寒區(qū)降解多環(huán)芳烴耐冷菌株的分離鑒定及特性

孫 楠，朱廣雷，楊安培，王思銘

寒區(qū)降解多環(huán)芳烴耐冷菌株的分離鑒定及特性

孫 楠，朱廣雷，楊安培，王思銘

（東北農(nóng)業(yè)大學(xué)水利與土木工程學(xué)院，哈爾濱 150030）

多環(huán)芳烴（Polycyclic Aromatic Hydrocarbons，PAHs）是土壤中一種典型的持久性有機(jī)污染物。典型寒區(qū)東北地區(qū)因農(nóng)業(yè)投入品不合理使用、污灌等造成農(nóng)田土壤中含有大量致癌、致畸與致突變的多環(huán)芳烴，針對寒區(qū)氣候特征致使農(nóng)田中微生物降解多環(huán)芳烴效果不佳，難以改善農(nóng)田土壤環(huán)境并降低食品風(fēng)險的關(guān)鍵問題，基于目前常用商品化的降解微生物多來自于溫暖地區(qū)，且難以適應(yīng)寒區(qū)氣候的特性，該研究以PAHs典型污染物-菲（PHE）為研究底物，馴化溫度15 ℃，篩選分離出適應(yīng)寒區(qū)低溫環(huán)境的7株菌。經(jīng)鑒定及降解性能研究，篩選了3株在溫度20 ℃、接種量5%、pH值為8、底物濃度500 mg/L，以及外源物質(zhì)腐殖酸的促進(jìn)的條件下PHE降解率達(dá)到80%的高效降解耐冷菌。以上3株菌兩兩之間與三者組合均無拮抗關(guān)系。對菌株進(jìn)行碳源的廣譜性分析，菌株對2-5環(huán)多環(huán)芳烴降解率可達(dá)15%～85%之間，在將菌株應(yīng)用至20 ℃土壤環(huán)境時，60 d可降解土壤中75%的PHE。該耐冷菌群適應(yīng)條件符合寒區(qū)農(nóng)田土壤實(shí)際環(huán)境，研究結(jié)果對黑土地區(qū)土壤多環(huán)芳烴污染的微生物修復(fù)提供了一定的基礎(chǔ)資料。

土壤；污染；微生物；寒區(qū)；PAHs；耐冷菌；生物修復(fù)

0 引 言

農(nóng)業(yè)是中國經(jīng)濟(jì)平穩(wěn)發(fā)展的基石，隨著農(nóng)業(yè)的發(fā)展及人為活動的參與，在保障了糧食安全的同時也造成了嚴(yán)重的環(huán)境污染風(fēng)險[1-3]。2014年生態(tài)環(huán)境部發(fā)布的《全國土壤污染狀況調(diào)查公報》顯示中國農(nóng)田土壤點(diǎn)位污染物超標(biāo)率為19.4%，主要污染物便包括多環(huán)芳烴（PAHs）。農(nóng)田土壤中PAHs的含量為9.90～5 911 ng/g，總體水平較高[4]。菲（PHE）是16種美國環(huán)保局（USEPA）所列優(yōu)先控制的PAHs之一，在農(nóng)田土壤含量為13.82%，各區(qū)域含量分布存在較大差異，其中東北地區(qū)PAHs含量為900.6 ng/g，污染水平較高[5]。PAHs屬持久性有機(jī)污染物，具有較強(qiáng)的化學(xué)穩(wěn)定性和較低的水溶性[6]。隨著人類社會的不斷發(fā)展，各種廢氣污染物的排放有增無減，已經(jīng)超過了環(huán)境自身的修復(fù)凈化能力，造成了PAHs的逐年蓄積[7-8]。PAHs易進(jìn)入生態(tài)系統(tǒng)不斷積累，通過食物鏈在生物體內(nèi)富集，威脅人類健康[9]。PAHs污染嚴(yán)重影響農(nóng)田土壤環(huán)境的健康發(fā)展，危害著土壤的生產(chǎn)、生態(tài)功能以及農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量[10]，不利于農(nóng)田土壤環(huán)境的可持續(xù)發(fā)展，因此對于多環(huán)芳烴污染的修復(fù)迫在眉睫。

