GRK6在惡性腫瘤中的研究進展

梁心怡，杜潤蕾

（武漢大學 生命科學學院，湖北武漢 430072）

G蛋白偶聯(lián)受體激酶家族（G protein-coupled receptor kinase，GRKs）由7個序列結(jié)構(gòu)同源并且功能相似的絲氨酸/蘇氨酸激酶組成。家族成員最初由于具有能夠特異性識別和磷酸化與激動劑結(jié)合后活化的G蛋白偶聯(lián)受體（G Protein-Coupled Receptor，GPCR）并使其脫敏的作用而被鑒別和命名[1]，是負調(diào)節(jié)GPCR活性的關(guān)鍵激酶。GPCR是細胞中最多且影響最為廣泛的跨膜信號蛋白，從光和氣味等感覺刺激，到神經(jīng)遞質(zhì)、趨化因子、激素、脂質(zhì)、多肽和離子等各種細胞外的刺激都能夠由不同種類的GPCR接收再傳遞到細胞內(nèi)，通過與下游不同的G蛋白發(fā)生作用，調(diào)控細胞內(nèi)一系列生理病理反應的發(fā)生[2]。GPCR的失調(diào)與多種疾病的發(fā)生，如高血壓、過敏、神經(jīng)系統(tǒng)疾病甚至癌癥等都有著密切的聯(lián)系。目前在全世界所有上市藥物中，各類GPCR的靶向藥物約占35%[3]，因此作為唯一能夠負調(diào)控GPCR發(fā)生同源脫敏作用的激酶，GRKs在成為新的藥物作用靶點上具有極大的潛力和研究前景。近年來，多項研究發(fā)現(xiàn)GRK家族中的成員GRK6在惡性腫瘤中的表達與正常組織有明顯的差異，并且與腫瘤的生長、增殖和遷移侵襲能力有著密切的聯(lián)系。本文將圍繞GRK6對體內(nèi)生理病理過程的調(diào)控作用及其在各類型腫瘤中的相關(guān)研究進行綜述，為未來進一步揭示GRK6與惡性腫瘤發(fā)生發(fā)展之間的關(guān)系提供理論基礎。

1 GRK6的結(jié)構(gòu)特征

根據(jù)基因結(jié)構(gòu)和序列的相似性，GRK家族中可再細分成GRK1亞家族（GRK1、GRK7）、GRK2亞家族（GRK2、GRK3）和GRK4亞家族（GRK4、GRK5、GRK6）3個亞家族。GRK6最初于1993年從人類心臟cDNA文庫中分離并被鑒定為G蛋白偶聯(lián)受體激酶的新亞型[1]。GRK6屬于GRK4亞家族，它在人體各組織中都普遍表達，其中淋巴組織和骨髓中的表達量最高。GRK6基因在人類5號染色體上，由16個外顯子組成，在各物種中都高度保守，通過對羧基末端16號外顯子的可變剪切共產(chǎn)生了3種剪接體，分別為GRK6A、GRK6B和GRK6C，并且在人、小鼠和大鼠中都普遍存在[4]。GRK6蛋白具有多個結(jié)構(gòu)域（見圖1），其中有3個結(jié)構(gòu)域[由約20個高度保守的氨基酸殘基組成的N端結(jié)構(gòu)域，G蛋白信號同源域（Regulator of G protein signaling homology domain，RH）和處于蛋白中心位置的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶結(jié)構(gòu)域（Kinase Domain，KD）]在GRK6的不同轉(zhuǎn)錄本中都普遍存在，而且為GRK家族蛋白共有[5]。GRK6 N末端結(jié)構(gòu)域能通過與細胞膜中的磷脂酰肌醇4,5-二磷酸（PIP2）相互作用，促進蛋白靶向定位到細胞膜上并發(fā)生自磷酸化增強自身激酶活性[6]。GRK6的活性構(gòu)象相對于自由構(gòu)象較為封閉，其N端20個高度保守的氨基酸殘基會呈有序排列并形成一個α螺旋結(jié)構(gòu)，與激酶結(jié)構(gòu)域的C端和小葉區(qū)域發(fā)生相互作用形成受體對接位點[7]，因此這一構(gòu)象對于GRK6識別和磷酸化活化的GPCR功能的實現(xiàn)至關(guān)重要。GRK6激酶屬于AGC激酶家族，其激酶結(jié)構(gòu)域具有AGC激酶家族的絲氨酸/蘇氨蛋白激酶的結(jié)構(gòu)和功能特征，而RH結(jié)構(gòu)域則充當了激酶小葉的支架，使其能夠維持磷酸化活化GPCR的構(gòu)象[5]。此外，GRK6的C端含有一段棕櫚酰化位點（C561，C562，C565），也與膜定位相關(guān)，基因轉(zhuǎn)錄翻譯后的棕櫚?；揎椖軌虼龠M蛋白與膜結(jié)合，而去棕櫚化修飾后的GRK6則更傾向于定位在細胞質(zhì)和細胞核中[4-6]。

