正交試驗(yàn)法和響應(yīng)面法優(yōu)選蒲公英根甾醇提取

陳倩,王建芳,曹讓,楊培志

正交試驗(yàn)法和響應(yīng)面法優(yōu)選蒲公英根甾醇提取

陳倩,王建芳,曹讓,楊培志*

西北農(nóng)林科技大學(xué)草業(yè)與草原學(xué)院, 陜西 楊凌 712100

優(yōu)化超聲波浸提蒲公英根甾醇的工藝條件。試驗(yàn)控制1.00 g樣品用20 mL乙醇在超聲波清洗機(jī)里進(jìn)行浸提，設(shè)計(jì)正交試驗(yàn)和響應(yīng)面試驗(yàn)研究甾醇提取率隨著乙醇濃度、超聲提取時(shí)間、超聲提取溫度三個(gè)因素水平變化而變化的規(guī)律。正交優(yōu)化分析得出最佳提取工藝下，能提出甾醇含量為46.01 mg/g，此時(shí)乙醇濃度為80%，提取時(shí)間為20 min，提取溫度為60 ℃。響應(yīng)面分析結(jié)果為乙醇濃度87.42%、提取時(shí)間10.83 min、提取溫度59.97 ℃，這時(shí)每克蒲公英根提取甾醇的含量最高為67.26 mg。該結(jié)果表明響應(yīng)面法工藝條件下得到的蒲公英根甾醇提取率高于正交試驗(yàn)所得。

蒲公英; 甾醇; 化合物分離與提取

蒲公英（Hand.-Mazz）是一種多年生草本植物，該植株含有黃酮類、酚酸類、甾醇類和多糖類等有效物質(zhì)，具有豐富的藥理活性，整株皆可入藥。其藥理功效有抑菌消炎、調(diào)節(jié)血糖、抗衰老、增強(qiáng)免疫力、抑制腫瘤等，除此之外，蒲公英還富含蛋白質(zhì)、脂肪酸、氨基酸、維生素及微量元素，是一種藥食兼用的植物[1-4]。蒲公英甾醇具有抗高膽固醇和抗氧化[5]、抗炎[6,7]、抗菌[8]、調(diào)節(jié)免疫[9]、抑制癌細(xì)胞[10]等多種藥理功效[10-14]。此外，甾醇在食品、保健品、化妝品等各個(gè)不同的鄰域均有一定的應(yīng)用,故本試驗(yàn)研究甾醇的提取工藝具有重要的實(shí)際意義[15]。近年來(lái)對(duì)植物甾醇的提取研究也越來(lái)越多，但對(duì)蒲公英植物甾醇提取的研究較為少見，在蒲公英甾醇的提取工藝上的優(yōu)化研究更是少之又少，由于人們對(duì)蒲公英價(jià)值的逐步開發(fā)，蒲公英種植技術(shù)也逐漸成熟,優(yōu)化蒲公英甾醇提取工藝的研究可以得到一種更高效的提取方法，從而有利于之后相關(guān)產(chǎn)品的研究開發(fā)及應(yīng)用[16]。

1 材料和方法

1.1 材料和試劑

供試材料：蒲公英根采于西北農(nóng)林科技大學(xué)草業(yè)與草原學(xué)院試驗(yàn)地（自2018年7月種植，種植兩年半后于春季生長(zhǎng)期內(nèi)采摘得到），在65 ℃下烘干粉碎后過(guò)60目篩裝袋以備后續(xù)使用。

試劑：甾醇標(biāo)品（HPLC≥98%）購(gòu)于索萊寶科技有限公司；FeCl3?6H2O、濃硫酸、磷酸、無(wú)水乙醇（均為AR）等試劑均從西北農(nóng)林科技大學(xué)草業(yè)與草原學(xué)院實(shí)驗(yàn)室獲取。

1.2 儀器與設(shè)備

分光光度計(jì)（V-1000），上海翱藝公司、超聲波清洗機(jī)（SB25-12DT），寧波新芝生物科技公司、電子分析天平（PX224ZH/E），奧豪斯儀器（常州）公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 樣品的制備精確稱取樣品1.00 g放于50 mL的具塞離心管中，加入一定濃度的乙醇溶劑20 mL，設(shè)置超聲波清洗機(jī)的溫度和時(shí)間一定，將取出的樣品趁熱過(guò)濾到50 mL容量瓶中，濾液和濾渣用相應(yīng)濃度的乙醇溶劑清洗3-5次后定容搖勻得到待測(cè)液，試驗(yàn)設(shè)置3個(gè)重復(fù)進(jìn)行測(cè)定。

