蚯蚓體內(nèi)乳酸菌的分離鑒定及其生物學特性

劉依山，郭藝偉，包永占，王玉田，潘興亮，鄭瑞峰

(1. 河北農(nóng)業(yè)大學動物醫(yī)學院，河北 保定 071000 ； 2. 北京市畜牧總站，北京 朝陽 100107)

畜禽養(yǎng)殖中獸用抗菌藥的不規(guī)范使用，嚴重威脅畜禽產(chǎn)品質(zhì)量安全和公共衛(wèi)生安全，給人類和動物健康帶來眾多隱患[1]。隨著農(nóng)業(yè)農(nóng)村部第194號公告的頒布和實施，解決動物腸道健康問題尤為急迫，尋找綠色、安全、高效的抗菌藥替代品成了國內(nèi)外研究熱點。乳酸菌是公認安全的食品級微生物[2]，是“替抗”方案中應用最多、最重要的飼料添加劑之一。乳酸菌既可以發(fā)酵飼料使其具有獨特的酸香味，改善適口性[3]；又可以促進動物生長、調(diào)節(jié)腸道、增強免疫和抗氧化等[4]。蚯蚓腸道菌群結構及功能具有多樣性[5]，且因其進食腐朽食物及生活環(huán)境習性特點，逐漸被應用于養(yǎng)殖行業(yè)發(fā)揮作用[6]。蚯蚓在惡劣的環(huán)境中生存，會產(chǎn)生較強的抵抗力并分泌一些抗菌物質(zhì)[7]。因此，從蚯蚓體內(nèi)分離的乳酸菌，可能會有一定的創(chuàng)新意義。本試驗圍繞減抗替抗新技術的開發(fā)，從蚯蚓中分離到3株乳酸菌，并開展了一系列生化特征及安全性評價，以期為其作為替抗飼料添加劑的應用提供數(shù)據(jù)支持。

1 材料與方法

1.1 試驗材料 蚯蚓，來源于北京市奧林匹克森林公園；無特定病原體(Specific pathogen free，SPF)級昆明(Kunming，KM)小鼠，購自斯貝福(北京)生物技術有限公司；抑菌試驗用指示菌：大腸埃希菌(ATCC25922)、金黃色葡萄球菌(ATCC6538)，均由北京市畜牧總站微生物實驗室提供；藥敏試紙片、MRS瓊脂培養(yǎng)基和MRS肉湯培養(yǎng)基，均購自美國賽默飛世爾科技(中國)有限公司；16S rRNA引物，購自生工生物工程(上海)股份有限公司。

1.2 主要儀器 生化培養(yǎng)箱和恒溫振蕩器，均購自上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設備廠；酶標儀，購自賽默飛世爾(上海)儀器有限公司；凝膠成像系統(tǒng)，購自普若森生物科技(上海)有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 菌株分離 將蚯蚓置于75%酒精中做體表消毒，取出后沿體表剪開，用接種環(huán)蘸取體內(nèi)內(nèi)容物接種于MRS瓊脂培養(yǎng)基，37 ℃厭氧培養(yǎng)48 h。

1.3.2 菌種鑒定 (1)菌落形態(tài)特征鑒定：對乳酸菌特征性菌落經(jīng)多次純化培養(yǎng)，進行革蘭染色，鏡檢；制備掃描電鏡樣品[7]，使用掃描電鏡觀察菌株形態(tài)特征。(2)生化鑒定：對候選菌株分別進行過氧化氫酶試驗、明膠液化試驗、硫化氫試驗、各種糖發(fā)酵試驗等，37 ℃培養(yǎng)24 h，觀察結果。(3)16S rRNA PCR擴增鑒定：進行菌落PCR擴增[8]，擴增產(chǎn)物經(jīng)凝膠電泳，陽性產(chǎn)物進行16S rRNA測序，將測序結果在NCBI核酸數(shù)據(jù)庫上進行序列同源性比對，利用MEGA 7.0構建系統(tǒng)進化樹。

1.3.3 菌株pH曲線和生長曲線的繪制 分離獲得的乳酸菌菌種以1%的接種比例分別接種到MRS肉湯培養(yǎng)基中，37 ℃搖床培養(yǎng)24 h，每隔2 h取樣，測定培養(yǎng)基pH；利用酶標儀測定乳酸菌菌液在600 nm波長處的OD值，以培養(yǎng)時間為橫坐標，pH和OD600值為縱坐標，繪制乳酸菌菌株的pH曲線和生長曲線。

