白藜蘆醇的提取、合成技術(shù)研究進展*

郭雅潔，喬子桐，張穎奇，張純剛

(遼寧中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，遼寧 大連 116620)

白藜蘆醇，別名芪三酚，是一種非黃酮類的多酚化合物，1940年由日本學(xué)者從植物毛葉藜醇的根部提取得到[1]。因其具有抗癌、抗氧化、抗炎癥、降脂、減少細胞衰老、防治心血管疾病等功效[2-3]，而受到人們的廣泛關(guān)注。白黎蘆醇的制備方法主要分為植物提取法以及合成法。

1 植物提取法

天然的白藜蘆醇是由于植物受到外界刺激而產(chǎn)生的二次代謝物，由苯丙酸通過莽草酸途徑合成而來[4]。目前已經(jīng)在 21科、31屬、72種植物中發(fā)現(xiàn)白藜蘆醇[5-8]。白藜蘆醇提取常見的方法有傳統(tǒng)溶劑提取法、超聲波提取法、微波輔助法、酶解法、CO2超臨界萃取法等。

1.1 傳統(tǒng)溶劑提取法

溶劑提取法中水提法最簡單易行，但對于白藜蘆醇來講，由于其難溶于水，又呈弱極性，通常需用有機溶劑來提取[9-10]。研究有機溶劑提取花生中白藜蘆醇，乙醇濃度對提取率的影響，結(jié)果表明[11]，乙醇濃度在20%～90%范圍內(nèi)，隨著濃度的升高，提取率逐漸增加，最終確定乙醇濃度以80%～90%為宜。王宓等[12]比較了乙酸乙酯、氯仿、乙醚、乙酸乙酯與正己烷、二氯甲烷混合溶液及雙水相體系對葡萄酒中白藜蘆醇的提取效果，發(fā)現(xiàn)乙酸乙酯對白藜蘆醇的提取率較高，可達到80%。是目前認為的白藜蘆醇最佳提取溶劑。

1.2 超聲提取法

超聲提取法是一種物理的破碎進程，利用超聲波產(chǎn)生高速、強烈的空化效應(yīng)和攪拌作用來破壞植物藥材的細胞壁結(jié)構(gòu)，溶劑滲透到藥材細胞中使其瞬間破裂，植物細胞中的藥物成分得以釋放、直接進入溶劑中并充分混合，從而提高提取效率[13]。高強等[14]以乙醇為提取劑，采用花生殼作為研究材料，當(dāng)條件為：乙醇用量50 g、乙醇體積分數(shù)50%、超聲功率分數(shù)45%、超聲處理時間10 min時，白藜蘆醇的提取率可高達2.166%。張思思等[15]以白藜蘆醇得率為指標(biāo)，在單因素實驗的基礎(chǔ)上，采用正交實驗考察提取溫度、提取時間、液料質(zhì)量比和乙醇濃度4個因素對超聲提取紫斑牡丹籽中白藜蘆醇的影響做研究，優(yōu)選出最佳的超聲提取工藝條件，當(dāng)超聲輔助提取白藜蘆醇的最佳工藝條件為提取溫度70 ℃，作用時間30 min，液料質(zhì)量比40，提取用乙醇濃度65%，提取2次。在此條件下，白藜蘆醇得率為10.62 mg/g。

1.3 微波輔助法

微波輔助法是一種具有發(fā)展?jié)摿Φ木G色萃取分離技術(shù)，被廣泛應(yīng)用于各種天然活性成分的提取中[16]。但微波輔助提取法具有明顯的熱效應(yīng)且微波泄漏對工作者的身體危害較大[17]。張初署等[18]對花生根中的白藜蘆醇微波輔助提取工藝進行研究，運用L16(45)正交試驗對微波輔助提取花生根中的白藜蘆醇工藝進行優(yōu)化，結(jié)果表明當(dāng)輸出功率400 W、微波作用時間 4.5 min、萃取溫度80 ℃、乙醇體積分數(shù)60%、料液比1∶14(g/mL)時，白藜蘆醇的提取率達0.367%。樊迎等[19]運用微波輔助乙醇法來提取海紅果中的白藜蘆醇，經(jīng)正交試驗優(yōu)化后得出：當(dāng)條件為微波功率360 W，微波時間120 s，提取料液比為1 g∶25 mL、提取劑體積濃度80%時，白藜蘆醇的平均提取率可達 97.06 μg/g。與單純用乙醇提取相比，大幅度縮短提取時間，提高了效率。

