鹽酸青藤堿對DSS誘導(dǎo)潰瘍性結(jié)腸炎小鼠腸道炎癥損傷的影響及其機(jī)制

謝小榮，呂曉丹，范俊華，李世權(quán)，詹靈凌，呂小平

1 廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院消化內(nèi)科，南寧 530021；2 廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科

潰瘍性結(jié)腸炎是一種病因不明的慢性非特異性腸道炎癥性疾病，近年來其發(fā)病率在全球范圍內(nèi)呈明顯上升趨勢［1］。潰瘍性結(jié)腸炎的發(fā)病機(jī)制尚不完全清楚，可能是遺傳、環(huán)境、免疫等因素共同作用的結(jié)果。自噬是細(xì)胞自我分解代謝的一種方式，可通過降解體內(nèi)異常蛋白質(zhì)及衰老或受損細(xì)胞器等維持細(xì)胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定，還可通過調(diào)節(jié)腸上皮細(xì)胞連接、參與病原體清除、調(diào)控炎癥信號表達(dá)等途徑介導(dǎo)腸黏膜屏障損傷［2-3］。因此，自噬有可能成為研究潰瘍性結(jié)腸炎的一個(gè)重要方向。青藤堿是從中藥青風(fēng)藤中提取的一種生物堿，具有抗炎、鎮(zhèn)痛、免疫抑制等藥理作用。鹽酸青藤堿（SIN）是青藤堿的藥用形式，對結(jié)腸炎具有較好的治療效果［4］。但目前SIN 治療結(jié)腸炎的機(jī)制尚不明確。2021年11月—2022年9月，本研究探討了SIN 對DSS 誘導(dǎo)潰瘍性結(jié)腸炎小鼠腸道炎癥損傷的影響及其機(jī)制?，F(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 材料 雄性C57BL/6J小鼠18只，SPF級，體質(zhì)量（20 ± 2）g，購自斯貝福（北京）生物技術(shù)有限公司，使用許可證編號：SCXK 桂2020-0003。所有小鼠分籠飼養(yǎng)，每籠6 只，自由攝食和飲水。飼養(yǎng)環(huán)境：溫度24 ℃、相對濕度60%、12 h/12 h 明暗交替。研究設(shè)計(jì)與實(shí)施過程符合動(dòng)物福利和倫理原則（審查編號：202107006）。SIN，純度98%，購自上海麥克林生化科技有限公司；DSS，購自大連美侖生物技術(shù)有限公司。小鼠TNF-α、IL-6、IL-10 ELISA 試劑盒，購自武漢華美生物工程有限公司；通用型免疫組化試劑盒，購自北京中衫金橋生物技術(shù)有限公司。兔源Beclin1、LC3B 單克隆抗體，購自艾比瑪特醫(yī)藥科技（上海）有限公司；兔源p62多克隆抗體，購自沈陽萬類生物科技有限公司；HRP 標(biāo)記的山羊抗小鼠/兔IgG二抗，購自武漢云克隆科技股份有限公司。

1.2 模型構(gòu)建與藥物干預(yù) 所有小鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，隨機(jī)分為對照組、模型組、SIN組，每組6只。模型組予3% DSS溶液自由飲用7 d誘導(dǎo)結(jié)腸炎，當(dāng)小鼠出現(xiàn)毛發(fā)粗糙、活動(dòng)和攝食減少、體質(zhì)量進(jìn)行性下降，并伴有腹瀉、肉眼血便等，表明成功誘導(dǎo)出結(jié)腸炎。SIN組予3% DSS溶液自由飲用同時(shí)予100 mg/（kg·d） SIN溶液灌胃，連續(xù)7 d。對照組與模型組同期予等體積生理鹽水灌胃。

1.3 疾病活動(dòng)指數(shù)（DAI）評分評估 建模期間，觀察糞便性狀，并對新鮮糞便進(jìn)行糞便隱血試驗(yàn)（干化學(xué)法），建模第8 天評估DAI 評分［5］。體質(zhì)量改變評分：體質(zhì)量下降≤1%，計(jì)0分；體質(zhì)量下降＞1%～5%，計(jì)1分；體質(zhì)量下降＞5%～10%，計(jì)2分；體質(zhì)量下降＞10%～15%，計(jì)3分；體質(zhì)量下降＞15%，計(jì)4分。糞便隱血試驗(yàn)評分：陰性，計(jì)0 分；弱陽性，計(jì)1 分；陽性，計(jì)2分；強(qiáng)陽性，計(jì)3分；肉眼血便，計(jì)4分。大便性狀評分：正常，計(jì)0分；松散，計(jì)1分；半稀便，計(jì)2分；稀便，計(jì)3分；水樣便，計(jì)4分。DAI評分=（體質(zhì)量改變評分 + 糞便隱血試驗(yàn)評分 + 大便性狀評分）/3。