1.3.4 菌株體外抑菌試驗 采用牛津杯法[9]。將抑菌試驗用指示菌菌液涂布在MRS營養(yǎng)瓊脂平板上，在牛津杯中分別加入200 μL新鮮的乳酸菌菌液，每種指示菌設置3個重復，4 ℃放置20 h后，37 ℃培養(yǎng)12 h，測量抑菌圈直徑，算取平均值。

1.3.5 藥敏試驗 將乳酸菌菌液涂布在MRS瓊脂培養(yǎng)基上，合理放置藥敏片(直徑為6 mm)，每種藥敏片3個重復，37 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h，觀察抑菌結果，算取抑菌圈平均值，根據(jù)美國臨床與實驗室標準協(xié)會(Clinical and Laboratory Standards Institute,CLSI)制定藥敏試驗判斷標準[10]評定藥物敏感性。

1.3.6 耐酸試驗 用1 mol/L鹽酸溶液或1 mol/L氫氧化鈉溶液將MRS肉湯培養(yǎng)基pH分別調(diào)整為6.0、5.0、4.0、3.0、2.0，以pH 6.0作為對照，將分離獲得的乳酸菌菌種以5%的接種比例分別接種到滅菌后的液體培養(yǎng)基中，37 ℃搖床中培養(yǎng)24 h，測取OD600值，做3個重復，按公式(1)計算存活率。

存活率(%)=Nχ/N0×100%

(1)

式中Nχ為在不同酸度液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)24 h后的乳酸菌菌液的吸光度，N0為在pH 6.0的液體培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h后的乳酸菌菌液的吸光度。

1.3.7 耐鹽試驗 對膽汁的耐受程度是評定乳酸菌的重要特征之一，乳酸菌對膽鹽的耐受程度決定了它在腸道中的存活力。將分離獲得的乳酸菌菌種以5%的接種比例分別接種于牛膽鹽濃度為0.15%、0.30%和0.60%的液體MRS培養(yǎng)基中，混勻，以不加牛膽鹽作為對照，37 ℃搖床培養(yǎng)24 h后，測取OD600值，做3個重復，按公式(1)計算存活率。

1.3.8 動物安全性試驗 將體重相當?shù)腟PF級KM小鼠隨機分為對照組和試驗組，對照組小鼠正常飲用自來水，試驗組小鼠分別飲用植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum)、乳酸片球菌(Pediococcusacidilactici)、腸膜明串珠菌(Leuconostocmesenteroides)菌液，每組5只，常規(guī)飼養(yǎng)7 d，觀察并記錄各組小鼠的精神、行為、食欲、排泄情況以及有無死亡現(xiàn)象。

2 結果

2.1 菌落形態(tài)特征鑒定 經(jīng)培養(yǎng)，蚯蚓體內(nèi)分離出3種不同形態(tài)的菌落，分別命名為R1、R2、R3，結果見表1和圖1。

表1 分離菌株形態(tài)特征及革蘭染色Table 1 Morphological characteristics and Gram stainings of isolated strains

圖1 R1、R2、R3菌株形態(tài)特征Fig.1 Morphological characteristics of strains R1,R2 and R3A、D、G：培養(yǎng)基上的R1、R2、R3菌落形態(tài); B、E、H：R1、R2、R3革蘭染色鏡檢結果(1 000×); C、F、I：R1、R2、R3掃描電鏡鏡檢結果(20 k×)A,D,G:R1,R2,R3 colony morphology on the medium; B,E,H:Results of R1,R2,R3 Gram staining microscopic examination (1 000×); C,F,I:Results scanning electron microscope of R1,R2,R3 (20 k×)

2.2 生化鑒定 結果如表2所示，參考《乳酸菌細菌的分類鑒定與實驗方法》[11]，初步判斷R1為乳桿菌屬，R2為乳球菌屬，R3為明串球菌屬。

表2 分離菌株的生化鑒定結果Table 2 Biochemical identification results of isolated strains

2.3 16S rRNA PCR擴增鑒定 凝膠電泳結果見圖2，PCR擴增獲得的基因片段大小均約為1 500 bp。3株分離乳酸菌的 16S rRNA基因序列比對分析結果顯示，R1與植物乳桿菌，R2與乳酸片球菌，R3與腸膜明串珠菌的16S rRNA基因序列的相似性均達到99%以上。系統(tǒng)發(fā)育樹結果如圖3所示，R1與LactiplantibacillusplantarumATCC 14917T和LactobacillusargentoratensisDSM 16365T的同源性較高，R2與PediococcusacidilacticiDSM 20284T的同源性極高，R3與Leuconostocmesenteroidessubsp.jonggajibkimchiiDRC1506T同為明串球菌屬，親緣性高。

