敲低CTCF對5-氟尿嘧啶、順鉑耐藥結(jié)直腸癌細(xì)胞惡性生物學(xué)行為的影響及其機(jī)制

王蓉荻，郭旭，徐孟

大連市中心醫(yī)院肛腸外科，遼寧大連 116000

結(jié)直腸癌（CRC）是消化系統(tǒng)常見的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率居全球惡性腫瘤第三位，死亡率居全球惡性腫瘤第二位。近年來，隨著人們生活水平提高和生活方式轉(zhuǎn)變，我國CRC 的發(fā)病率逐年升高［1］。CRC 早期癥狀隱匿，缺乏特異性臨床表現(xiàn)，約85%患者就診時已處于中晚期。化療是中晚期CRC 的重要治療手段，常用的化療藥物有5-氟尿嘧啶（5-Fu）、順鉑（DDP）等，但藥物積累可誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞中多藥耐藥基因表達(dá)，從而導(dǎo)致化療耐藥［2］?；熌退幨菍?dǎo)致CRC 治療失敗的重要原因。CRC 化療耐藥的機(jī)制非常復(fù)雜，可能與編碼外排泵的基因表達(dá)改變、分泌外泌體、血管生成關(guān)鍵信號通路激活等有關(guān)［3］。CCCTC 結(jié)合因子（CTCF）是含有11 個鋅指結(jié)構(gòu)的多功能轉(zhuǎn)錄因子，盡管長度超過700 個氨基酸，但其高度保守［4］。有研究報道，CTCF 異常表達(dá)或其靶基因失調(diào)能夠引起多種惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展，如乳腺癌、肝細(xì)胞癌、CRC 等［5-7］。KATAINEN等［8］研究發(fā)現(xiàn)，在CRC 細(xì)胞中CTCF 基因突變率較高，該基因突變可能參與CRC 化療耐藥。但目前鮮見相關(guān)報道。2020年8月—2022年1月，本研究探討了敲低CTCF 對5-Fu、DDP 耐藥CRC 細(xì)胞惡性生物學(xué)行為的影響及其機(jī)制?，F(xiàn)報告如下。

1 材料與方法

1.1 材料 CRC 耐藥細(xì)胞株HT29/5-Fu、HT29/DDP，購自江西江藍(lán)純生物試劑有限公司。5-Fu（純度≥99.0%）、DDP（純度≥98.5%），購自北京索萊寶科技有限公司。CTCF 短發(fā)夾RNA 質(zhì)粒（shCTCF）、對照短發(fā)夾RNA 質(zhì)粒（shControl）由廣州艾迪基因科技有限責(zé)任公司合成。Multiskan GO 全波長酶標(biāo)儀，購自美國Thermo Fisher 公司；JY5000 型高壓電泳儀，購自北京君意東方電泳設(shè)備有限公司；FACS?Calibur 流式細(xì)胞儀，購自美國BD 公司；Transwell 小室，購自美國Corning 公司。Annexin V-FITC/PI 細(xì)胞凋亡檢測試劑盒，購自江蘇碧云天生物技術(shù)有限公司。MTT、結(jié)晶紫，購自北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司；兔抗鼠CTCF、補綴同源物1（PTCH1）、補綴同源物2（PTCH2）、膠質(zhì)瘤相關(guān)癌基因同源蛋白1（GLI1）、音猬因子（SHH）、β-actin 單克隆抗體及辣根過氧化物酶標(biāo)記的鼠抗兔IgG 二抗，購自美國Cell Signaling Technology 公司。

1.2 細(xì)胞傳代培養(yǎng) 將HT29/5-Fu、HT29/DDP 細(xì)胞接種于含10% FBS 的RPMI 1640 培養(yǎng)基，置于37 ℃、5% CO2、飽和濕度的細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)。每2～3 天換液一次。待細(xì)胞生長融合85%左右時，用0.25%胰蛋白酶消化，按1∶3 傳代。取傳3 代、對數(shù)生長期、生長狀態(tài)良好的細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實驗。