1.3.2 待測(cè)液中甾醇含量測(cè)定精確稱取甾醇標(biāo)準(zhǔn)樣品3500 μg溶解于無(wú)水乙醇溶劑，再定容于25 mL容量瓶中，此時(shí)標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度為140 μg/mL，甾醇含量采用硫磷鐵顯色劑法測(cè)定[17]。由此可得：=0.0044-0.0222，2=0.9929。此時(shí)1.00 g蒲公英根樣品中甾醇含量（mg）按下式計(jì)算：

表示樣品總甾醇含量（mg/g），表示由標(biāo)準(zhǔn)曲線所得試樣濃度（μg/mL），表示試樣體積（mL），表示稀釋倍數(shù)，表示試樣重量（g）

1.3.3 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)根據(jù)試驗(yàn)開始前期所得到的單因素試驗(yàn)結(jié)果，選取提取時(shí)間、提取溫度和乙醇濃度3個(gè)主要影響因素，采用正交試驗(yàn)的方法，設(shè)置3因素3水平正交表L9(34)進(jìn)行試驗(yàn)，其中料液比為1：20 g/mL，提取次數(shù)為1次，各因素和水平條件如下[18]。

表 1 L9（34）正交試驗(yàn)因素水平

1.3.4 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)將各個(gè)因素水平按照如下表格里的因素水平用Design-expert12軟件進(jìn)行Box-Behnken模型試驗(yàn)，按響應(yīng)面法共設(shè)計(jì)了17組試驗(yàn)，對(duì)乙醇濃度、超聲提取時(shí)間和提取溫度3個(gè)因素進(jìn)行改進(jìn)，以蒲公英根甾醇提取率為響應(yīng)面，確定最優(yōu)提取條件[19]。

表 2 響應(yīng)面因素水平

1.3.5 數(shù)據(jù)分析處理采用Excel對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行記錄分析，通過(guò)SPSSAU設(shè)計(jì)正交試驗(yàn)并得出處理結(jié)果,用Design-expert12軟件進(jìn)行響應(yīng)面設(shè)計(jì)及分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 正交試驗(yàn)結(jié)果分析

由下表3蒲公英根甾醇正交試驗(yàn)方差分析結(jié)果可得，本試驗(yàn)選取的三個(gè)因素都對(duì)蒲公英根甾醇提取產(chǎn)生極大影響，將影響的主次分別排序如下：乙醇濃度(%)>提取溫度(℃)>提取時(shí)間(min)，即A>C>B（按甾醇提取率比較）。正交方差分析得出甾醇提取的正交試驗(yàn)最佳方案為A2B2C3，即乙醇濃度80%，溫度60 ℃，時(shí)間20 min。在該條件下，每克蒲公英根中可以提出46.01 mg的甾醇。利用三因素方差分析方法研究水平A、B、C對(duì)甾醇提取的影響，由下表4可知，因素A、Ｂ、Ｃ對(duì)蒲公英根甾醇的提取均可產(chǎn)生極顯著性影響。

表 3 正交試驗(yàn)結(jié)果

表 4 正交方差分析結(jié)果

2.2 響應(yīng)面法試驗(yàn)結(jié)果分析

以蒲公英根甾醇提取率作為試驗(yàn)分析的響應(yīng)值，用Design-expert12軟件模擬甾醇提取模型，得到回歸方程：=57.75+1.28-0.5212+10.85+0.9875+5.90-3.34-6.102-1.142-5.522（2=0.8545）。對(duì)蒲公英根甾醇提取做響應(yīng)面方差分析如下，該次模擬出的模型中=4.57（0.010.05），此結(jié)果表明響應(yīng)面分析得到的二次回歸方程具有顯著性。該模型中失擬項(xiàng)=1.85，=0.2788>0.05，證明失擬項(xiàng)不顯著，2=0.8545>0.80,表明響應(yīng)值85.45%的變化都能夠被該模型預(yù)測(cè)出來(lái)，變異系數(shù)（CV）=11.51（%），表明用響應(yīng)面法分析蒲公英根中甾醇提取率并建立模型與預(yù)測(cè)具有可行性，模擬出的二次回歸方程中所有的二次項(xiàng)系數(shù)值均為小于零，說(shuō)明該模型存在頂點(diǎn)（最大值），頂點(diǎn)表示最大的甾醇提取值，由下圖1也可以相應(yīng)得出響應(yīng)值存在穩(wěn)定的頂點(diǎn)。

表 5 響應(yīng)面方差分析結(jié)果

由下圖1可以得出：通過(guò)Design-Expert12軟件預(yù)測(cè)出的甾醇的最優(yōu)提取工藝為乙醇濃度為87.42%，提取時(shí)間10.83 min，提取溫度59.97 ℃，此時(shí)每克蒲公英根中可提取出67.26 mg的甾醇。