1.4 酶解法

由于自然界中白藜蘆醇的含量較低，在提取前需要對提取對象進行生物轉(zhuǎn)化，如將樣本中的白藜蘆醇苷和白藜蘆醇多聚體衍生物通過酶解轉(zhuǎn)化為白藜蘆醇，可大大提高白藜蘆醇提取率[20-21]。瞿衛(wèi)林等[22]利用藥材自身酶進行自然發(fā)酵酶解，得出虎杖粗碎至顆粒度為2～3 mm，加入3倍量的水浸潤后，在 45 ℃下恒溫酶解2 d，能使虎杖中白藜蘆醇的含量與傳統(tǒng)工藝相比提高2.72倍。陶明寶等[23]采用單因素和正交試驗，以白藜蘆醇的含量和浸膏得率為評價指標(biāo)，結(jié)果顯示酶解法提取白藜蘆醇的最佳條件為：酶種類為纖維素酶，酶用量0.6%，酶解 pH=5.0，酶解溫度50 ℃，酶解時間36 h，酶解后的樣品加入8倍量80%乙醇，85 ℃(藥液微沸)提取3次，每次2 h。原藥材中白藜蘆醇的含量為0.459%，經(jīng)酶解后白藜蘆醇含量上升至1.773%。

1.5 CO2 超臨界萃取法

超臨界萃取技術(shù)(supercritical fluid extraction)是一種時效高，提取率大的新型萃取手段。超臨界二氧化碳萃取技術(shù)具有純凈、安全、無溶劑殘留、提取率高、流程簡單、溶劑二氧化碳價格相對低廉且可循環(huán)使用等諸多優(yōu)點，廣泛應(yīng)用于食品、醫(yī)藥等領(lǐng)域[24]。一般在中藥中提取白藜蘆醇所需溫度在80 ℃左右，提取工藝在幾個小時或者更長。張青松等[25]利用超臨界技術(shù)萃取葡萄皮渣中的白藜蘆醇，篩選7.5%的乙醇為最佳夾帶劑，僅需達到38 ℃、13 MPa、萃取17 min，白藜蘆醇平均得率可達0.087%。賀帥等[26]選用丁二酸二異辛酯磺酸鈉(AOT)、聚維酮(PVP k-90)、泊洛沙姆(Poloxamer 188)、聚山梨酯-80、乙醇作為增溶劑，采用超臨界 CO2(SC-CO2)提取虎杖中白藜蘆醇，通過單因素獲得最佳提取工藝：P=25 MPa、T=50 ℃、AOT濃度為0.05 mol/L、提取次數(shù)為3次，在此條件下白藜蘆醇的提取率為0.31 mg/g。

2 合成方法

現(xiàn)階段，白藜蘆醇主要從植物的組織中分離提取，但由于白藜蘆醇在植物組織中含量不高，再加上原料極易受到外界影響，使得從植物中提取分離白藜蘆醇的成本過高。因此常采用人工合成的方法制備白藜蘆醇，常見合成方法有生物合成法和化學(xué)合成法。

2.1 生物合成法

而且白藜蘆醇的化學(xué)合成耗能較高、產(chǎn)量和純度偏低，并且容易對生態(tài)環(huán)境造成污染。相對從植物中提取和化學(xué)合成法，微生物合成占地少、操作簡單、不破壞環(huán)境；因此，通過基因工程手段構(gòu)建重組菌來生產(chǎn)白藜蘆醇具有很好的應(yīng)用價值[27-28]。