PAHs污染土壤的修復(fù)技術(shù)可分為物理修復(fù)技術(shù)、化學(xué)修復(fù)技術(shù)及生物修復(fù)技術(shù)。物理修復(fù)技術(shù)成本較高，對目標(biāo)污染物也只是完成了相轉(zhuǎn)移，并未真正將其從環(huán)境中去除?；瘜W(xué)修復(fù)技術(shù)雖然相對其他技術(shù)效果更理想，但在實(shí)際修復(fù)中存在氧化劑需求量大、能源消耗大、可能會對環(huán)境造成二次污染等問題。生物修復(fù)又因修復(fù)作用的主體不同，進(jìn)而可分為植物修復(fù)技術(shù)、動物修復(fù)技術(shù)、微生物修復(fù)技術(shù)及其聯(lián)合修復(fù)技術(shù)[11-13]。其中，PAHs污染土壤的微生物修復(fù)是一種得到廣泛認(rèn)可的處理技術(shù)，可實(shí)現(xiàn)PAHs類污染物的完全降解或?qū)⑵滢D(zhuǎn)化為毒性相對較低的化合物[14]，而不是簡單地將其轉(zhuǎn)移，同時具有成本低、環(huán)境擾動小、無二次污染、可就地處理等優(yōu)點(diǎn)，是人們公認(rèn)的一種利用微生物降解、同化、代謝或解毒有機(jī)污染的低成本、高效技術(shù)[15]。目前的研究中，能降解多環(huán)芳烴的微生物主要有假單胞菌屬、產(chǎn)堿桿菌屬、分枝桿菌屬、紅球菌屬、鞘氨醇單胞菌屬和環(huán)圈菌屬等[16-17]。

東北地區(qū)是寒冷地區(qū)，有著廣袤的黑土地，土壤溫度狀況屬于冷性土壤溫度狀況，全年土壤溫度多為5～22 ℃[18-19]，黑土地中腐殖酸可達(dá)(7.03±2)g/kg[20]，土壤整體來看pH值多在5.5～8.5之間[21]。目前微生物修復(fù)技術(shù)的研究多進(jìn)行于溫暖地區(qū)，試驗(yàn)篩得的菌種多為中溫菌，適宜寒區(qū)溫度的低溫耐冷菌的研究較少；此外，耐冷菌主要集中于單一菌種的降解研究，研究表明單一微生物的降解效果低于混合菌群[22]。結(jié)合土壤污染狀況及PAHs含量的分析，本研究旨在以菲為篩選碳源，篩選出適宜修復(fù)寒區(qū)農(nóng)田土壤PAHs污染的菌源，構(gòu)建出可應(yīng)用于修復(fù)寒區(qū)農(nóng)田土壤的耐冷降解菌群，為黑土地保護(hù)及污染治理提供新思路。

1 材料與方法

1.1 土壤樣品的采集

土壤樣品采集于PAHs污染較嚴(yán)重的地區(qū)，鏟除表面1 cm左右的表土，以避免地面微生物與土樣混雜，用無菌鐵勺采取5～10 cm[23]處土壤裝入無菌瓶中，置于4 ℃冰箱臨時保存，至實(shí)驗(yàn)室后及時放入?80 ℃超低溫冰箱保存。

1.2 耐冷菌的分離篩選與鑒定

根據(jù)對土壤PAHs污染成分構(gòu)成分析如表1所示，根據(jù)前期文獻(xiàn)查找及實(shí)際污染土壤組分分析結(jié)果，選用PHE作為耐冷菌篩選的馴化碳源。PHE是一種典型的PAHs，分子量小，與有機(jī)質(zhì)有較強(qiáng)的親和力，更容易在水相、固相和有機(jī)相之間轉(zhuǎn)移[24]。

表1 污染土壤中主要PAHs的濃度

1.2.1 試驗(yàn)培養(yǎng)基

無機(jī)鹽培養(yǎng)基（MSM）：4.26 g Na2HPO4、2.65 g KH2PO4、0.02 g CaCl2、1.5 g (NH4)2SO4、0.2 g MgSO4·7H2O，pH值為7.0，加入1 mL微量元素[23]，蒸餾水定容至1 L。

