基因[22-23]。

本研究根據(jù)前期建立的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫和已報道的百合內(nèi)參基因，選取了9個候選內(nèi)參基因，使用geNorm、NormFinder、ΔCT、Bestkeeper程序和RefFinder網(wǎng)站比較分析這9個候選內(nèi)參基因在檸檬色百合花被片發(fā)育過程和不同器官間的表達(dá)情況，并對候選內(nèi)參基因穩(wěn)定性進(jìn)行評估排序。為檢驗內(nèi)參基因評估的準(zhǔn)確性，本研究以篩選出最穩(wěn)定的內(nèi)參基因和最不穩(wěn)定的內(nèi)參基因作為參照，檢測了八氫番茄紅素酶基因PSY(Phytoenesynthase)表達(dá)情況。PSY作為類胡蘿卜素代謝途徑的第1個限速酶，在植物花、葉、果實和根等不同器官中PSY基因表達(dá)的情況直接決定總類胡蘿卜素含量的積累[16,24-27]。因此，本試驗將PSY基因在檸檬色百合花被片發(fā)育過程和不同器官間表達(dá)情況與對應(yīng)的總類胡蘿卜素含量變化趨勢結(jié)合，用來驗證候選內(nèi)參基因的穩(wěn)定性。本研究旨在綜合多個程序網(wǎng)站評估候選內(nèi)參基因穩(wěn)定性，通過檢測總類胡蘿卜素積累和PSY基因表達(dá)驗證內(nèi)參基因穩(wěn)定性，最終確定檸檬色百合花被片發(fā)育過程和不同器官間適宜穩(wěn)定的內(nèi)參基因，以期為百合類胡蘿卜素的研究提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

以檸檬色百合(L.leichtlinii)為試驗材料，種植于中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜花卉研究所資源圃內(nèi)。依照花蕾顏色變化和花被片發(fā)育2項指標(biāo)進(jìn)行取材?；ū黄l(fā)育第1時期(S1)：花色轉(zhuǎn)變前期，花蕾長約5.5 cm，整體呈綠色，取其綠偏黃色內(nèi)花被片作為試材；花被片發(fā)育第2時期(S2)：花開放前一天，花蕾整體柔軟、不緊實，呈鮮艷檸檬黃色，花蕾中部膨大，有張開趨勢，取其檸檬黃色內(nèi)花被片作為試材；花被片發(fā)育第3時期(S3)：花開放當(dāng)天，花被片向上反卷，取其反卷的檸檬黃色內(nèi)花被片作為試材(圖1(a)～(c))。同時，取開放當(dāng)天內(nèi)花被片、葉、莖、鱗片和根作為不同器官試驗材料(圖1(d)～(h))。每個樣品設(shè)3個生物學(xué)重復(fù)，樣品經(jīng)液氮速凍后存于-80 ℃超低溫冰箱備用。

(a)第1時期，花色轉(zhuǎn)變前期；(b)第2時期，花開放前一天；(c)第3時期，花開放當(dāng)天；(d)花；(e)葉；(f)莖；(g)外層鱗片；(h)根。標(biāo)尺=2 cm。(a) Stage 1， early phase of color transition； (b) Stage 2，the day before anthesis； (c) Stage 3， 0 day post-anthesis； (d) Flower； (e) Leaf； (f) Stem； (g) The outer scale； (h) Root. Scale=2 cm.圖1 檸檬色百合不同發(fā)育時期的花和不同器官Fig.1 Flowers in different developmental stages and different tissues of Lilium leichtlinii

1.2 總類胡蘿卜素含量測定

將超低溫保存的檸檬色百合內(nèi)花被片、葉、莖、鱗片和根樣品冷凍干燥后用研磨儀研磨，稱取0.015 g干樣溶于1 mL提取液(V(正己烷)∶V(丙酮)∶V(乙醇)=2∶1∶1)，包含質(zhì)量濃度為0.01%的2,6-二叔丁基對甲酚(BHT))中，渦旋30 s，置于25 ℃超聲波清洗儀振蕩20 min；之后4 ℃離心5 min(12 000 r/min)，收集上清避光保存。對沉淀重復(fù)上述步驟，收集上清，用提取液定容至5 mL，用0.22 μm有機(jī)濾膜過濾后，取3 mL于紫外分光光度計440、645和663 nm波長下檢測吸光值，每個樣品3個生物學(xué)重復(fù)[28]?？傤惡}卜素含量根據(jù)莫玉楠等[29]的方法進(jìn)行計算。