1.3 5-Fu、DDP 最佳作用濃度篩選 取傳3 代、對數(shù)生長期、生長狀態(tài)良好的HT29/5-Fu 細(xì)胞和HT29/DDP 細(xì)胞接種于96 孔板，每孔5 × 103個，置于37 ℃、5% CO2、飽和濕度的細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h。HT29/5-Fu 細(xì)胞分別加入2、4、8、16 mg/L 5-Fu，HT29/DDP 細(xì)胞分別加入0.5、1、2、4 mg/L DDP，另設(shè)陰性對照孔（不加入5-Fu 或DDP）、空白對照孔（僅有培養(yǎng)基，無HT29/5-Fu 細(xì)胞或HT29/DDP 細(xì)胞），每個濃度設(shè)6 個復(fù)孔，繼續(xù)培養(yǎng)48 h。然后每孔加入5 mg/L MTT溶液20 μL，37 ℃孵育2 h。小心吸棄孔內(nèi)培養(yǎng)上清液，加入DMSO溶液200 μL，輕輕振蕩，使結(jié)晶物充分溶解。酶標(biāo)儀于450 nm 波長處檢測各孔的光密度（OD）值，按公式計算細(xì)胞存活率。細(xì)胞存活率=1-［（實驗孔OD450值-空白對照孔OD450值）/（陰性對照孔OD450值-空白對照孔OD450值）］× 100%。選擇HT29/5-Fu、HT29/DDP 細(xì)胞半數(shù)抑制活性（IC50）時5-Fu 或DDP 濃度進(jìn)行后續(xù)實驗。

1.4 細(xì)胞轉(zhuǎn)染 取傳3 代、對數(shù)生長期、生長狀態(tài)良好的HT29/5-Fu細(xì)胞和HT29/DDP細(xì)胞，接種于6孔板，每孔2 × 105個，隨機(jī)分為HT29/5-Fu shCTCF組與HT29/5-Fu shControl 組、HT29/DDP shCTCF 組與HT29/DDP shControl 組，每組設(shè)3 個復(fù)孔。然后將6 孔板置于37 ℃、5% CO2、飽和濕度的細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h，根據(jù)Lipofectamine?2000 說明，HT29/5-Fu shCTCF 組與HT29/DDP shCTCF 組轉(zhuǎn)染shCTCF，HT29/5-Fu shControl 組與 HT29/DDP shControl 組轉(zhuǎn)染shControl。轉(zhuǎn)染6 h 更換新鮮培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)24 h，收集細(xì)胞，用于后續(xù)實驗。

1.5 CTCF蛋白表達(dá)檢測 取各組上述轉(zhuǎn)染后細(xì)胞4 × 106個，置于離心管中，加入適量的Western 及IP細(xì)胞裂解液，提取細(xì)胞總蛋白。經(jīng)BCA 法蛋白定量合格，加入適量5 × SDS-PAGE 凝膠上樣緩沖液混勻，100 ℃水浴5 min，使蛋白充分變性。取變性蛋白30 μg，SDS-PAGE 分離（10%分離膠、5%濃縮膠）。電泳結(jié)束，采用濕轉(zhuǎn)法將蛋白電泳產(chǎn)物轉(zhuǎn)印至PVDF膜上。5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，分別加入兔抗鼠CTCF、β-actin 單克隆抗體，4 ℃孵育過夜。次日，滴加辣根過氧化物酶標(biāo)記的鼠抗兔IgG 二抗，室溫孵育1 h。ECL 發(fā)光，暗室內(nèi)曝光、顯影。采用Amersham Imager 600 凝膠成像系統(tǒng)拍照，Image J 軟件分析各蛋白電泳條帶灰度值。以β-actin 為內(nèi)參，以目的蛋白電泳條帶灰度值與內(nèi)參蛋白電泳條帶灰度值的比值作為目的蛋白相對表達(dá)量。

