LysM蛋白在植物免疫中的作用

秦春曉，李 瑩，張?jiān)佈?，戴紹軍

（1.東北林業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院東北鹽堿植被恢復(fù)與重建教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，黑龍江哈爾濱150040；2.上海師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院上海植物種質(zhì)資源工程技術(shù)研究中心，上海200234）

溶解素基序（LysM）一般由42～48個(gè)氨基酸殘基組成，N端的16個(gè)氨基酸和C端的10個(gè)氨基酸相對(duì)保守［1］，含有對(duì)稱的βααβ的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)，其中兩個(gè)α螺旋位于雙鏈反向平行的β折疊一側(cè)［2］.除古細(xì)菌外，幾乎所有生物都具有含LysM的蛋白質(zhì)，且多為分泌蛋白或膜蛋白［3］.含LysM的植物受體激酶可以識(shí)別或感應(yīng)共生菌并誘導(dǎo)其對(duì)真菌的抗性［4］.根據(jù)蛋白是否含有激酶結(jié)構(gòu)域，LysM家族蛋白分為兩類，包括LysM受體類蛋白（LYP）和LysM受體激酶（LYK）［2］，都在植物免疫應(yīng)答中具有重要作用.

1 水稻LysM蛋白參與幾丁質(zhì)應(yīng)答

水稻幾丁質(zhì)激發(fā)子結(jié)合蛋白（CEBiP）胞外具有2個(gè)LysM結(jié)構(gòu)域和1個(gè)跨膜域，是首個(gè)被鑒定的真菌幾丁質(zhì)觸發(fā)子結(jié)合的多糖受體，在感知幾丁質(zhì)觸發(fā)子和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中發(fā)揮作用.敲除OsCEBiP基因的水稻植株，幾丁質(zhì)誘導(dǎo)的活性氧（ROS）爆發(fā)和下游幾丁質(zhì)響應(yīng)基因被嚴(yán)重抑制［5］.此外，OsCERK1（chitin elicitor receptor kinase）含有1個(gè)LysM結(jié)構(gòu)域、1個(gè)跨膜域和1個(gè)胞內(nèi)激酶功能域，對(duì)水稻幾丁質(zhì)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)至關(guān)重要.敲低OsCERK1也會(huì)顯著抑制幾丁質(zhì)誘導(dǎo)的防御反應(yīng).雖然OsCERK1不具有直接結(jié)合殼聚糖的能力.但在感知到幾丁質(zhì)寡糖信號(hào)后，OsCEBiP和OsCERK1會(huì)迅速形成異源二聚體，激活下游信號(hào)以進(jìn)行防御反應(yīng)［6］.此外，在水稻中OsLYP4和OsLYP6均含有LysM，作為感受細(xì)菌肽聚糖（PGN）和幾丁質(zhì)的共受體發(fā)揮作用，兩者可以形成同源和異源二聚體，并與OsCEBiP相互作用，參與幾丁質(zhì)感知與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程［7］.

感 知 到 幾 丁 質(zhì) 后，OsCERK1與OsRacGEF1（guanine nucleotide exchange factors）互 作 并 將OsRacGEF1的C末端S549磷酸化，進(jìn)而OsRacGEF1作為OsRac1的鳥(niǎo)嘌呤核苷酸交換因子激活OsRac1［8］，隨后OsRac1與OsMAPK3/6（mitogen-activated protein kinase）互作并將其激活［9］.同時(shí)，OsCERK1與多種類受體胞質(zhì)激酶（RLCK）互作.質(zhì)膜上OsCERK1的激酶結(jié)構(gòu)域與OsRLCK185互作并將其磷酸化［10］，進(jìn)而OsRLCK185磷酸化OsMAPKKKε C末端調(diào)控域，從而級(jí)聯(lián)磷酸化OsMAPKK4和MAPK3/6［11］，激活MAPK級(jí)聯(lián)信號(hào)通路.OsMAPK3/6可以磷酸化bHLH轉(zhuǎn)錄因子OsRAI1，調(diào)節(jié)幾丁質(zhì)誘導(dǎo)基因OsPAL1和OsWRKY19的轉(zhuǎn)錄水平［9，12］，啟動(dòng)植物免疫應(yīng)答反應(yīng).此外，OsCERK1也可以調(diào)控其他類受體胞質(zhì)激酶，如OsRLCK57，OsRLCK107，OsRLCK118和OsRLCK176等，參與幾丁質(zhì)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)［13-15］，如圖1（a）所示.