LB 培養(yǎng)基：10.0 g胰蛋白、5.0 g酵母提取物、10.0 g NaCl，pH值為7.0，蒸餾水定容至1 L[25]。

牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基：5.0 g牛肉膏、10.0 g蛋白胨、5.0 g NaCl，pH 值為7.0，蒸餾水定容至1 L[26]。

篩選培養(yǎng)基：已滅菌的MSM培養(yǎng)基中加入一定量的用甲醇溶解的菲儲備液，甲醇揮發(fā)后備用。

固體培養(yǎng)基：在原有培養(yǎng)基基礎(chǔ)上加15 g/L瓊脂粉。

1.2.2 耐冷菌的富集培養(yǎng)及分離與鑒定

取土壤20 g，與無菌水混合振蕩培養(yǎng)，得到微生物懸液，接種到牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基內(nèi)進(jìn)行培養(yǎng)，富集其中微生物。富集培養(yǎng)5 d后，取上清液，轉(zhuǎn)入以菲為單一碳源的無機(jī)鹽液體培養(yǎng)基中，其中菲濃度為200 mg/L，在180 r/min，15 ℃低溫馴化培養(yǎng)[27-28]。每7 d取培養(yǎng)液傳代培養(yǎng)，逐級提高菲濃度至1 000 mg/L。取1 000 mg/L的培養(yǎng)液，稀釋涂布于LB固體培養(yǎng)基上，挑取單菌落，平板劃線分離純化。

將分離純化后的菌株進(jìn)行形態(tài)特征鑒定[29]，革蘭氏染色鑒定及16S rDNA測序[30]。測序后通過NCBI中的BLAST軟件對測序結(jié)果進(jìn)行同源比對，通過MEGA X 采用鄰接法（neighbor-joining）構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.3 混合菌群構(gòu)建方法

將鑒定后的菌株接種在含有液體LB培養(yǎng)基的錐形瓶中，經(jīng)活化、離心、重懸等步驟后接種至以PHE為單一碳源的MSM培養(yǎng)基的150 mL三角搖瓶中，搖床振蕩培養(yǎng)7 d。分析篩選所得菌株的降解能力，將降解效果最優(yōu)菌株選出進(jìn)行拮抗特性分析，拮抗試驗(yàn)采用劃線交叉法，將上述篩選出的菌株在牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基上兩兩之間進(jìn)行交叉劃線，15 ℃培養(yǎng)48 h，觀察各菌株在劃線交叉處的生長狀況，兩者能生長為不拮抗，一株或兩株都不能生長為拮抗。選出最佳構(gòu)建菌群方案。

1.4 PHE最優(yōu)降解條件優(yōu)化及菌群生長曲線分析

測試降解菌株及菌群對PHE降解的最佳條件。將菌株接入LB液體基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，經(jīng)活化、離心、重懸等步驟后，再用無機(jī)鹽培養(yǎng)基將懸浮液調(diào)節(jié)至OD600=1。分別以1%、2%、3%、4%、5%、7%、10%作為接種濃度試驗(yàn)組；以5、10、15、20、25、30 ℃作為溫度試驗(yàn)組；以100、200、400、500、600、800、1 000 mg/L的菲濃度作為底物耐受性試驗(yàn)組；以5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0作為pH試驗(yàn)組；以腐殖酸、淀粉、葡萄糖、蔗糖、蛋白胨、酵母提取物作為接入外源物質(zhì)試驗(yàn)組。以上各組實(shí)驗(yàn)，每組設(shè)置3個平行，對照組加菲但不接種降解菌，180 r/min搖床培養(yǎng)7 d后，檢測PHE的殘留量[31]。生長曲線繪制分析方法參考文獻(xiàn)[22]。