1.6 細(xì)胞存活率檢測 取各組上述轉(zhuǎn)染后細(xì)胞，接種于96 孔板，每孔5 × 103個，置于37 ℃、5% CO2、飽和濕度的細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)。培養(yǎng)24 h，HT29/5-Fu shCTCF 組與HT29/5-Fu shControl 組分別加入最佳作用濃度的5-Fu，HT29/DDP shCTCF 組與HT29/DDP shControl 組分別加入最佳作用濃度的DDP，然后置于37 ℃、5% CO2、飽和濕度的細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)。分別于培養(yǎng)24、48、72 h，每孔加入5 mg/L MTT 溶液20 μL，37 ℃孵育2 h。小心吸棄孔內(nèi)培養(yǎng)上清液，加入DMSO 溶液200 μL，輕輕振蕩，使結(jié)晶物充分溶解。酶標(biāo)儀于450 nm 波長處檢測各孔的OD 值，按1.3中公式計算細(xì)胞存活率。

1.7 細(xì)胞侵襲能力檢測 取各組上述轉(zhuǎn)染后細(xì)胞，用不含血清的培養(yǎng)基重懸，制成密度為2 × 105個/mL細(xì)胞懸液。取細(xì)胞懸液200 μL，加入Transwell 小室上室，下室加入600 μL含15% FBS的培養(yǎng)基。37 ℃孵育48 h，取出Transwell小室，用棉簽輕輕拭去上室面未穿膜細(xì)胞，90%乙醇固定30 min，0.1%結(jié)晶紫染色15 min，顯微鏡下拍照。隨機(jī)選取5個200倍不重疊視野，計數(shù)每視野穿膜細(xì)胞數(shù)。以穿膜細(xì)胞數(shù)代表細(xì)胞侵襲能力。

1.8 細(xì)胞凋亡檢測 取各組上述轉(zhuǎn)染后細(xì)胞，接種于6 孔板，每孔3 × 106個，置于37 ℃、5% CO2、飽和濕度的細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h。HT29/5-Fu shCTCF 組與HT29/5-Fu shControl 組分別加入最佳作用濃度的5-Fu，HT29/DDP shCTCF組與HT29/DDP shControl組分別加入最佳作用濃度的DDP，繼續(xù)培養(yǎng)48 h。收集細(xì)胞，用不含EDTA 的胰蛋白酶消化，4 ℃下300 × g離心5 min。收集細(xì)胞并轉(zhuǎn)移至1.5 mL EP 管中，加入1 × Binding Buffer 100 μL 重懸細(xì)胞，然后依次加入Annexin V-FITC 5 μL、PI Staining Solution 10 μL，輕輕吹打混勻，室溫避光孵育15 min，然后加入1 × Binding Buffer 400 μL 混勻，1 h 內(nèi)上流式細(xì)胞儀檢測。

1.9 Hedgehog 信號通路相關(guān)蛋白表達(dá)檢測 取各組上述轉(zhuǎn)染后細(xì)胞，接種于6 孔板，每孔5 × 106個，置于37 ℃、5% CO2、飽和濕度的細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h。 HT29/5-Fu shCTCF 組與HT29/5-Fu shControl 組分別加入最佳作用濃度的5-Fu，HT29/DDP shCTCF 組與HT29/DDP shControl 組分別加入最佳作用濃度的DDP，繼續(xù)培養(yǎng)48 h。收集細(xì)胞，采用Western blotting 法檢測Hedgehog 信號通路PTCH1、PTCH2、GLI1、SHH 蛋白表達(dá)，具體步驟參照1.5。