1.3 候選內(nèi)參基因選擇及引物序列

文獻(xiàn)檢索分析Li等[22]和Xu等[23]合成的百合內(nèi)參基因引物：AP-4complexsubunit(AP4)(NCBI登錄號：KP861878)、Beta-tubulin1(β-TUB)(NCBI登錄號：KP861875)、Cyclophilin(CYP)、Eukaryoticinitiationfactor1(eIF)(NCBI登錄號：KP861874)、Glyceraldehyde-3-phosphatedehydrogenase1(GAPDH)(NCBI登錄號：KP179417.1)、DEADboxRNAhelicase(RH2)(NCBI登錄號：KP861880)和18SRibosomalRNA(18S)(NCBI登錄號：AY684927.1)。同時在已有檸檬色百合轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫中對所有Unigene不同樣本的fpkm值進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)差分析，在fpkm值高且標(biāo)準(zhǔn)差小的Unigene中搜索常用內(nèi)參基因，最終篩選出Actin2(Actin)(NCBI登錄號：OP539310)和Ubiquitin-conjugatingenzymeE22(UBC)(NCBI登錄號：OP539311)2個常用內(nèi)參基因，所有內(nèi)參基因引物序列如表1所示。PSY引物序列參照Wang等[16]的設(shè)計(F：CCAGAGTCCC-GTGCATCGAC；R：ATATCGTCCTCTGAAAG-GCC)。引物由上海生工生物工程股份有限公司合成。

表1 候選內(nèi)參基因qRT-PCR的引物序列和擴(kuò)增參數(shù)Table 1 Primer sequences and amplification parameters for candidate reference genes

1.4 總RNA提取和cDNA第1鏈合成

使用RNAprep Pure多糖多酚植物總RNA提取試劑盒(天根生化有限公司)提取檸檬色百合內(nèi)花被片、葉、莖、鱗片和根的RNA，并將不同樣本的RNA均稀釋為相同濃度(110.0 ng/μL)，使用Hifair?II 1 st Strand cDNA Synthesis SuperMix for qPCR(gDNA digester plus)(翊圣生物科技股份有限公司)進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，用EASY Dilution(for Real Time PCR)(Takara)進(jìn)行cDNA稀釋。為檢測引物擴(kuò)增效率，將葉的cDNA原液依次稀釋5倍并設(shè)置5個濃度梯度，分別為葉cDNA原液的5-1、5-2、5-3、5-4和5-5倍。將不同樣本cDNA原液稀釋5倍使用，每個樣本均為3個生物學(xué)重復(fù)。

1.5 候選內(nèi)參基因RT-PCR擴(kuò)增和qRT-PCR反應(yīng)

以檸檬色百合葉cDNA為模板，進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增體系為：總體積10.0 μL，其中2×Taq PCR MasterMix 5.0 μL，primer-F(10 μM)0.5 μL，primer-R(10 μM)0.5 μL，cDNA 1.0 μL，ddH2O 3.0 μL。反應(yīng)條件為：94 ℃初始變性5 min，94 ℃變性30 s，56 ℃退火30 s；72 ℃延伸20 s，35個循環(huán)，72 ℃最后延伸10 min。得到的PCR產(chǎn)物經(jīng)2.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測，在BIO-RAD凝膠成像儀觀察拍照。

以檸檬色百合葉5個濃度梯度的cDNA及不同樣本cDNA為模板，在BIO-RAD CFX96實時熒光定量PCR儀中對不同內(nèi)參基因及PSY基因進(jìn)行三步法熒光定量。擴(kuò)增體系：總體積20.0 μL，其中qPCR SYBR?Green Master Mix 10.0 μL，primer-F(10 μM)0.4 μL， primer-R(10 μM)0.4 μL，cDNA 2.0 μL，ddH2O 7.2 μL。反應(yīng)條件為：95 ℃預(yù)變性5 min，95 ℃變性10 s，56 ℃退火20 s，72 ℃延伸30 s，40個循環(huán)。熔解曲線程序為：65 ℃～95 ℃每5 s升溫0.5 ℃。