1.5 菌群降解的廣譜性分析

所用的培養(yǎng)基為以3，4-苯并芘、芘、熒蒽、菲、蒽、芴、萘為單一碳源的MSM液體培養(yǎng)基。按3 %的接種量轉(zhuǎn)接于含有30 mL以3，4-苯并芘、芘、熒蒽、菲、蒽、芴、萘為單一碳源的MSM培養(yǎng)基的三角搖瓶中，15 ℃，180 r/min搖床振蕩培養(yǎng)7 d。觀察培養(yǎng)7 d后所得的培養(yǎng)液是否有菌體生長以及唯一碳源多環(huán)芳烴固體底物是否有消耗，測量殘余濃度[30]。

1.6 模擬土壤中菌群對PHE降解率分析

選用正常的農(nóng)田土壤?？屯寥』睾笞匀伙L(fēng)干，剔除根莖和大顆粒雜物，粉碎后過篩，確保粒徑小于2 mm。向土壤中加入溶于甲醇的菲溶液，不斷攪拌使土壤染毒均勻。陳化一周后使用，最終土壤中PHE的濃度為(16.3± 1.19) mg/kg（干質(zhì)量），pH=7.3。分別按照1%、2%、3%、4%、5%的接種量與6 kg染毒土壤拌勻置于容器中，每組設(shè)5個平行，對照組含菲但不加入菌液。20 ℃條件下于10、20、60 d檢測PHE濃度。PHE檢測方法參照文獻(xiàn)[31]。

2 結(jié)果與討論

2.1 鑒定結(jié)果分析

2.1.1 菌落形態(tài)特征及革蘭氏染色結(jié)果

通過逐步增加菲濃度（最終濃度為1 000 mg/L）的方法進(jìn)行馴化，再通過平板劃線分離的方法，從受多環(huán)芳烴污染的土壤中最初篩選出有降解效果的有效菌株7株，分別命名為DX-1、DX-2、DX-3、DX-4、DX-5、DX-6、DX-7。7株P(guān)AHs降解菌在LB固體平板上的菌體形狀、革蘭氏染色及形態(tài)特征如表2所示。

表2 7株菲降解菌形態(tài)特征

注：G-為革蘭氏陰性菌；G+為革蘭氏陽性菌。

Note: G-is Gram negative bacteria; G+is Gram positive bacteria.

2.1.2 測序結(jié)果分析

如圖1所示，通過對細(xì)菌序列NCBI核酸數(shù)據(jù)庫中同源性比對發(fā)現(xiàn)，使用MEGA X構(gòu)建得到的系統(tǒng)發(fā)育樹。DX-3與假單胞菌屬（sp.）高度相似，DX-1與無色桿菌屬（sp.）高度相似，DX-2與寡養(yǎng)單胞菌屬（sp.）高度相似，DX-5與布氏桿菌屬（sp.）高度相似，其余3株菌與甲基桿菌屬（sp.）具有相似性。

圖1 采用鄰接法構(gòu)建16S rDNA系統(tǒng)發(fā)育樹

2.2 耐冷降解菌群構(gòu)建

2.2.1 單菌降解效果評估

單株菌在土壤中定植能力差，菌株組合對土壤環(huán)境有較強(qiáng)的適應(yīng)能力，PHE等難降解有機(jī)物的生物降解過程是通過不同菌株協(xié)同作用的結(jié)果。不同菌株對于PHE的降解能力不同，構(gòu)建菌群需要提前挑選出最適合的菌株，在構(gòu)建菌群前將篩選得出菌株的降解能力進(jìn)行評估，對菌株在初始接種量3 %、溫度為15 ℃、pH值為7.25、PHE初始濃度1 000 mg/L不添加外源物質(zhì)的條件下的降解能力進(jìn)行分析，選取降解能力較強(qiáng)的菌株構(gòu)建菌群。由圖2所示，菌株降解過程中，7株菌中，DX-2降解能力最強(qiáng)，可降解超過35%的PHE，DX-1、DX-3、DX-5、DX-6降解能力略弱于DX-2，可降解20%以上的PHE，DX-4與DX-7降解能力稍弱。由此將降解能力最強(qiáng)的DX-1、DX-2、DX-3初步選出做拮抗試驗(yàn)，檢驗(yàn)構(gòu)建菌群的可行性。