1.4 結(jié)腸長度測量及組織學(xué)損傷評分評估 建模結(jié)束，處死小鼠，剪取結(jié)腸組織，測量肛門至回盲部結(jié)腸長度?？v向剖開結(jié)腸，取炎癥明顯處結(jié)腸組織0.5 cm，10%多聚甲醛固定24 h，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，常規(guī)石蠟包埋，4 μm 厚連續(xù)切片。切片經(jīng)二甲苯脫蠟、梯度乙醇水化，蘇木素染色、鹽酸乙醇分化、氨水反藍(lán)、伊紅染色，然后梯度乙醇脫水、二甲苯透明、中性樹膠封固。將已染色烘干的切片在光學(xué)顯微鏡下拍照觀察，隨機(jī)選取5 個(gè)不重疊的高倍鏡視野（200×），評估組織學(xué)損傷評分［6］。炎癥程度評分：無炎癥，上皮未見中性粒細(xì)胞浸潤，計(jì)0分；輕度炎癥，隱窩或上皮中性粒細(xì)胞浸潤≤50%，無糜爛或潰瘍，計(jì)1 分；中度炎癥，隱窩或上皮中性粒細(xì)胞浸潤＞50%，無糜爛或潰瘍，計(jì)2 分；重度炎癥，可見糜爛或潰瘍，計(jì)3 分。病變深度評分：無，計(jì)0 分；僅限于黏膜層，計(jì)1分；至黏膜下層，計(jì)2分；至肌層，計(jì)3 分；至漿膜層，計(jì)4 分。隱窩損傷評分：無，計(jì)0分；基底部1/3隱窩破壞，計(jì)1分；基底部2/3隱窩破壞，計(jì)2 分；僅表面上皮完整，計(jì)3 分；全部隱窩和上皮破壞，計(jì)4分。病變范圍評分：≤1%，計(jì)0分；＞1%～25%，計(jì)1分；＞25%～50%，計(jì)2分；＞50%～75%，計(jì)3分；＞75%，計(jì)4分。組織學(xué)損傷評分=炎癥程度評分 +病變深度評分 + 隱窩損傷評分 + 病變范圍評分。

1.5 結(jié)腸組織TNF-α、IL-6、IL-10 含量檢測 取結(jié)腸組織30 mg，用組織剪剪碎，經(jīng)超聲破碎制成組織勻漿，4 ℃下5 000×g 離心5 min，留取上清液，采用ELISA 法檢測TNF-α、IL-6、IL-10 含量。所有操作嚴(yán)格按照試劑盒說明進(jìn)行。

1.6 結(jié)腸組織自噬相關(guān)蛋白Beclin1、LC3B、p62 表達(dá)檢測 取石蠟包埋的結(jié)腸組織，4 μm 厚連續(xù)切片。將切片置于60 ℃烤箱烘烤1 h，然后經(jīng)二甲苯脫蠟、梯度乙醇脫水，在檸檬酸鈉抗原修復(fù)液中高溫高壓修復(fù)抗原，自然冷卻至室溫，3%過氧化氫滅活內(nèi)源性過氧化物酶活性。正常山羊血清封閉后，分別滴加Beclin1、LC3B、p62 一抗，4 ℃孵育過夜。次日，滴加HRP 標(biāo)記的山羊抗小鼠/兔IgG 二抗。DAB顯色、蘇木素復(fù)染、鹽酸乙醇分化，梯度乙醇脫水、二甲苯透明，中性樹膠封固，顯微鏡下拍照觀察。Beclin1、LC3B陽性染色主要定位于細(xì)胞質(zhì)，p62陽性染色定位于細(xì)胞質(zhì)及部分細(xì)胞核，呈黃色或棕黃色顆粒。每張切片隨機(jī)選取5個(gè)不重疊的高倍鏡視野（400×），采用Image-Pro Plus 6.0 軟件對陽性染色進(jìn)行半定量分析，計(jì)算平均光密度（AOD）。AOD=積分光密度/陽性面積。以AOD值代表蛋白相對表達(dá)量。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS26.0 統(tǒng)計(jì)軟件。符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以xˉ±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，進(jìn)一步兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組病理形態(tài)學(xué)變化及DAI 評分、結(jié)腸長度、組織學(xué)損傷評分比較 對照組結(jié)腸黏膜上皮、腺體及隱窩結(jié)構(gòu)無破壞，未見炎癥細(xì)胞浸潤；與對照組相比，模型組結(jié)腸黏膜結(jié)構(gòu)受損嚴(yán)重，腺體及隱窩結(jié)構(gòu)消失，可見大量炎癥細(xì)胞浸潤至黏膜下層；與模型組相比，SIN 組結(jié)腸黏膜結(jié)構(gòu)損傷明顯減輕，可見部分腺體及隱窩結(jié)構(gòu)破壞，黏膜下層浸潤的炎癥細(xì)胞數(shù)量明顯減少。各組DAI評分、結(jié)腸長度、組織學(xué)損傷評分比較見表1。