反應(yīng)結(jié)束后由CFX Manager軟件生成熔解曲線，根據(jù)熔解曲線分析候選內(nèi)參基因引物特異性。根據(jù)各內(nèi)參基因在不同檸檬色百合葉cDNA梯度下CT值繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線并計算斜率(k)、擴(kuò)增效率(E)和線性相關(guān)系數(shù)(R2)，利用CFX Manager軟件Gene Study程序中Pfaffl方法計算基于單個內(nèi)參基因的PSY相對表達(dá)量，運用Vandesomple方法計算基于多個內(nèi)參基因的PSY相對表達(dá)量，使用SPSS分析PSY相對表達(dá)情況與總類胡蘿卜素積累間斯皮爾曼相關(guān)性。

1.6 數(shù)據(jù)分析及候選內(nèi)參基因穩(wěn)定性評價

整理全部樣本中候選內(nèi)參基因CT值，使用geNorm、NormFinder、ΔCT、Bestkeeper 程序和RefFinder網(wǎng)站(https:∥www.heartcure.com.au/reffinder/?type=reference)分析檸檬色百合花被片發(fā)育過程和不同器官間候選內(nèi)參基因的表達(dá)穩(wěn)定性。

geNorm程序?qū)⒀h(huán)數(shù)轉(zhuǎn)換為基因相對表達(dá)量，即將所有CT值轉(zhuǎn)換為2ΔCT(ΔCT=各CT值-最小CT值)，通過計算候選內(nèi)參基因表達(dá)穩(wěn)定值(M)來評估。M值與穩(wěn)定性呈負(fù)相關(guān)，M值越小，穩(wěn)定性越高，若M值超過1.5即認(rèn)定該基因不適合作內(nèi)參基因。之后計算出標(biāo)準(zhǔn)化所需的最佳內(nèi)參基因數(shù)量，程序默認(rèn)值為Vn/(n+1)=0.15，當(dāng)Vn/(n+)<0.15，選擇n個內(nèi)參基因用于標(biāo)準(zhǔn)化[30]。

NormFinder與geNorm相似，根據(jù)表達(dá)穩(wěn)定值進(jìn)行穩(wěn)定性排序，但只能選出1個穩(wěn)定內(nèi)參基因[31]。

ΔCT方法是比較成對基因在不同樣本中ΔCT值，若在所有樣本中這2個基因ΔCT值保持不變，則認(rèn)為這2個基因在這些樣本中穩(wěn)定表達(dá)；若ΔCT變化，則表明其中1個基因或2個基因都表達(dá)不穩(wěn)定。如此計算，最終根據(jù)結(jié)果進(jìn)行穩(wěn)定性排序[32]。

Bestkeeper程序首先根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)偏差(SD)和變異系數(shù)(CV)對內(nèi)參基因表達(dá)穩(wěn)定性進(jìn)行評估，從低到高依次進(jìn)行穩(wěn)定性排序。其中SD>1即視為不穩(wěn)定內(nèi)參基因，同時將所有輸入候選內(nèi)參基因組成1個Bestkeeper指數(shù)，計算每個候選內(nèi)參基因和Bestkeeper指數(shù)之間的相關(guān)性，通過皮爾遜相關(guān)系數(shù)(r)、決定系數(shù)(r2)和顯著水平P值(P)描述候選內(nèi)參基因與Bestkeeper指數(shù)之間的關(guān)系[14]。

最后依托RefFinder在線網(wǎng)站基于以上4個程序結(jié)果，給每個候選內(nèi)參基因分配1個適當(dāng)權(quán)重，并計算它們權(quán)重的幾何平均值，以獲得最終的整體排名[33]。

2 結(jié)果與分析

2.1 總類胡蘿卜素含量

在檸檬色百合花被片中，隨著生長發(fā)育，花被片背景顏色由綠變黃，積累的總類胡蘿卜素含量增加(圖2(a))；檸檬色百合葉子為綠色，莖和鱗片表面附著淺紫色，根為乳白色，總類胡蘿卜素在不同器官間積累依次為：花被片>葉>莖>根>鱗片，且根和鱗片中含量極少(圖2(b))。