2.2.2 拮抗特性分析

將降解效果較好的3株菌株進(jìn)行完全隨機(jī)組合，劃線培養(yǎng)時，均生長良好，長勢接近，由此說明菌株之間不存在拮抗關(guān)系。如表3所示，拮抗試驗(yàn)中PHE降解菌DX-1、DX-2與DX-3兩兩之間均無拮抗關(guān)系，3株菌株組合間無拮抗關(guān)系。該結(jié)果表明，3 株菌在同一環(huán)境下，不會因互相抑制生長而造成降解效果的降低。結(jié)合上述7株菌對PHE降解及拮抗試驗(yàn)，選取互不拮抗且降解性能較好的菌株DX-1、DX-2、DX-3來構(gòu)建PAHs降解菌群。

圖2 單菌降解能力評估

表3 不同降解菌組合之間拮抗試驗(yàn)結(jié)果

注：—表示無拮抗。

Note: — means no antagonism.

2.3 耐冷降解菌群降解條件優(yōu)化

2.3.1 初始接種量對菌群降解PHE的影響

初始接種量與微生物進(jìn)入新環(huán)境后的遲緩期長短有密切關(guān)系，會影響微生物在一定時間內(nèi)對多環(huán)芳烴底物的降解效果。圖3為探究菌群降解PHE時最適宜初始接種生物量的試驗(yàn)結(jié)果。當(dāng)接種量達(dá)到5%時，培養(yǎng)7 d后PHE的降解效率達(dá)到64.62%。繼續(xù)提升接種量時降解率反而降低，推測當(dāng)初始接種量達(dá)5%后便不能再通過增大接種量來提高降解效率。產(chǎn)生該現(xiàn)象的原因可能是當(dāng)初始接種量很大的情況下，微生物進(jìn)入新環(huán)境后遲緩期很短，細(xì)胞數(shù)量在短時間內(nèi)的急劇增加使得底物能夠快速降解，同時可累積的大量中間產(chǎn)物產(chǎn)生可能會表現(xiàn)出一定的抑制作用。

注：DX-1、DX-2、DX-3為菌株名稱，MIX 表示混合菌群。下同。

2.3.2 培養(yǎng)溫度對菌群降解PHE的影響

隨著溫度的升高，PHE的溶解度會增大，進(jìn)而增加PHE分子的生物利用度。在溫度升高的情況下，PHE可能會轉(zhuǎn)化為更加難以降解的物質(zhì)。因此，溫度超過或低于最適溫度都會抑制菌群的降解作用。如圖4所示，為探究在低溫條件下菌群是否還有降解PHE的能力，測定不同培養(yǎng)溫度條件下菌群的降解效率。結(jié)果表明，菌群在5～30 ℃范圍內(nèi)均能有效降解PHE，降解率的峰值出現(xiàn)在20 ℃，在此溫度下菌群在7 d內(nèi)對底物初始濃度500 mg/L的PHE的降解率達(dá)69.70%。當(dāng)溫度超過25 ℃時菌群的降解率開始降低，說明此時的溫度條件已經(jīng)不是最適合菌群降解PHE的溫度條件。通過試驗(yàn)得知5～30 ℃時皆可對PHE進(jìn)行較為有效的降解，峰值出現(xiàn)在20 ℃附近，這與文獻(xiàn)[32]關(guān)于耐冷菌的研究相似。符合試驗(yàn)想要得到適宜寒區(qū)土壤溫度的耐冷菌的需求。

2.3.3 底物初始濃度對降解菌群降解PHE的影響

降解體系中底物初始濃度的不同，也反映著毒性的高低，試驗(yàn)通過控制底物PHE 的初始濃度，探究菌群對PHE毒性的耐受性。試驗(yàn)結(jié)果如圖5所示，在低濃度下（100和200 mg/L），PHE降解率可保持降解70%以上。在底物濃度逐漸升高的情況下，底物毒性和底物代謝產(chǎn)生中間產(chǎn)物的累積毒性對菌群的抑制效果也更加地明顯，菌群的降解率開始降低。根據(jù)底物濃度與降解率的換算可知，PHE的實(shí)際降解量沒有降低，隨著濃度的增高，實(shí)際降解量增加。結(jié)果表明在高濃度環(huán)境下菌群仍有理想的降解效果，菌群對PHE毒性有很強(qiáng)的耐受性，為嚴(yán)重污染區(qū)PAHs的生物修復(fù)提供參考。在底物濃度為500 mg/L時PHE降解率達(dá)到70%左右，實(shí)際降解量與其他高濃度情況下基本一致，出于耗材和人員安全考慮，本研究選取此濃度作為最佳濃度，以在實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行操作。