朱屹東[29]利用代謝工程改造大腸桿菌，將來源于深紅酵母的TAL基因、香芹菜的4CL基因和葡萄的STS基因轉(zhuǎn)化入E.coli BL21(DE3)內(nèi)進行表達，構(gòu)建了重組表達質(zhì)粒 pACYC-TAL-4CL和pRSF-STS，可得到 0.23 mg·L-1的白藜蘆醇。提高合成白藜蘆醇所需前體物質(zhì)的含量后，將三葉草根瘤菌丙二酰輔酶 A 途徑中的丙二酸合成酶matB和丙二酸載體蛋白matC基因轉(zhuǎn)入大腸桿菌進行表達，構(gòu)建了重組表達質(zhì)粒pET-matB-matC，可使白藜蘆醇的產(chǎn)量達到3.2 mg·L-1。

2.2 化學(xué)合成

白藜蘆醇已被推斷出可從類丙基丙烷合成途徑合成。目前化學(xué)合成白藜蘆醇的方法有：Perkin法、Heck法、Wittig-Horner法和羰基化合物的縮合法。

2.2.1 Perkin法

是一種有機化學(xué)中的可以生成β-芳丙烯酸類化合物的經(jīng)典縮合反應(yīng)[30]。該反應(yīng)可以應(yīng)用于白藜蘆醇的合成。Guy等[31]以3,5-二異丙氧基苯甲醛和對異丙氧基苯乙酸為原料，利用 Perkin反應(yīng)首先合成了單一的順式中間產(chǎn)物,然后再轉(zhuǎn)化為單一的反式白黎蘆醇，產(chǎn)率為55.2%。Solladie等[32]應(yīng)用Perkin反應(yīng)以3,5-二異丙氧基苯甲醛和對異丙氧基苯乙酸為原料合成，得到了單一順式構(gòu)型的產(chǎn)品，再經(jīng)異構(gòu)化、脫除保護基得到反式白藜蘆醇，其總收率高達55.2%。

2.2.2 Heck法

鈀催化法合成白藜蘆醇有著總產(chǎn)率高，條件溫和，步驟簡單等優(yōu)點，是化學(xué)合成白藜蘆醇的一個重要手段[33]。但是其催化劑為含鈀絡(luò)合物，價格昂貴，毒性巨大，不適合工業(yè)生產(chǎn)。Francisco等[34]報道了一種新的使用鈀催化的交叉耦合法合成白藜蘆醇，整個反應(yīng)共四步并且所使用的試劑均廉價易得，避免了金屬銅催化劑的使用，總產(chǎn)率62%。

2.2.3 Wittig-Horner法

Wittig-Horner反應(yīng)是Wittig反應(yīng)的有效補充，是Wittig反應(yīng)應(yīng)用范圍的擴展[35-36]。Wittig-Horne試劑是通過與醛或酮反應(yīng)、雙鍵還原反應(yīng)、醇的溴代反應(yīng)、溴代物與銨的反應(yīng)，進一步合成新的雙鍵化合物的反應(yīng)[37]。劉強等[38]測得反應(yīng)的得率為92.7%，全合成總收率為75.76%。李印釗等[39]以3,5-二羥基苯甲酸為原料,通過甲基化、還原、溴化、Arbuzov重排,生成關(guān)鍵中間體3,5-二甲氧基芐基膦酸酯,再與對甲氧基苯甲醛經(jīng) Wittig-Horner縮合,用三溴化硼脫甲基,得到單一的反式白黎蘆醇，產(chǎn)率為39.3%。

3 結(jié) 語

歐美已批準(zhǔn)上市的白藜蘆醇高端制劑產(chǎn)品(包括藥品及保健品)已近于千余種，由于工藝的限制，我國生產(chǎn)的白藜蘆醇多以原料混合物形式使用或出口[40]，產(chǎn)品附加值大受限制。目前的研究表明白藜蘆醇的提取合成技術(shù)已有較好成果，但距工業(yè)化應(yīng)用仍有較大差距。我們應(yīng)以產(chǎn)業(yè)化為目標(biāo)繼續(xù)深入研究白藜蘆醇。