圖 1 不同因素下的三維曲面

3 討 論

正交試驗(yàn)和響應(yīng)面分析法是基于建立兩種不同的模型來(lái)對(duì)試驗(yàn)水平進(jìn)行分析的方法，正交試驗(yàn)?zāi)艿贸霾煌蛩夭煌街g的最佳組合，但其只能分析離散型的數(shù)據(jù),范圍相對(duì)來(lái)說(shuō)較小，且分析出的數(shù)據(jù)精度較低, 預(yù)測(cè)出的結(jié)果相對(duì)較差[20-24]。響應(yīng)面法以數(shù)學(xué)模型構(gòu)建二次回歸方程，該回歸方程精確度高，能夠合理預(yù)測(cè)出最佳的有效結(jié)果。與正交試驗(yàn)相比，響應(yīng)面分析法不僅能夠分析試驗(yàn)設(shè)置的水平內(nèi)的最佳組合，還能找出除試驗(yàn)設(shè)置水平以外的其它最佳組合，綜合比較之下得出響應(yīng)面法優(yōu)化出的甾醇最優(yōu)提取工藝較正交試驗(yàn)得出的結(jié)果更優(yōu)[25-28]。本試驗(yàn)可以得出蒲公英甾醇的最優(yōu)提取方案，但未涉及甾醇的純化及應(yīng)用方面。試驗(yàn)采用超聲波法對(duì)蒲公英根甾醇進(jìn)行提取，與傳統(tǒng)的醇提、回流相比，可以縮短甾醇的提取時(shí)間，除此之外，超聲法提取甾醇操作簡(jiǎn)便可行、在試驗(yàn)中提取料液雜質(zhì)成分較低、提取出的有效物質(zhì)比較容易分離和純化,且該方法提取工藝簡(jiǎn)便，可以大量普及使用[29]。超聲波提取法由于其具有的提取高效、快速、節(jié)能的優(yōu)點(diǎn)，在行業(yè)內(nèi)的發(fā)展前景非常廣闊。

4 結(jié) 論

綜上所述，用濃度80%的乙醇在60 ℃的超聲波清洗機(jī)中提取20 min，可得到正交試驗(yàn)最佳結(jié)果，此時(shí)蒲公英根甾醇提取率為4.60%，即每克蒲公英根樣品中最高可提得甾醇含量為46.01 mg/g。響應(yīng)面法分析蒲公英根甾醇提取數(shù)據(jù)可得：當(dāng)乙醇濃度為87.42%，提取時(shí)間10.83 min，提取溫度59.97 ℃時(shí)，蒲公英根甾醇模擬得到的提取率高于正交試驗(yàn)?zāi)M出的結(jié)果，此時(shí)的得到的最佳結(jié)果為6.73%，此時(shí)最高能提到甾醇含量為67.26 mg/g，即響應(yīng)面分析得到的甾醇提取率比正交試驗(yàn)得到的高2.13%。對(duì)模擬出來(lái)的結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證后發(fā)現(xiàn)得到的甾醇提取率為6.33%，與模型結(jié)果相似，差異不顯著，0.05。在具體實(shí)踐時(shí)應(yīng)根據(jù)實(shí)際需要選擇相應(yīng)的方法。

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Sterol Extracting fromRoot by the Optimal Orthogonal Test and Response Surface Methodology

CHEN Qian, WANG Jian-fang, CAO Rang, YANG Pei-zhi*

712100,

Optimization of process conditions for ultrasonic extraction ofroot sterols. Experimentally controlled 1.00 g samples were extracted with 20 mL of ethanol in an ultrasonic cleaner. Orthogonal and response surface tests were designed to investigate the pattern of sterol extraction rate with the changes in the levels of three factors: ethanol concentration, ultrasonic extraction time, and ultrasonic extraction temperature. The orthogonal optimization analysis concluded that under the best extraction process, the sterol content was 46.01 mg/g, and the ethanol concentration was 80%, the extraction time was 20 min, and the extraction temperature was 60 ℃. The results of the response surface analysis were 87.42% ethanol concentration, 10.83 min extraction time and 59.97 ℃ extraction temperature, and the highest sterol content of 67.26 mg per gram ofroot extracted. This result suggested that the sterol extraction rate ofroot obtained under the process conditions of response surface method was higher than that obtained from the orthogonal test.

Hand.-Mazz; Sterol; Compound isolation and extraction

S326

A

1000-2324(2022)06-0913-05

2022-07-10

2022-09-15

陳倩(1998-),女,碩士在讀,草種質(zhì)與逆境生物學(xué)研究方向. E-mail:2938293578@qq.com

Author for correspondence. E-mail:yangpeizhi@126.com

10.3969/j.issn.1000-2324.2022.06.016