2 擬南芥LysM蛋白參與免疫應(yīng)答

擬南芥基因組共編碼5個(gè)LYK，包括LYK1/CERK1和LYK2～LYK5［16-17］.擬南芥AtCERK1含有3個(gè)LysM結(jié)構(gòu)域、1個(gè)跨膜域和1個(gè)胞內(nèi)激酶域［18］.與OsCERK1不同，AtCERK1可以直接與幾丁質(zhì)結(jié)合［19］，AtCERK1胞外的3個(gè)LysM結(jié)構(gòu)域都是幾丁質(zhì)結(jié)合所必需的，任何一個(gè)LysM結(jié)構(gòu)域缺失都會(huì)破壞其穩(wěn)定的空間結(jié)構(gòu)［20］.胞外的幾丁質(zhì)、幾丁質(zhì)寡聚體和殼聚糖與LysM結(jié)構(gòu)域結(jié)合，導(dǎo)致AtCERK1同源二聚化，進(jìn)而激活A(yù)tCERK1胞內(nèi)近膜和激酶結(jié)構(gòu)域的多個(gè)氨基酸快速磷酸化［20-21］.保守的跨膜結(jié)構(gòu)域中C端近膜區(qū)（部分序列）也調(diào)節(jié)AtCERK1激酶活性，參與幾丁質(zhì)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)［22］.AtCERK1對(duì)幾丁質(zhì)的識(shí)別具有特異性，cerk1突變體中，幾丁質(zhì)觸發(fā)的ROS爆發(fā)、MAPK級(jí)聯(lián)反應(yīng)，以及幾丁質(zhì)響應(yīng)基因的表達(dá)等幾乎都喪失了［18，23］.然而，AtCERK1對(duì)幾丁質(zhì)的親和力相對(duì)較低.將AtCERK1幾丁質(zhì)結(jié)合位點(diǎn)A138突變?yōu)镠并未阻斷AtCERK1自磷酸化，這表明雖然AtCERK1是響應(yīng)幾丁質(zhì)必需的，但是還有其他蛋白參與幾丁質(zhì)結(jié)合，并與AtCERK1互作共同激活下游信號(hào)通路［22］.擬南芥中的AtLYK4和AtLYK5可能具有這樣的作用［24-25］.AtLYK4可以識(shí)別幾丁質(zhì)，作為AtCERK1的共受體增加其幾丁質(zhì)親和性和激酶活性［24］.在lyk4突變體中，受幾丁質(zhì)誘導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)錄水平下降，胞內(nèi)鈣離子（Ca2+）濃度增加受抑制，但其表型不如cerk1突變體明顯［26］.此外，AtLYK5也是幾丁質(zhì)的主要受體，與AtCERK1形成幾丁質(zhì)誘導(dǎo)復(fù)合物，是幾丁質(zhì)誘導(dǎo)AtCERK1形成同源二聚體和磷酸化所必需的.AtLYK5與幾丁質(zhì)的親和力比AtCERK1高很多，lyk5-2突變體對(duì)幾丁質(zhì)反應(yīng)顯著降低，缺乏ROS爆發(fā)表型.將點(diǎn)突的AtLYK5（AtLYK5S206P和AtLYK5Y128G）回補(bǔ)到lyk5-2突變體中，無(wú)法恢復(fù)其表型；LYK5S206P不與幾丁質(zhì)結(jié)合，而AtLYK5Y128G與幾丁質(zhì)結(jié)合能力下降，這表明S206和Y128是AtLYK5調(diào)控幾丁質(zhì)結(jié)合的關(guān)鍵位點(diǎn)［25］.AtLYK4與AtLYK5的胞外域可以相互作用形成同源二聚體.幾丁質(zhì)誘導(dǎo)AtCERK1與AtLYK4，AtLYK5形成復(fù)合物［27］.正常狀態(tài)下，AtCERK1，AtLYK4和AtLYK5均定位于質(zhì)膜［28］；幾丁質(zhì)觸發(fā)后，磷酸化的AtCERK1仍停留在質(zhì)膜上，而AtLYK5受到誘導(dǎo)而內(nèi)化.然而，在cerk1或AtCERK1蛋白活性降低的突變植株中，沒(méi)有發(fā)現(xiàn)幾丁質(zhì)誘導(dǎo)的AtLYK5內(nèi)吞作用［28］.