表1 各組DAI評分、結(jié)腸長度、組織學(xué)損傷評分比較（±s）

表1 各組DAI評分、結(jié)腸長度、組織學(xué)損傷評分比較（±s）

注：與對照組比較，*P＜0.05；與模型組比較，#P＜0.05。

組別對照組模型組SIN組組織學(xué)損傷評分（分）0.00 ± 0.00 12.83 ± 0.75*9.33 ± 1.37*#n6 6 6 DAI評分（分）0.00 ± 0.00 3.84 ± 0.18*2.95 ± 0.49*#結(jié)腸長度（cm）8.05 ± 0.35 5.33 ± 0.31*6.50 ± 0.51*#

2.2 各組結(jié)腸組織TNF-α、IL-6、IL-10含量比較 見表2。

表2 各組結(jié)腸組織TNF-α、IL-6、IL-10含量比較（ng/mL，±s）

表2 各組結(jié)腸組織TNF-α、IL-6、IL-10含量比較（ng/mL，±s）

注：與對照組比較，*P＜0.05；與模型組比較，#P＜0.05。

組別對照組模型組SIN組IL-10 9.69 ± 1.72 2.00 ± 0.42*4.38 ± 0.85*#n6 6 6 TNF-α 0.28 ± 0.13 0.66 ± 0.17*0.39 ± 0.03#IL-6 0.02 ± 0.01 0.05 ± 0.02*0.03 ± 0.00*#

2.3 各組結(jié)腸組織自噬相關(guān)蛋白Beclin1、LC3B、p62表達(dá)比較 見表3。

表3 各組結(jié)腸組織自噬相關(guān)蛋白Beclin1、LC3B、p62相對表達(dá)量比較（±s）

表3 各組結(jié)腸組織自噬相關(guān)蛋白Beclin1、LC3B、p62相對表達(dá)量比較（±s）

注：與對照組比較，*P＜0.05；與模型組比較，#P＜0.05。

組別對照組模型組SIN組p62 0.03 ± 0.01 0.09 ± 0.01*0.05 ± 0.01*#n6 6 6 Beclin1 0.05 ± 0.01 0.02 ± 0.00*0.04 ± 0.01*#LC3B 0.08 ± 0.02 0.01 ± 0.00*0.04 ± 0.01*#

3 討論

潰瘍性結(jié)腸炎是一種病因不明的慢性非特異性腸道炎癥性疾病，其發(fā)病機(jī)制尚不完全清楚。目前，潰瘍性結(jié)腸炎的臨床用藥主要包括氨基水楊酸制劑、糖皮質(zhì)激素、免疫抑制劑等，但這些藥物治療效果欠佳、不良反應(yīng)較多。因此，新藥探索與研發(fā)對潰瘍性結(jié)腸炎治療具有重要意義。

青藤堿是從中藥青風(fēng)藤中提取的一種天然生物堿，具有良好的抗炎活性和免疫抑制作用。臨床上以青藤堿為主要成分的藥物制劑主要用于治療風(fēng)濕病、神經(jīng)痛等［7］。既往研究報(bào)道，青藤堿能夠緩解實(shí)驗(yàn)性結(jié)腸炎中過度活躍的炎癥水平，其機(jī)制可能與通過抑制TLR/NF-κB 信號通路而減少炎癥因子產(chǎn)生有關(guān)［4］。SIN是青藤堿的藥用形式，可通過抗氧化作用減輕結(jié)腸組織炎癥損傷［8］。本研究采用3%DSS 溶液誘導(dǎo)小鼠結(jié)腸炎，并評估SIN 對結(jié)腸炎癥損傷的治療效果。DAI 評分、結(jié)腸長度變化和組織學(xué)損傷評分是評估潰瘍性結(jié)腸炎嚴(yán)重程度的重要指標(biāo)［9］。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與對照組比較，模型組DAI評分顯著升高，結(jié)腸長度顯著縮短，結(jié)腸黏膜結(jié)構(gòu)遭到破壞并出現(xiàn)明顯炎癥細(xì)胞浸潤，組織學(xué)損傷評分顯著升高；與模型組比較，SIN 組DAI 評分有所降低，結(jié)腸長度有所延長，結(jié)腸黏膜結(jié)構(gòu)破壞、炎癥細(xì)胞浸潤有所改善，組織學(xué)損傷評分顯著改善。結(jié)果提示，SIN 能夠改善潰瘍性結(jié)腸炎小鼠結(jié)腸炎癥損傷。