圖4 培養(yǎng)溫度對菌群降解 PHE的影響

圖5 底物初始濃度對菌群降解 PHE 的影響

2.3.4 初始pH值對降解菌群降解PHE的影響

pH是影響細(xì)菌生長的關(guān)鍵因素，會對核酸、蛋白質(zhì)、以及細(xì)菌體內(nèi)的酶活性造成影響，適宜的pH條件益于細(xì)菌的生長，能夠最大限度地降解環(huán)境中的PHE。為了探究菌群的pH耐受范圍，本研究考查了不同pH下，混合菌群降解PHE的效率。如圖6所示，試驗(yàn)結(jié)果表明菌群具有較好的pH普適性，堿性較強(qiáng)(pH=10)的環(huán)境中，PHE降解效率較低，在極端pH條件下，菌株生長變慢，活性降低。試驗(yàn)結(jié)果表明在pH值5.0～9.0的環(huán)境中皆可降解45 %以上的PHE，最適條件為pH=8，菌降解率最高，為70.66 %，此時混菌的菌量最大，菌群的新陳代謝能力最強(qiáng)。在堿性環(huán)境中菌群仍能發(fā)揮降解作用，菌群有優(yōu)異耐堿性，這與文獻(xiàn)[32]的研究結(jié)果相似，降解菌株皆有較好的耐堿性。寒區(qū)大部分農(nóng)田土壤的pH值在5.5～8.5之間，極個別地區(qū)土壤pH值達(dá)到了9.4，且PAHs污染土壤的pH會有上升的情況[33]。實(shí)際土壤與菌群活性發(fā)揮的pH區(qū)間相似，有著較高的實(shí)用價值。

圖6 初始pH值對菌群降解PHE的影響

2.3.5 外源物質(zhì)對降解菌群降解PHE的影響

現(xiàn)實(shí)環(huán)境中，微生物降解會受到環(huán)境中營養(yǎng)缺乏的影響而降低菌株對多環(huán)芳烴的降解效果。通過向降解體系中添加額外的碳源及氮源等外源營養(yǎng)物質(zhì)，檢測降解效率。如圖7所示，與不添加任何外源營養(yǎng)的對照組相比，添加外源物質(zhì)對菌群降解PHE 的降解的效果有著或高或低的影響，蛋白胨和蔗糖與對照相比沒有明顯變化，甚至比不添加時效率低。分析是因?yàn)榧尤氲倪@些外來營養(yǎng)源，恰好菌株可以利用維持其生長繁殖，且加入的碳/氮源較之PHE更好利用，故降解PHE的量減少。這與文獻(xiàn)[30]研究類似，外源物質(zhì)的加入并非一定增加降解效率。腐殖酸的添加使得菌群對PHE底物的降解效果大大提高，達(dá)到了83.40 %，這與文獻(xiàn)[28]的研究結(jié)果相似，在腐殖酸的加入下，可提高菌株對PAHs的降解效率?？赏茰y在富含腐殖酸的實(shí)際土壤中利用菌群修復(fù)PHE污染會有更好的效果，而實(shí)際寒區(qū)農(nóng)田土壤中含有大量腐殖酸，與實(shí)驗(yàn)室研究情況相似。

圖7 外源物質(zhì)對降解PHE的影響

2.3.6 最適條件下菌群生長曲線及構(gòu)成分析

如圖8所示，通過對菌群生長情況的檢測分析，生長曲線中菌株和菌群較快的進(jìn)入對數(shù)生長期，在同等環(huán)境下3株菌的生長情況不同，結(jié)果表明菌群的生長情況好于單個菌株。對菌群構(gòu)成的檢測中，降解前后的菌群構(gòu)成出現(xiàn)了細(xì)微的變化，由初始的1∶1∶1的配比變?yōu)榱?1%∶44%∶25%，結(jié)果表明菌群中每株菌生長情況不同，都得到了較好的生長。