圖1 GRK6結(jié)構(gòu)域示意圖[4,7]

2 GRK6的調(diào)控作用

GRK6能特異性地與多種GPCR或非GPCR蛋白發(fā)生相互作用，參與調(diào)控體內(nèi)重要的細胞信號通路傳導與生理過程，并且與一些疾病的發(fā)生有著密切的聯(lián)系，目前的研究較多集中于心腦血管、免疫系統(tǒng)以及神經(jīng)系統(tǒng)疾病中。GRK6能夠通過磷酸化介導人和小鼠血小板表面的多種GPCR產(chǎn)生脫敏作用，包括凝血酶受體PAR1、PAR4以及嘌呤能受體P2Y1、P2Y12，阻斷了對凝血酶和ADP刺激的響應，負調(diào)控血小板的活化聚集，從而抑制了止血作用和血栓的形成，因此GRK6對于心臟病、中風等血栓性心腦血管疾病而言是一個潛在的治療靶點[8-10]。

研究發(fā)現(xiàn)，在免疫系統(tǒng)中，GRK6是T、B淋巴細胞中C-X-C趨化因子受體4（C-X-C motif chemokine receptor 4，CXCR4）活性的重要調(diào)節(jié)因子，磷酸化CXCR4能促進對β-arrestin的募集，從而介導CXCR4的泛素化降解，但它的缺失卻使CXCR4的配體基質(zhì)細胞衍生因子-1（Stromal cell-derived factor-1，SDF-1/CXCL12）刺激所產(chǎn)生的淋巴細胞趨化作用受到了抑制，雖然具體的原因及作用機制尚不清楚，但是GRK6正調(diào)控淋巴細胞趨化作用的功能喪失可能是導致一些炎癥相關(guān)疾病如類風濕性關(guān)節(jié)炎發(fā)生的關(guān)鍵原因[11]。在巨噬細胞中，GRK6能在磷酸化G蛋白偶聯(lián)受體激酶相互作用蛋白1（G proteincoupled receptor kinase interactor，GIT1）后激活Ras相關(guān)的C3肉毒素底物1（Ras-related C3 botulinum toxin substrate 1，Rac1），促進巨噬細胞對凋亡細胞的吞噬清除作用，而GRK6的缺失會導致凋亡細胞的累積造成小鼠自身免疫病的發(fā)生[12]。此外，GRK6還能磷酸化IκBα，促進TNF-α誘導的NF-κB信號通路激活，增強炎癥反應的發(fā)生[13]。

在神經(jīng)系統(tǒng)中，GRK6能降低背根神經(jīng)節(jié)中CXCR2的表達，對于減輕CXCR2信號通路介導的神經(jīng)病理性疼痛的發(fā)生有著重要的作用[14]。同時，有研究發(fā)現(xiàn)GRK6能介導突觸后D2樣多巴胺受體的脫敏，抑制多巴胺受體的信號轉(zhuǎn)導，表明GRK6具有調(diào)控多巴胺能反應的作用，有助于減輕左旋多巴治療帕金森病時產(chǎn)生的副作用[15]。此外，GRK6還被報道能夠通過磷酸化α-突觸核蛋白促進帕金森病的發(fā)生，具有成為帕金森病治療新靶點的潛力[16]。