擬南芥免疫應(yīng)答過(guò)程中，AtCERK1介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路可能包括類受體胞質(zhì)激酶AtBIK1（botrytisinduced kinase 1），AtBAK1（BRI1-associated receptor kinase 1），AtPBL1（BIK1-like protein kinase），AtPBL27和RLCKⅦ-4等組分.AtCERK1與AtBIK1互作并將其磷酸化［29］，AtBIK1能與AtBAK1互作［30］.AtBIK1和AtPBL1對(duì)幾丁質(zhì)誘導(dǎo)的胼胝質(zhì)積累起作用，AtBIK1與過(guò)氧化氫（H2O2）積累也相關(guān)［29］.相比于AtBIK1，AtCERK1可以優(yōu)先磷酸化AtPBL27，AtCERK1的磷酸化位點(diǎn)S493突變不影響其自磷酸化活性，卻降低AtPBL27的轉(zhuǎn)磷酸化水平，從而影響幾丁質(zhì)信號(hào)感知與轉(zhuǎn)導(dǎo)的起始階段［31］.擬南芥AtPBL27是水稻OsRLCK185的同源蛋白，可以磷酸化AtMAPKKK5，激活A(yù)tMKK2，AtMKK4和AtMKK5的磷酸化［32］，進(jìn)而調(diào)節(jié)AtMAPK3/6［33］，調(diào)控相關(guān)防御基因（AtNit4和AtWRKY75）表達(dá)［33］.AtPBL27和AtMAPKKK5也參與幾丁質(zhì)誘導(dǎo)的胼胝質(zhì)沉積［32-33］.AtCERK1也可以磷酸化RLCKⅦ-4，進(jìn)而激活MAPK級(jí)聯(lián)反應(yīng)，啟動(dòng)免疫應(yīng)答［34］，如圖1（b）所示.此外，受細(xì)菌病原體誘導(dǎo)后，AtBAK1可以與AtCERK1互作，磷酸化AtCERK1的近膜區(qū)，增強(qiáng)植株真菌抗性［35］.

3 擬南芥LysM蛋白免疫應(yīng)答中的負(fù)調(diào)控機(jī)制

LysM蛋白響應(yīng)幾丁質(zhì)的免疫過(guò)程也受到負(fù)調(diào)節(jié)因子的調(diào)控，從而保護(hù)植物生長(zhǎng)免受幾丁質(zhì)誘導(dǎo)的持續(xù)性的免疫損傷［36］.目前，對(duì)此方面的認(rèn)識(shí)僅僅局限于擬南芥AtCERK1相關(guān)的負(fù)調(diào)控研究.

AtCERK1調(diào)節(jié)的免疫過(guò)程可能受到蛋白質(zhì)可逆磷酸化的調(diào)控.在感知幾丁質(zhì)信號(hào)后，AtCERK1會(huì)募集其互作蛋白PP2C絲/蘇氨酸磷酸酶（CIPP1），使AtCERK1的Tyr428去磷酸化，AtCIPP1會(huì)與去磷酸化的AtCERK1解離，進(jìn)而AtCERK1的Tyr428再發(fā)生自磷酸化并恢復(fù)待命（standby）狀態(tài)［37］.此外，AtCERK1與富含亮氨酸重復(fù)的類受體激酶（LRR-RLK）LIK1互作并將其直接磷酸化，負(fù)調(diào)節(jié)幾丁質(zhì)觸發(fā)的免疫過(guò)程［38］.幾丁質(zhì)處理后，lik1突變體植株會(huì)產(chǎn)生更多的ROS，AtMAPK3和AtMAPK6磷酸化水平顯著增加，這表明AtCERK1磷酸化AtLIK1會(huì)抑制下游的信號(hào)通路，但對(duì)其分子調(diào)控機(jī)制并不清楚［38］，如圖1（c）所示.

依賴或不依賴泛素連接酶U-box蛋白介導(dǎo)的蛋白質(zhì)降解途徑都可能對(duì)AtCERK1活性具有負(fù)調(diào)控作用.AtCERK1磷酸化的胞內(nèi)激酶結(jié)構(gòu)域與泛素連接酶U-box蛋白12或13（PUB12/13）的ARM結(jié)構(gòu)域相互作用［36］，這表明幾丁質(zhì)激活A(yù)tCERK1的自磷酸化是其與AtPUB12/13相互作用的關(guān)鍵.pub12，pub13突變體幾丁質(zhì)誘導(dǎo)的ROS爆發(fā)、MAPK激活和胼胝質(zhì)沉積等一系列免疫反應(yīng)增強(qiáng)［36］.這暗示著AtPUB12和AtPUB13參與了幾丁質(zhì)受體復(fù)合物的負(fù)調(diào)控作用，這種負(fù)調(diào)控是否是通過(guò)泛素化AtCERK1介導(dǎo)其降解有待進(jìn)一步研究.有意思的是，AtCERK1也可以與AtPUB4相互作用.從pub4突變體表型上看，PUB4正調(diào)節(jié)幾丁質(zhì)誘導(dǎo)的ROS產(chǎn)生和胼胝質(zhì)沉積，負(fù)調(diào)節(jié)MAPK激活與防御基因表達(dá)，這種看起來(lái)相互矛盾的表型可能是pub4突變引用的水楊酸（SA）合成紊亂有關(guān)，但具體機(jī)制尚不清楚［39］.而AtCERK1的磷酸化位點(diǎn)S493突變會(huì)降低AtPUB4的轉(zhuǎn)磷酸化水平［31］.此外，AtCERK1可以與RLCKⅦ-4家族中的組成型差異生長(zhǎng)蛋白1（CDG1）互作并將其磷酸化.AtCDG1獨(dú)立于PUB12/13途徑來(lái)促進(jìn)AtCERK1降解，進(jìn)而負(fù)調(diào)節(jié)免疫反應(yīng).但該過(guò)程需要具有激酶活性的AtMEKK1參與，失活的AtMEKK1可以抑制AtCDG1介導(dǎo)的AtCERK1降解和免疫缺陷［40］，如圖1（c）所示.