注：OD600指溶液在600nm波長處的吸光值。

2.4 菌群降解的廣譜性

污染土壤中，PAHs污染多為多種多環(huán)芳烴的復(fù)合污染，不同類型的多環(huán)芳烴的毒性與生物有效性也不同。表4為菌株P(guān)AHs的抗毒性及降解能力試驗(yàn)結(jié)果，由表4可知，所得菌株對2-4環(huán)的PAHs抗毒性及降解能力（除FLU以外）較強(qiáng)，菌株對2-4環(huán)可降解40%以上；菌株對5環(huán)PAHs BaP僅有15%左右的降解效果。菌株在不添加任何外源物質(zhì)的情況下能夠利用多種常見的多環(huán)芳烴底物，其底物適應(yīng)性顯示出了較大的研究及應(yīng)用價值。這與文獻(xiàn)研究[23-24,27,32-34]相似，同一菌株或菌群可降解多種多環(huán)芳烴。

表4 菌株在其他多環(huán)芳烴中的生長情況

注：“+”表示能夠以此底物生長，“-”表示降解體系未見明顯現(xiàn)象。

“+”Grown with this substrate, “-”Had no obvious phenomenon.

2.5 土壤體系中菌群降解PHE效果

圖9為土壤菌液接種量對土壤環(huán)境中降解PHE的影響結(jié)果。由圖9可知，加入菌液的土壤對PHE的降解效果明顯高于土壤中的自然降解。不同的接種量對降解率影響較大，表明復(fù)雜的土壤環(huán)境體系中，細(xì)菌的遲緩期較長，適應(yīng)環(huán)境發(fā)揮作用的時間較長。在60 d時，接種量為4%或5%時，土壤最終降解皆為75%左右。表明此時接種量的增加對降解效果促進(jìn)作用很低，菌群在實(shí)際土壤中的降解效率略低于實(shí)驗(yàn)室條件下的效果。從長遠(yuǎn)考慮，在實(shí)際生產(chǎn)中對于PAHs污染可通過試驗(yàn)確定合適的濃度，以便后續(xù)菌劑生產(chǎn)的成本控制。

圖9 菌群在土壤中降解 PHE 效果

綜上所述，菌株的最適降解條件與土壤的實(shí)際情況并非完全一致，皆在菌株降解能力的有效區(qū)間內(nèi)，具有實(shí)際的利用價值及意義。

3 結(jié) 論

目前研究的降解微生物多來自于溫暖地區(qū)，難以適應(yīng)寒區(qū)氣候特征的特性，難以改善農(nóng)田土壤環(huán)境。本文研究基于寒區(qū)農(nóng)田土壤PAHs污染，進(jìn)行選取典型污染物PHE試驗(yàn)設(shè)計(jì)，得到以下結(jié)論：

1）設(shè)計(jì)低溫菌株篩選分離試驗(yàn)，得到可在溫度15 ℃條件下降解PHE的菌株7株，將性能評估選取其中降解性能最優(yōu)且互不拮抗的3株菌構(gòu)建混合菌群。

2）通過不同環(huán)境下菌株的降解能力的分析，確定菌株可發(fā)揮最佳降解性能的環(huán)境條件為溫度20 ℃、pH值為8、腐殖酸參與的環(huán)境，在7 d降解PHE達(dá)到80%。將菌株應(yīng)用在實(shí)驗(yàn)室PHE污染土壤中可在20 ℃、土壤pH值為7.3的情況下，60 d降解土壤中75%的污染物。

3）根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果表明菌株具有良好的耐低溫，抗毒、抗堿性效果，經(jīng)驗(yàn)證，所得菌株可利用多種類型PAHs，如萘、蒽、芴、芘、熒蒽、苯并[a]芘等，可對修復(fù)寒區(qū)實(shí)際土壤多環(huán)芳烴復(fù)合污染，高毒性污染土壤pH上升情況提供基礎(chǔ)，為土壤環(huán)境可持續(xù)發(fā)展提供思路。

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Isolation, identification and characterization of cold resistance and PAHs-degrading bacteria