2.2 引物特異性及擴(kuò)增效率

以檸檬色百合葉cDNA為模板，用9個候選內(nèi)參基因的引物進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增，電泳圖顯示片段大小正確，條帶單一，均無引物二聚體(圖3(a))。以5個濃度梯度的檸檬色百合葉cDNA 為模板，進(jìn)行qRT-PCR反應(yīng)，結(jié)果顯示，熔解曲線均為單一信號峰，且同一樣品重復(fù)性好，表明9個候選內(nèi)參基因引物特異性高(圖3(b)～(j))。根據(jù)qRT-PCR反應(yīng)所得CT值繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，9個候選內(nèi)參基因的相關(guān)系數(shù)R2介于0.988 4～0.997 0之間，擴(kuò)增效率介于91.02%～102.98%之間(表1)。

同一圖中不同字母表示差異顯著(P<0.050)，相同字母表示差異不顯著(P>0.050)。 Within the same graph, different letters represent significant differences (P<0.050)， while the same letters represent no significant differences (P>0.050).圖2 總類胡蘿卜素含量Fig.2 Total carotenoid content

2.3 表達(dá)水平分析

利用所有樣本中得到的CT值可以預(yù)測9個候選內(nèi)參基因的表達(dá)水平。CT值越低，表達(dá)豐度越高，9個候選內(nèi)參基因在花被片發(fā)育過程和不同器官間的CT值分布見圖4。結(jié)果表明：18S表達(dá)豐度最高，eIF和UBC的表達(dá)水平變異最小。

2.4 穩(wěn)定性分析

將geNorm和NormFinder結(jié)果按照M值排序，ΔCT結(jié)果按照平均標(biāo)準(zhǔn)偏差排序。Bestkeeper結(jié)果中，按SD從小到大、CV從低到高依次進(jìn)行穩(wěn)定性排序，同時考慮候選內(nèi)參基因與Bestkeeper指數(shù)間r和P值。若2個內(nèi)參基因間SD值相近、CV值也相近，則將r值低的內(nèi)參基因排在后面；若候選內(nèi)參基因SD>1則視為不穩(wěn)定內(nèi)參基因，候選內(nèi)參基因與Bestkeeper指數(shù)間P>0.05也視為不穩(wěn)定內(nèi)參基因(表2)。

由于不同程序算法不同，所得結(jié)果并不一致，用RefFinder網(wǎng)站對上述程序結(jié)果進(jìn)行綜合分析確定最終內(nèi)參基因穩(wěn)定性排序。

2.4.1檸檬色百合花被片發(fā)育過程中候選內(nèi)參基因穩(wěn)定性分析

檸檬色百合花被片發(fā)育過程所得Bestkeeper結(jié)果中，雖然UBC的SD最小，CV最低，但其與相應(yīng)Bestkeeper指數(shù)相關(guān)系數(shù)的P值為0.507，遠(yuǎn)大于0.050，表明UBC與Bestkeeper指數(shù)不相關(guān)；而其余8個候選內(nèi)參基因與Bestkeeper指數(shù)相關(guān)系數(shù)的P值均為0.001，r值在0.876～0.996之間，表明這8個候選內(nèi)參基因與Bestkeeper指數(shù)間相關(guān)性強(qiáng)且呈極顯著相關(guān)。說明在檸檬色百合花被片發(fā)育過程中，UBC與其它候選基因存在較大差異，不適合作內(nèi)參基因。CYP的SD值>1.00，為不穩(wěn)定內(nèi)參基因(表2)。

geNorm計算最穩(wěn)定的內(nèi)參基因為AP4和β-TUB(圖5(a))，NormFinder計算最穩(wěn)定的內(nèi)參基因為β-TUB(圖5(c))，ΔCT計算最穩(wěn)定的內(nèi)參基因為Actin(圖5(d))，Bestkeeper計算最穩(wěn)定的內(nèi)參基因為eIF(表2)，綜合以上4個程序的結(jié)果判斷最不穩(wěn)定的內(nèi)參基因為UBC。geNorm程序默認(rèn)Vn/(n+1)=0.15，檸檬色百合花被片發(fā)育過程中計算得V2/3配對變異系數(shù)為0.06，小于0.15，故檸檬色百合花被片發(fā)育過程中熒光定量標(biāo)準(zhǔn)化所需的最佳內(nèi)參基因數(shù)為2(圖5(b))。RefFinder綜合以上4個程序分析結(jié)果，計算得檸檬色百合花被片發(fā)育過程最穩(wěn)定的內(nèi)參基因為Actin和AP4(表3)。