促炎癥細(xì)胞因子與抗炎癥細(xì)胞因子分泌失衡導(dǎo)致的炎癥反應(yīng)是潰瘍性結(jié)腸炎發(fā)生、發(fā)展的重要環(huán)節(jié)。TNF-α、IL-6 是介導(dǎo)潰瘍性結(jié)腸炎的關(guān)鍵促炎癥細(xì)胞因子。有研究報(bào)道，潰瘍性結(jié)腸炎患者血漿TNF-α、IL-6 水平顯著升高，并且其水平與結(jié)腸黏膜炎癥程度密切相關(guān)［10］。而使用TNF-α、IL-6 抑制劑可控制腸黏膜炎癥，在潰瘍性結(jié)腸炎中表現(xiàn)出良好的治療效果。IL-10屬于抗炎癥細(xì)胞因子，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明，敲除IL-10 基因小鼠可出現(xiàn)自發(fā)性結(jié)腸炎［11］。因此，機(jī)體炎癥細(xì)胞因子水平與結(jié)腸炎癥密切相關(guān)。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與對照組比較，模型組結(jié)腸組織TNF-α、IL-6 含量顯著升高，而IL-10 含量顯著降低；與模型組比較，SIN 組結(jié)腸組織TNF-α、IL-6含量顯著降低，而IL-10 含量顯著升高。結(jié)果提示，SIN能夠顯著改善促炎癥細(xì)胞因子與抗炎癥細(xì)胞因子分泌失衡狀態(tài)，抑制機(jī)體炎癥反應(yīng)程度。

潰瘍性結(jié)腸炎的病理特征是機(jī)體免疫系統(tǒng)紊亂而引起的黏膜炎癥反應(yīng)。自噬是細(xì)胞自我分解代謝的一種方式，可通過樹突狀細(xì)胞調(diào)控抗原呈遞以及巨噬細(xì)胞分泌炎癥細(xì)胞因子，從而參與體內(nèi)先天性免疫和適應(yīng)性免疫調(diào)節(jié)過程［12］。自噬過程是多種自噬相關(guān)蛋白參與的級聯(lián)反應(yīng)，如Beclin1、LC3B、p62等。Beclin1與PI3K形成復(fù)合體，該復(fù)合體可促進(jìn)自噬小體膜形成與延伸。LC3B定位于自噬體膜，在自噬體形成過程中，LC3Ⅰ偶聯(lián)磷酸酰乙醇胺形成LC3Ⅱ，從而參與自噬體膜延伸與閉合。在整個(gè)自噬過程中，LC3B 是動(dòng)態(tài)變化的，并能反映機(jī)體自噬水平［13］。p62作為自噬底物可與泛素化蛋白及LC3Ⅱ結(jié)合，從而參與自噬體形成，而p62本身與異常蛋白質(zhì)結(jié)合，可進(jìn)入溶酶體中降解。因此，p62 能夠反映自噬活性［14］。有研究表明，實(shí)驗(yàn)性結(jié)腸炎小鼠結(jié)腸組織自噬水平顯著降低，促炎癥細(xì)胞因子水平顯著升高，而提高自噬通路活化狀態(tài)則可降低促炎癥細(xì)胞因子水平，進(jìn)而緩解結(jié)腸炎癥狀態(tài)［15］。在細(xì)胞水平上抑制自噬活性，可增加NF-κB p65 磷酸化，影響促炎癥細(xì)胞因子分泌，進(jìn)而參與炎癥調(diào)控［16-17］。本研究結(jié)果顯示，與對照組比較，模型組結(jié)腸組織p62相對表達(dá)量顯著升高，而Beclin1、LC3B 相對表達(dá)量顯著降低；與模型組比較，SIN 組結(jié)腸組織p62 相對表達(dá)量顯著降低，而Beclin1、LC3B 相對表達(dá)量顯著升高。結(jié)果提示，SIN 能夠部分解除炎癥所致的自噬抑制狀態(tài)。

綜上所述，SIN 可改善DSS 誘導(dǎo)潰瘍性結(jié)腸炎小鼠腸道炎癥損傷，其機(jī)制可能與SIN 能夠部分解除炎癥所致的自噬抑制狀態(tài)有關(guān)。