Sun Nan, Zhu Guanglei, Yang Anpei, Wang Siming

(,150030,)

Polycyclic aromatic hydrocarbons (PAHs) are highly toxic organic contaminants. The ubiquitous class of aromatic compounds is usually composed of 2 to 7 aromatic rings in nature. The accumulation of PAHs has been widely spread in farmland soil in recent years. The reason can be that the various wastes and gas pollutants have been ever-increasing beyond the repairing and purification capacity of the environment in the world. Microbial remediation of PAHs can be expected to serve as high efficiency, low cost, and no secondary pollution. Among them, biodegradation has been the most potential soil remediation to eliminate the PAHs pollutants in the environment. Particularly, the PAHs have posed an enormous safety risk to the farmland soil ecosystems in Northeast China. The farmland soil contains a large number of carcinogenic, teratogenic, and mutation polycyclic aromatic hydrocarbons at present, due to the unreasonable use of agricultural inputs and sewage irrigation. However, the most commonly-used, commercial and microbial microorganism degradation of PAHs is confined to the climatic characteristics of the cold region in the farmland. It is a high demand for efficient PAH-degrading bacteria in the natural environment, particularly for the PAH-contaminated soil in the northern cold area. In this study, a typical pollutant of PAHs, phenanthrophene (PHE) was used as the substrate, in order to reduce the food risk of the farmland soil environment. The domestication temperature was 15℃ for the seven cold-resistant bacteria. The PHEs as the sole carbon and energy sources were screened from the soil. The bacterial mixtures were obtained from an equal volume mixture of seven strains. The high-performance liquid chromatography was then utilized to optimize the use conditions for the most effective strains or mixtures of strains. Three highly effective PHE-degrading capabilities (named DX-1, DX-2, and DX-3) were identified and screened out by the morphological observation and 16S rRNA gene sequencing. 16S rRNA gene sequencing analysis was performed on the DX-1, DX-2, and DX-3, which were identified assp.,sp., andsp., respectively. After identification and degradation performance, three strains with no antagonistic relationship between two and three combinations were selected, where the degradation rate of PHE reached 80% at 20°C, 5% inoculum, pH=8, 500mg/L substrate concentration, and the humic acid as exogenous substance. The broad-spectrum analysis of the carbon source of the strain showed that the cold-resistant bacterium degraded the PAHs of 2-5 loops between 15% and 85%. 75% PHE was degraded in the 60d, when the strain was applied to the soil at the temperature of 20℃. Consequently, the cold-resistant bacterium can be expected for the adaptation conditions of the actual soil environment. The finding can provide the immobilized strain and theoretical basis for the microbial remediation of PAH pollution in the contaminated black soil in cold areas.

soils; pollution; microbiology; cold area; cold resistant bacterium; PAHs; bioremediation

10.11975/j.issn.1002-6819.2022.17.024

X53

A

1002-6819(2022)-17-0224-08

孫楠，朱廣雷，楊安培，等. 寒區(qū)降解多環(huán)芳烴耐冷菌株的分離鑒定及特性[J]. 農(nóng)業(yè)工程學(xué)報，2022，38(17)：224-231.doi：10.11975/j.issn.1002-6819.2022.17.024 http://www.tcsae.org

Sun Nan, Zhu Guanglei, Yang Anpei, et al. Isolation,identification and characterization of cold resistance and PAHs-degrading bacteria[J]. Transactions of the Chinese Society of Agricultural Engineering (Transactions of the CSAE), 2022, 38(17): 224-231. (in Chinese with English abstract) doi：10.11975/j.issn.1002-6819.2022.17.024 http://www.tcsae.org

2022-07-02

2022-08-25

國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（52179034、51809043）；黑龍江省自然科學(xué)基金項(xiàng)目（YQ2019E006）；中國博士后科學(xué)基金項(xiàng)目（2017M621233）；中國黑龍江省土壤保護(hù)與修復(fù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室開放項(xiàng)目（SPR2018002）

孫楠，教授，博士生導(dǎo)師，研究方向?yàn)檗r(nóng)業(yè)水土環(huán)境修復(fù)。Email：sunnan@neau.edu.cn