2.4.2檸檬色百合不同器官間候選內(nèi)參基因穩(wěn)定性分析

檸檬色百合不同器官間所得Bestkeeper計算結(jié)果中，9個候選基因與相應(yīng)Bestkeeper指數(shù)間顯著相關(guān)。β-TUB和18S的SD>1.00，為不穩(wěn)定內(nèi)參基因(表2)。geNorm計算最穩(wěn)定的內(nèi)參基因為AP4和Actin(圖6(a))，NormFinder和ΔCT計算最穩(wěn)定的內(nèi)參基因為eIF(圖6(c)和(d))，Bestkeeper計算最穩(wěn)定的內(nèi)參基因為AP4(表2)。geNorm程序計算的V2/3配對變異系數(shù)為0.15，故至少需要2個內(nèi)參基因用于檸檬色百合不同器官間標(biāo)準(zhǔn)化(圖6(b))。根據(jù)RefFinder綜合分析，計算得檸檬色百合不同器官間最穩(wěn)定的內(nèi)參基因為eIF和AP4，最不穩(wěn)定的內(nèi)參基因為18S(表3)。

RFU：相對熒光定量值。RFU: Relative fluorescence units.圖3 候選內(nèi)參基因引物特異性Fig.3 Amplification specificity of primers

中間橫線表示中位數(shù)。 The middle horizontal line is the median.圖4 9個候選內(nèi)參基因的CT值分布圖Fig.4 Distribution of CT values of candidate reference genes in all samples

表2 Bestkeeper分析候選內(nèi)參基因穩(wěn)定性Table 2 Expression stability values of candidate reference genes calculated by Bestkeeper

將以上程序和網(wǎng)站計算的9個候選內(nèi)參基因在檸檬色百合花被片發(fā)育過程與不同器官間表達(dá)穩(wěn)定性由高到低排序(表3)。

2.5 檢測PSY基因表達(dá)驗證內(nèi)參基因穩(wěn)定性

在檸檬色百合花被片發(fā)育過程中，以穩(wěn)定的Actin和AP4分別或共同作為內(nèi)參基因?qū)SY基因相對表達(dá)量進(jìn)行計算(圖7(a)～(c))。結(jié)果表明，隨著花被片發(fā)育，PSY基因表達(dá)逐漸升高，變化趨勢和總類胡蘿卜素含量變化趨勢一致。而以最不穩(wěn)定的UBC作為內(nèi)參基因計算時，在S1中，PSY基因表達(dá)最高且S3中PSY表達(dá)最低，與以Actin和AP4作為內(nèi)參基因計算的結(jié)果相反(圖7(d))。該結(jié)果再次證實檸檬色百合花被片發(fā)育過程中UBC不適合作為內(nèi)參基因。

圖5 不同程序分析花被片發(fā)育過程中候選內(nèi)參基因穩(wěn)定性Fig.5 Expression stability values of candidate reference genes analyzed by different applications in tepals at different developmental stages

在檸檬色百合不同器官間，以表達(dá)穩(wěn)定的eIF和AP4單獨或共同作為內(nèi)參基因?qū)SY基因進(jìn)行相對表達(dá)量計算(圖7(e)～(g))。結(jié)果顯示，PSY基因表達(dá)的總體趨勢與總類胡蘿卜素積累的趨勢相同，表達(dá)情況由高到低依次為花被片、葉、莖、根和鱗片。用最不穩(wěn)定的18S作為內(nèi)參基因進(jìn)行計算，PSY表達(dá)情況與總類胡蘿卜素積累趨勢有所不同，表達(dá)量由高到低依次為花被片、莖、葉、根和鱗片(圖7(h))。