1.10 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS21.0 統(tǒng)計軟件。符合正態(tài)分布的計量資料以±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，進(jìn)一步兩兩比較采用LSD-t檢驗；兩組間比較采用獨立樣本t檢驗。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 5-Fu、DDP 最佳作用濃度篩選結(jié)果 5-Fu 或DDP 均呈劑量依賴性抑制HT29/5-Fu 細(xì)胞或HT29/DDP 細(xì)胞增殖（P均＜0.05），見表1。5-Fu 對HT29/5-Fu 細(xì)胞IC50的濃度為（13.0 ± 1.6）mg/L，DDP 對HT29/DDP 細(xì)胞IC50的濃度為（15.2 ± 1.3）mg/L。因此，選擇13.0 mg/L 5-Fu、15.0 mg/L DDP 進(jìn)行后續(xù)實驗。

表1 不同濃度5-Fu 或DDP 對HT29/5-Fu 細(xì)胞或HT29/DDP細(xì)胞存活率的影響（%）

2.2 兩組轉(zhuǎn)染后CTCF 蛋白表達(dá)比較 HT29/5-Fu shCTCF 組與HT29/5-Fu shControl 組CTCF 蛋白相對表達(dá)量分別為0.32 ± 0.11、0.86 ± 0.08，HT29/5-Fu shCTCF組CTCF蛋白相對表達(dá)量顯著低于HT29/5-Fu shControl 組（t=4.421，P＜0.05）；HT29/DDP shCTCF組與HT29/DDP shControl 組CTCF 蛋白相對表達(dá)量分別為0.27 ± 0.14、0.93 ± 0.05，HT29/DDP shCTCF 組CTCF 蛋白相對表達(dá)量顯著低于HT29/DDP shControl組（t=5.841，P＜0.05）。

2.3 兩組細(xì)胞存活率比較 見表2、3。

表2 HT29/5-Fu shCTCF組與HT29/5-Fu shControl組培養(yǎng)不同時間細(xì)胞存活率比較（%，±s）

表2 HT29/5-Fu shCTCF組與HT29/5-Fu shControl組培養(yǎng)不同時間細(xì)胞存活率比較（%，±s）

注：與HT29/5-Fu shControl組同期比較，*P＜0.05。

組別細(xì)胞存活率HT29/5-Fu shCTCF組HT29/5-Fu shControl組培養(yǎng)72 h 15.8 ± 2.9*40.1 ± 4.5培養(yǎng)0 h 97.5 ± 1.2 98.2 ± 1.5培養(yǎng)24 h 54.8 ± 3.5*81.6 ± 5.4培養(yǎng)48 h 32.0 ± 3.8*54.2 ± 4.2

表3 HT29/DDP shCTCF組與HT29/DDP shControl組培養(yǎng)不同時間細(xì)胞存活率比較（%，±s）

表3 HT29/DDP shCTCF組與HT29/DDP shControl組培養(yǎng)不同時間細(xì)胞存活率比較（%，±s）

注：與HT29/DDP shControl組同期比較，*P＜0.05。

組別HT29/DDP shCTCF組HT29/DDP shControl組細(xì)胞存活率培養(yǎng)72 h 5.3 ± 2.9*38.4 ± 3.6培養(yǎng)0 h 98.2 ± 1.2 97.6 ± 3.2培養(yǎng)24 h 52.3 ± 3.5*68.9 ± 4.6培養(yǎng)48 h 21.5 ± 3.8*54.3 ± 4.1

2.4 兩組細(xì)胞侵襲能力比較 HT29/5-Fu shCTCF組與HT29/5-Fu shControl 組穿膜細(xì)胞數(shù)分別為（18.67 ± 4.04）、（36.33 ± 4.52）個，HT29/5-Fu shCTCF組穿膜細(xì)胞數(shù)顯著低于HT29/5-Fu shControl組（t=5.021，P＜0.01）；HT29/DDP shCTCF 組與HT29/DDP shControl 組穿膜細(xì)胞數(shù)分別為（15.33 ±3.51）、（44.67 ± 4.34）個，HT29/DDP shCTCF 組穿膜細(xì)胞數(shù)顯著低于HT29/DDP shControl 組（t=5.632，P＜0.01）。