圖2 分離菌株16S rRNA的PCR擴增Fig.2 PCR amplification of 16S rRNA of isolated strainsM:DNA Marker (DL2 000); 1：R1； 2：R2； 3：R3

圖3 分離菌株基于16S rRNA基因序列的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.3 Phylogenetic tree of isolated strains based on 16S rRNA gene sequences▲：本試驗分離菌株▲：Isolates obtained in this study

2.4 菌株pH曲線和生長曲線的繪制 R1、R2、R3菌株的pH曲線和生長曲線如圖4～6所示，R1菌株在接種8 h之后生長迅速，14 h后生長速度趨于平緩，其進入對數(shù)期時，液體培養(yǎng)基的pH下降速度較快，22 h時OD600值達最高值，此時pH降低至3.6左右，表明R1菌株有較強的產(chǎn)酸能力；R2菌株在接種后較早進入對數(shù)期，培養(yǎng)基pH也急劇下降，14 h后進入穩(wěn)定期，pH 3.7左右，表明R2菌株有良好的產(chǎn)酸能力；R3菌株在接種的8～14 h，生長曲線呈快速上升趨勢，此時細菌生長最為迅速，為對數(shù)期，到20 h進入穩(wěn)定期，pH可低至3.5，表明R3菌株產(chǎn)酸能力較強。

圖4 R1菌株pH曲線和生長曲線Fig.4 pH and growth curve of strain R1

圖5 R2菌株pH曲線和生長曲線Fig.5 pH and growth curve of strain R2

圖6 R3菌株pH曲線和生長曲線Fig.6 pH and growth curve of strain R3

2.5 菌株體外抑菌試驗 結果如表3和圖7所示，R1、R2、R3對大腸埃希菌的抑菌效果非常明顯，抑菌圈直徑可達28 mm，相對R1和R2，R3抑制金黃色葡萄球菌的效果較強。

表3 分離菌株的抑菌試驗結果Table 3 Bacteriostatic test results of isolated strains (mm,n=3)

2.6 藥敏試驗 結果如表4所示，R1菌株對氨芐西林和羥氨芐青霉素最為敏感，抑菌圈直徑達到38 mm；R2菌株對青霉素G的敏感性最強，抑菌圈直徑為30 mm；R3菌株對氨芐西林的敏感性最強，抑菌圈可達35 mm；3種乳酸菌菌株都對阿莫西林和甲硝唑不敏感，抑菌圈直徑為0 mm。

圖7 抑菌試驗Fig.7 Bacteriostatic test A：抑制大腸埃希菌結果； B：抑制金黃色葡萄球菌結果A: Antibacterial results of Escherichia coli; B: Antibacterial results of Staphylococcus aureus

表4 分離菌株藥敏試驗結果Table 4 Drug sensitivity test results of isolated strains

2.7 耐酸試驗 結果如表5所示，在pH逐漸降低的培養(yǎng)基中，R2菌株存活率下降緩慢，酸度對其生長影響較小，而R1和R3菌株，酸度對其生長影響較大，但仍有良好的抗逆性。

表5 分離菌株耐酸性試驗結果Table 5 Acid resistance test results of isolated strains (%，n=3)

2.8 耐鹽試驗 結果如表6所示，膽鹽對R1、R2、R3菌株的生長影響較小；與R1和R3菌株相比，R2菌株耐膽鹽性較強。

表6 分離菌株耐鹽試驗結果Table 6 Bile salts resistance test results of isolated strains (%，n=3)

2.9 動物安全性試驗 分別飲水飼喂3株乳酸菌菌液14 d后，試驗組KM小鼠均未出現(xiàn)死亡或患病情況，精神、采食量和飲水量均正常，糞便排泄亦正常，被毛生長良好，皮膚黏膜粉嫩。