同時，利用SPSS做PSY基因表達(dá)與總類胡蘿卜素含量斯皮爾曼相關(guān)性分析(表4)。結(jié)果顯示，在檸檬色百合花被片發(fā)育過程中，以Actin和AP4單獨或綜合作為內(nèi)參基因計算所得PSY基因表達(dá)情況與總類胡蘿卜素含量呈極顯著正相關(guān)，以UBC為內(nèi)參基因計算所得PSY基因表達(dá)情況與總類胡蘿卜素含量呈極顯著負(fù)相關(guān)。在檸檬色百合不同器官間，以eIF和AP4單獨或綜合作為內(nèi)參基因計算所得PSY基因表達(dá)與總類胡蘿卜素含量呈極顯著正相關(guān)，以18S為內(nèi)參基因計算所得PSY基因表達(dá)情況與總類胡蘿卜素含量呈顯著正相關(guān)。

3 討 論

3.1 使用穩(wěn)定表達(dá)內(nèi)參基因是獲得準(zhǔn)確基因表達(dá)結(jié)果的關(guān)鍵

在花被片發(fā)育過程中，‘Tiny Padhye’百合中TIP41和Actin穩(wěn)定性高[23]，而本研究檸檬色百合中，Actin和AP4穩(wěn)定性高；在不同器官和組織間，Liliumdavidiivar.unicolor中Actin、GAPDH和UBQ穩(wěn)定性高[22]，‘Tiny Padhye’中Actin、Actin11和EF1-α穩(wěn)定性高[23]，本研究中檸檬色百合eIF和AP4穩(wěn)定性高。由此可見，不同品種的百合在相同試驗條件下的最佳穩(wěn)定內(nèi)參基因有所不同。

圖6 不同程序分析不同器官間候選內(nèi)參基因穩(wěn)定性Fig.6 Expression stability values of candidate reference genes analyzed by different applications in different tissues

本研究為驗證候選內(nèi)參基因評估結(jié)果的準(zhǔn)確性，不僅基于穩(wěn)定的內(nèi)參基因探究PSY表達(dá)情況，同時也基于不穩(wěn)定的內(nèi)參基因?qū)SY表達(dá)進(jìn)行計算。結(jié)果表明，無論是在檸檬色百合花被片發(fā)育過程中還是不同器官間，單獨使用穩(wěn)定性差的內(nèi)參基因會導(dǎo)致結(jié)果不準(zhǔn)確。在檸檬色百合花被片發(fā)育過程中，使用穩(wěn)定性差的UBC作為內(nèi)參基因計算所得結(jié)果與使用穩(wěn)定性高的內(nèi)參基因Actin和AP4計算結(jié)果相反；在不同器官間使用穩(wěn)定性差的18S作為內(nèi)參基因計算時，莖中PSY表達(dá)高于葉中，與實際情況相反。因此，在進(jìn)行基因表達(dá)分析時，為了得到準(zhǔn)確結(jié)果需要先進(jìn)行穩(wěn)定內(nèi)參基因的篩選。

3.2 內(nèi)參基因穩(wěn)定性評估需綜合多個方法分析并進(jìn)行試驗驗證

在進(jìn)行內(nèi)參基因穩(wěn)定性評估時，不同程序得到的結(jié)果并不相同，這是因為不同程序基于不同的算法和假設(shè)。geNorm程序建立在候選內(nèi)參基因間無共表達(dá)的條件下展開，計算每一個候選內(nèi)參基因與其他候選內(nèi)參基因兩兩間變異系數(shù)，將這些變異系數(shù)的平均值定義為該基因的表達(dá)穩(wěn)定值[30]；NormFinder是結(jié)合組內(nèi)方差與組間方差計算候選內(nèi)參基因的穩(wěn)定值[31]；ΔCT方法將所有候選內(nèi)參基因兩兩組對為“基因?qū)Α?，比較“基因?qū)Α痹诓煌瑯颖鹃g的相對表達(dá)[32]；Bestkeeper程序是對每個候選內(nèi)參基因在所有樣本中的CT值進(jìn)行描述性統(tǒng)計,同時也將所有候選內(nèi)參基因綜合為1個Bestkeeper指數(shù)，計算每個候選內(nèi)參基因與該指數(shù)之間相關(guān)性[14]。為了解決以上不同程序所得結(jié)果差異的問題，Xie等[33]將這4種分析方法整合成1個網(wǎng)絡(luò)分析工具RefFinder，對以上4個程序的結(jié)果進(jìn)行綜合評價。本研究使用geNorm、NormFinder、ΔCT和Bestkeeper程序分別對候選內(nèi)參基因穩(wěn)定性進(jìn)行評估，并最終使用RefFinder網(wǎng)站對以上4個程序結(jié)果進(jìn)行了綜合分析，確定了檸檬色百合花被片發(fā)育過程及不同器官間qRT-PCR穩(wěn)定內(nèi)參基因。