2.5 兩組細(xì)胞凋亡率比較 HT29/5-Fu shCTCF組與HT29/5-Fu shControl 組細(xì)胞凋亡率分別為（77.57 ± 3.00）%、（28.20 ± 3.79）%，HT29/5-Fu shCTCF組細(xì)胞凋亡率顯著高于HT29/5-Fu shControl組（t=8.632，P＜0.01）；HT29/DDP shCTCF 組與HT29/DDP shControl組細(xì)胞凋亡率分別為（75.87 ±5.78）%、（35.50 ± 2.66）%，HT29/DDP shCTCF 組細(xì)胞凋亡率顯著高于HT29/DDP shControl 組（t=6.541，P＜0.01）。

2.6 兩組Hedgehog信號通路相關(guān)蛋白表達(dá)比較 見表4、5。

表4 HT29/5-Fu shCTCF組與HT29/5-Fu shControl組Hedgehog信號通路相關(guān)蛋白表達(dá)比較（±s）

表4 HT29/5-Fu shCTCF組與HT29/5-Fu shControl組Hedgehog信號通路相關(guān)蛋白表達(dá)比較（±s）

注：與HT29/5-Fu shControl組比較，*P＜0.05。

組別HT29/5-Fu shControl組HT29/5-Fu shCTCF組SHH 0.78 ± 0.04 0.30 ± 0.04*PTCH1 0.84 ± 0.14 0.32 ± 0.05*PTCH2 0.86 ± 0.09 0.21 ± 0.06*GLI1 0.92 ± 0.10 0.26 ± 0.03*

表5 HT29/DDP shCTCF組與HT29/DDP shControl組Hedgehog信號通路相關(guān)蛋白表達(dá)比較（±s）

表5 HT29/DDP shCTCF組與HT29/DDP shControl組Hedgehog信號通路相關(guān)蛋白表達(dá)比較（±s）

注：與HT29/DDP shControl組比較，*P＜0.05。

組別HT29/DDP shControl組HT29/DDP shCTCF組SHH 0.84 ± 0.11 0.15 ± 0.04*PTCH1 0.89 ± 0.10 0.14 ± 0.03*PTCH2 0.92 ± 0.11 0.18 ± 0.03 GLI1 0.95 ± 0.12 0.20 ± 0.04*

3 討論

近年來，我國CRC 的發(fā)病率不斷上升，發(fā)病人群呈年輕化趨勢。CRC 早期癥狀隱匿，缺乏特異性臨床表現(xiàn)，約85%患者就診時已處于中晚期?；熢谥型砥贑RC 輔助治療中占有重要地位，常用的化療藥物有5-Fu、DDP 等。但部分患者經(jīng)過一段時間化療后易對5-Fu、DDP 等產(chǎn)生耐藥性，導(dǎo)致化療效果不理想［9］。目前，CRC 化療耐藥的具體機(jī)制尚不完全清楚，主要涉及DNA 損傷修復(fù)增強(qiáng)、轉(zhuǎn)運蛋白家族表達(dá)和功能異常、腫瘤干細(xì)胞特性改變、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路異常激活等［10］。因此，深入探索CRC 化療耐藥的機(jī)制對提高腫瘤化療敏感性具有重要意義。