3 討論

本試驗從蚯蚓腸道中成功分離到3株菌，革蘭染色均為陽性，經(jīng)生化鑒定和16S rRNA測序比對，R1菌株為植物乳桿菌，R2菌株為乳酸片球菌，R3菌株為腸膜明串珠菌。產(chǎn)酸性能是評價乳酸菌的重要標準，它代表著抑菌和發(fā)酵性能。在張飛[12]對豬源植物乳桿菌的鑒定中，菌株12 h后進入衰亡期，30 h時pH達3.8，對比本試驗分離的3株乳酸菌，在培養(yǎng)20 h左右濃度較高，穩(wěn)定期維持時間較久，20 h時pH即可達3.8左右。乳酸菌若要在腸道內(nèi)存活，就要適應腸道內(nèi)酸性、高膽鹽的環(huán)境。與李宏偉等[13]分離的雞源植物乳桿菌相比，本試驗R1植物乳桿菌的產(chǎn)酸性和耐酸性較為出色。此外，3種乳酸菌菌株在不同酸度和膽鹽濃度生長環(huán)境中表現(xiàn)出良好的抗逆性，具備優(yōu)勢乳酸菌的條件。乳酸菌對大腸埃希菌和金黃色葡萄球菌有明顯的拮抗作用[14]，相比劉雪連等[8]在蚯蚓糞中分離得到的乳酸菌，本試驗中R1、R2、R3對大腸埃希菌和金黃色葡萄球菌的抑制效果均較為明顯。R3的抑菌效果明顯，也證實了腸膜明串珠菌具有較強的抑菌特性[15]。在畜禽養(yǎng)殖中，對于常見菌引起的疾病如腹瀉、腸炎、便秘等，乳酸菌能夠起到抑菌消炎、增強免疫的作用[16]。對比章蔚[17]從黑鯛腸道分離的明串珠菌屬乳酸菌，本試驗分離的R3菌株的耐藥性較強。R1、R2、R3對環(huán)丙沙星、慶大霉素、阿莫西林、甲硝唑等抗菌藥物不敏感，在機體治療用藥過程中，可以減少抗菌藥對菌株干擾。本試驗分離的3株乳酸菌表現(xiàn)多重耐藥，這可能是由于抗菌藥濫用導致基因變化。近些年國內(nèi)外逐漸重視益生菌的安全性問題，特別是一些菌株具有產(chǎn)毒能力和攜帶可轉(zhuǎn)移的耐藥基因，對公共衛(wèi)生安全和生物安全構成了潛在的威脅。本試驗分離的3株乳酸菌是否攜帶可轉(zhuǎn)移耐藥基因以及多重耐藥產(chǎn)生機制還需繼續(xù)探索。李禤等[14]從不同基質(zhì)中分離出的8株植物乳桿菌對β-內(nèi)酰胺類藥物敏感，本試驗分離的3株菌也對β-內(nèi)酰胺類藥物敏感，因為大多數(shù)的乳酸菌不能產(chǎn)生耐β-內(nèi)酰胺酶[18]，且β-內(nèi)酰胺類藥物的作用機制主要是破壞細菌細胞壁[19]，因此乳酸菌對β-內(nèi)酰胺類藥物敏感。伍元植等[20]分離到的乳酸片球菌對頭孢類抗菌藥物具有一定的耐藥性，而本試驗的R2乳酸片球菌對β-內(nèi)酰胺類藥物敏感性較弱，尤其是對阿莫西林和頭孢羥氨芐。推測可能原因：一方面與細菌本身的生物學特點有關；另一方面與蚯蚓受大量抗菌藥積累的環(huán)境影響，腸道中該菌發(fā)生耐藥基因轉(zhuǎn)變，以及β-內(nèi)酰胺類不同藥物之間結構特點不同有關,具體原因有待于進一步研究。

飼料中添加乳酸菌能夠增強動物機體免疫功能和抗氧化功能[21]，減少養(yǎng)殖過程中疾病發(fā)生，促進動物生長。本試驗分離出的植物乳桿菌、乳酸片球菌是《飼料添加劑品種目錄》(2013版)[22]中許可添加的菌種，根據(jù)植物乳桿菌的免疫增強功能，乳酸片球菌的產(chǎn)酸性能，可嘗試將本試驗篩選獲得的優(yōu)勢乳酸菌作為益生菌制劑菌種，為養(yǎng)殖行業(yè)提供參考。