(a)～(d)PSY基因在花被片發(fā)育過程中表達(dá)情況；(e)～(h)PSY基因在不同器官間表達(dá)情況。(a) to (d) The expression of PSY in tepals at different developmental stages； (e) to (h) The expression of PSY in different tissues.圖7 PSY基因相對表達(dá)量Fig.7 Relative expression patterns of PSY

表4 PSY基因相對表達(dá)與總類胡蘿卜素含量之間斯皮爾曼相關(guān)性Table 4 The spearman correlation coefficient of PSY relative expression patterns and carotenoid content

上述程序中，geNorm與Bestkeeper均倡導(dǎo)多內(nèi)參基因策略，以此減少因某內(nèi)參基因使用不當(dāng)所造成的誤差，使計算的目的基因表達(dá)模式更接近真實水平。本研究以geNorm計算的所需內(nèi)參基因數(shù)量為準(zhǔn)，在檸檬色百合花被片發(fā)育過程及不同器官間均使用最穩(wěn)定的2個候選內(nèi)參基因?qū)SY基因相對表達(dá)量進(jìn)行計算。

前人在使用Bestkeeper程序?qū)蜻x內(nèi)參基因進(jìn)行穩(wěn)定性評估時，常常默認(rèn)以SD為主CV為輔進(jìn)行穩(wěn)定性排名，并沒有考慮Bestkeeper指數(shù)含義，沒有顧及到候選內(nèi)參基因與Bestkeeper指數(shù)間的關(guān)系[34]。本研究在計算檸檬色百合花發(fā)育過程中9個候選基因穩(wěn)定性時，雖然UBC的SD最小，CV最低，按照已有研究中常用的方法應(yīng)該將其認(rèn)定為該條件下最穩(wěn)定的內(nèi)參基因。但研究發(fā)現(xiàn)，UBC與相應(yīng)Bestkeeper指數(shù)相關(guān)系數(shù)的P值遠(yuǎn)大于0.050，無相關(guān)性，其余8個候選內(nèi)參基因與該指數(shù)相關(guān)系數(shù)的P值均為0.001，r值在0.876～0.996之間，表明這8個候選內(nèi)參基因與該指數(shù)間相關(guān)性強(qiáng)且相關(guān)性顯著。因此，在檸檬色百合花發(fā)育過程中UBC并不適合作內(nèi)參基因。此外，以UBC作為內(nèi)參基因，用Pfaffl方法計算檸檬色百合花被片發(fā)育過程中PSY基因表達(dá)量由高到低依次為：S1>S2>S3，與其真實表達(dá)趨勢相反，進(jìn)一步佐證了UBC的不穩(wěn)定性。同時也說明不正確使用和分析Bestkeeper程序輸出信息，會影響對候選內(nèi)參基因穩(wěn)定性的判斷。

4 結(jié) 論

本研究選用9個候選內(nèi)參基因，研究其在檸檬色百合花被片發(fā)育過程及不同器官間的表達(dá)情況，通過不同程序和網(wǎng)站計算穩(wěn)定性排序及驗證試驗，最終確定，進(jìn)行熒光定量PCR試驗時，在檸檬色百合花被片發(fā)育過程中檢測目的基因表達(dá)情況需使用Actin和AP4作為內(nèi)參基因；而在檸檬色百合不同器官間檢測目的基因表達(dá)情況需使用eIF和AP4作為內(nèi)參基因。如此才能夠既穩(wěn)定又正確地反映目的基因表達(dá)量。