CTCF又稱鋅指蛋白，是一種在真核生物中廣泛表達(dá)的多功能轉(zhuǎn)錄因子，能夠參與轉(zhuǎn)錄調(diào)控、染色質(zhì)結(jié)構(gòu)維護(hù)以及蛋白復(fù)合物合成等。CTCF 可通過多種機(jī)制調(diào)控基因的表達(dá)，如招募其他共激活因子、結(jié)合靶基因啟動子等。有研究報道，CTCF在多種惡性腫瘤中表達(dá)上調(diào)，其表達(dá)上調(diào)可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞惡性生物學(xué)行為［11-12］。ZHAO 等［13］研究顯示，CTCF 在神經(jīng)母細(xì)胞瘤中表達(dá)上調(diào)，其表達(dá)上調(diào)可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖、侵襲和遷移。GIANNAKIS 等［14］對619 例CRC 患者進(jìn)行全外顯子組測序發(fā)現(xiàn)，TP53、KRAS、SMAD4、CTCF 等是CRC 中反復(fù)突變的基因。提示CTCF 可能在CRC 的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮重要作用。LAI 等［15］研究發(fā)現(xiàn)，CTCF 在CRC 中表達(dá)上調(diào)，并且其表達(dá)上調(diào)與5-Fu化療耐藥有關(guān)。ZHAO 等［16］研究亦發(fā)現(xiàn)，CTCF 與腎細(xì)胞癌舒尼替尼化療耐藥有關(guān)，并且CTCF 有望成為預(yù)測腎細(xì)胞癌舒尼替尼化療耐藥的生物標(biāo)志物。以上研究提示，CTCF可能參與多種惡性腫瘤的化療耐藥。

以往研究顯示，CTCF在多種惡性腫瘤中過表達(dá)并參與化療耐藥［11-12，16］，提示CTCF 過表達(dá)能夠降低CRC細(xì)胞對5-Fu或DDP的敏感性，這為探索CRC化療耐藥機(jī)制提供了新的研究方向。為了探索CTCF對HT29/5-Fu、HT29/DDP 細(xì)胞的影響，本研究采用瞬時轉(zhuǎn)染技術(shù)敲低HT29/5-Fu、HT29/DDP 細(xì)胞CTCF 蛋白表達(dá)，進(jìn)一步觀察了敲低CTCF 對HT29/5-Fu 細(xì)胞和HT29/DDP 細(xì)胞存活率、侵襲能力和凋亡率的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，敲低CTCF后HT29/5-Fu細(xì)胞和HT29/DDP細(xì)胞存活率降低、侵襲能力減弱、凋亡率增加，說明了CTCF 表達(dá)降低可增加HT29/5-Fu、HT29/DDP 細(xì)胞對5-Fu 或DDP 的敏感性。進(jìn)一步證實，CTCF與CRC 5-Fu或DDP化療耐藥有關(guān)，降低CTCF 表達(dá)可顯著增加HT29/5-Fu、HT29/DDP細(xì)胞對5-Fu或DDP的敏感性。

Hedgehog 信號通路與腫瘤發(fā)生及其惡性生物學(xué)行為密切相關(guān)，如腫瘤血管生成和腫瘤細(xì)胞增殖、遷移、侵襲以及化療耐藥等［17-18］。LAI 等［15］研究證實，Hedgehog 信號通路相關(guān)基因富集與CTCF 表達(dá)顯著相關(guān)，CTCF 可通過激活Hedgehog 信號通路維持CRC 細(xì)胞增殖和化療耐藥。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，敲低CTCF 可顯著抑制HT29/5-Fu 細(xì)胞和HT29/DDP細(xì)胞Hedgehog 信號通路PTCH1、PTCH2、GLI1、SHH等關(guān)鍵蛋白表達(dá)，抑制Hedgehog 信號通路傳導(dǎo)。結(jié)果提示，敲低CTCF 可能通過抑制Hedgehog 信號通路傳導(dǎo)提高HT29/5-Fu 細(xì)胞和HT29/DDP 細(xì)胞對5-Fu或DDP的敏感性。

綜上所述，敲低CTCF 可抑制5-Fu、DDP 耐藥CRC 細(xì)胞增殖、侵襲并誘導(dǎo)其凋亡，其機(jī)制可能與抑制Hedgehog信號通路有關(guān)。