圖1 植物L(fēng)ysM蛋白參與幾丁質(zhì)激活免疫反應(yīng)通路.

4 LysM蛋白在其他植物免疫應(yīng)答中的作用

含LysM的蛋白在不同植物中也參與多種生物學(xué)功能.如在感知幾丁質(zhì)和信號(hào)傳導(dǎo)過(guò)程中，雖然AtLYK2有助于誘導(dǎo)胼胝質(zhì)沉積，但是其作用并不明顯.但AtLYK2會(huì)增強(qiáng)由鞭毛蛋白誘導(dǎo)的灰霉病菌和丁香假單胞菌的抗性，以及在真菌感染過(guò)程中激活防御基因的表達(dá)［41］.

棉花GhLYK1和GhLYK2具有結(jié)合幾丁質(zhì)的能力，受大麗輪枝菌感染后被誘導(dǎo)，對(duì)棉花抗黃萎病有一定的作用［42］.棉花GhLYP1，GhLYK7和細(xì)胞外LysM蛋白3（GhLysMe3）是識(shí)別幾丁質(zhì)信號(hào)的受體，可激活下游SA、茉莉酸（JA）和ROS信號(hào)通路，以及相關(guān)防御基因的表達(dá)，增強(qiáng)對(duì)黃萎病的抗性［43］.細(xì)胞壁相關(guān)激酶GhWAK7A直接與GhCERK1和GhLYK5相互作用［44］.被真菌病原菌感染后，GhLYK5識(shí)別幾丁質(zhì)，刺激GhLYK5與GhCERK1結(jié)合.GhWAK7A對(duì)GhLYK5的磷酸化或起支架（scaffolding）作用，可能促進(jìn)GhLYK5與GhCERK1復(fù)合物的形成，從而啟動(dòng)下游ROS產(chǎn)生、MAPK激活和防御相關(guān)基因表達(dá)，提高黃萎病和枯萎病抗性［44］.

在桑樹(shù)中鑒定了MmLYP1（CEBiP同源物）和MmLYK2（CERK1同源物）.用幾丁質(zhì)處理后，MmLYP1的表達(dá)顯著上升，但MmLYK2沒(méi)有明顯變化.此外，MmLYP1對(duì)不溶性幾丁質(zhì)聚合物具有親和力，而MmLYK2的親和能力較低.這表明雖然MmLYP1缺乏胞內(nèi)激酶結(jié)構(gòu)域，但MmLYP1通過(guò)與MmLYK2相互作用參與幾丁質(zhì)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)［45］.

在番茄中，SlLYK1參與幾丁質(zhì)誘導(dǎo)的免疫反應(yīng)，SlLYK10和SlLYK12參與調(diào)節(jié)叢枝菌根（AM）共生，而異源過(guò)表達(dá)SlLYK1和SlLYK13將誘導(dǎo)細(xì)胞死亡［46-47］.

5 結(jié)論與展望

LysM結(jié)構(gòu)域作為一類古老并廣泛存在的結(jié)構(gòu)域，在植物免疫應(yīng)答過(guò)程中起作用.LysM蛋白介導(dǎo)的植物免疫途徑的調(diào)控機(jī)制已經(jīng)取得了顯著進(jìn)展，但LysM蛋白對(duì)不同聚糖結(jié)構(gòu)的特異性識(shí)別機(jī)制仍不清楚，其激酶可逆磷酸化與泛素化調(diào)節(jié)的蛋白質(zhì)周轉(zhuǎn)機(jī)制也有待研究.進(jìn)一步挖掘免疫應(yīng)答過(guò)程中LysM蛋白調(diào)控的下游因子并明確關(guān)鍵調(diào)控位點(diǎn)，解析LysM家族成員之間及其與其他膜定位類受體激酶在質(zhì)膜上的招募與互作分子機(jī)制，明確LysM與其互作蛋白形成的分子模塊對(duì)下游靶蛋白的調(diào)控作用，將為深入揭示LysM蛋白對(duì)植物免疫應(yīng)答的分子調(diào)控機(jī)理提供重要信息.