3 GRK6在惡性腫瘤中的作用

3.1 GRK6與呼吸系統(tǒng)相關(guān)腫瘤

YAO等[17]研究發(fā)現(xiàn)，與正常肺組織相比，肺腺癌（Lung Adenocarcinoma，LADC）患者的腫瘤組織中GRK6的mRNA和蛋白表達水平都發(fā)生了明顯下降，并且在晚期（Ⅲ～Ⅳ期）和低分化癌組織中表達量最低，表明GRK6的表達下調(diào)對肺腺癌的發(fā)生和發(fā)展有著重要的意義。此外，GRK6還是肺腺癌患者生存情況的一個獨立預后因素，低表達患者的總生存率和生存時間都明顯低于高表達患者[17]。進一步研究發(fā)現(xiàn)，在LADC組織中，GRK6基因的啟動子區(qū)CpG島發(fā)生了高度甲基化，導致與轉(zhuǎn)錄因子CCAAT/增強子結(jié)合蛋白α（CCAAT/Enhancer-Binding Protein-α，C/EBPα）的結(jié)合被抑制，從而造成了GRK6基因的表達下降[18]。GRK6的下調(diào)介導激活了上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（Epithelial-Mesenchymal Transition，EMT）以及基質(zhì)金屬蛋白酶（Matrix Metalloproteinases，MMPs）的表達，增強了肺腺癌的遷移和侵襲能力[18]。其中EMT轉(zhuǎn)化是腫瘤細胞發(fā)生遷移時的標志性事件，而MMPs則參與了細胞再生、程序性死亡、血管生成等生理過程，有助于加速EMT轉(zhuǎn)化，它們都對腫瘤細胞的遷移具有促進作用。在GRK6敲低的肺腺癌細胞中，與EMT轉(zhuǎn)化激活正相關(guān)的間充質(zhì)細胞標志物波形蛋白表達上調(diào)，同時EMT負相關(guān)的上皮細胞標志物E-鈣黏蛋白表達發(fā)生了下調(diào)，而過表達GRK6則會產(chǎn)生相反的效應，并且MMP-2和MMP-7的表達會被抑制，癌細胞的遷移和侵襲能力也明顯下降[18]。在GRK6全身性敲除小鼠異位Lewis肺癌模型及肺癌轉(zhuǎn)移模型中開展的研究發(fā)現(xiàn)，GRK6的缺失上調(diào)了CXCR2表達，導致CXCL8/CXCR2信號通路異常激活，MMP-2和MMP-9的表達量升高，促進了小鼠體內(nèi)腫瘤的血管生成和生長增殖以及肺遷移的發(fā)生[19]。另有研究結(jié)果表明，GRK6的下調(diào)還能通過抑制林島綜合癥相關(guān)抑癌基因（Von Hippel-Lindau Tumor Suppressor，VHL）的表達，增加缺氧誘導因子（Hypoxia-Inducible Factor，HIF）的穩(wěn)定性來激活肺腺癌細胞中的缺氧信號通路，從多方面對肺腺癌的發(fā)生發(fā)展進行調(diào)控[20]。

3.2 GRK6與消化系統(tǒng)相關(guān)腫瘤

免疫組化和免疫印跡實驗分析發(fā)現(xiàn)，GRK6在肝細胞肝癌（Hepatocellular Carcinoma，HCC）組織中的表達量明顯高于癌旁組織，并且在分化程度低或轉(zhuǎn)移能力強的腫瘤組織中表達量更高，說明GRK6可能與HCC的發(fā)生和轉(zhuǎn)移有著密切的聯(lián)系。生存曲線分析結(jié)果顯示，GRK6高表達的患者生存率較低，因此GRK6的表達水平可作為HCC早期診斷以及預后情況分析的參考指標[21]。YIN等[22]研究發(fā)現(xiàn)，GRK6能磷酸化GPCR家族中的表皮生長因子受體亞家族成員分化簇抗原97（Cluster of Differentiation，CD97）發(fā)生脫敏作用，并通過與β-arrestin1結(jié)合使受體內(nèi)化降解。在CD97高表達的肝癌組織中發(fā)現(xiàn)GRK6基因的啟動子區(qū)存在高度甲基化，導致GRK6的表達下調(diào)而減少了CD97的脫敏內(nèi)化。因此，在肝癌細胞中高表達的CD97能被配體CD55持續(xù)性地異常激活，并促進了下游與腫瘤遷移侵襲能力相關(guān)的基質(zhì)金屬蛋白酶MMP-2和MMP-9的表達，同時由于GRK6的下調(diào)也具有促進MMP-2和MMP-9表達的作用，所以在這兩種機制的協(xié)同作用下，HCC的轉(zhuǎn)移和侵襲能力得到了顯著增強。在這兩項研究中發(fā)現(xiàn)的GRK6在肝癌組織中的表達變化雖然存在矛盾，但仍能提示GRK6的高表達或低表達可能會通過不同的分子機制促進腫瘤的發(fā)展，表現(xiàn)出了GRK6調(diào)控的復雜性，因此GRK6在肝癌中的功能還需進行進一步的深入研究。

有研究發(fā)現(xiàn)，在原發(fā)性結(jié)直腸癌患者的組織中，GRK6的表達量發(fā)生了明顯的上調(diào)，其高表達與患者的一些臨床病理指標的惡化如組織學分化、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、靜脈浸潤、浸潤深度、遠處轉(zhuǎn)移以及TNM分期等存在顯著的正相關(guān)性，并且GRK6高表達還會導致結(jié)直腸癌患者的生存率（5年）發(fā)生明顯的下降[23]。研究結(jié)果表明，GRK6參與了結(jié)直腸癌的發(fā)生和發(fā)展，是一個較好的預測患者預后情況的生物標記物，同時也為揭示結(jié)直腸癌的發(fā)病機制提供了新的線索，還可能是一個潛在的治療靶點。

3.3 GRK6與血液系統(tǒng)腫瘤

多發(fā)性骨髓瘤（Multiple Myeloma，MM）是血液系統(tǒng)的第二大常見惡性腫瘤[24]，由骨髓中的單克隆漿細胞發(fā)生癌變惡性增殖所導致，會使機體產(chǎn)生過量的單克隆免疫球蛋白[25]。新型靶向藥物如免疫調(diào)節(jié)藥物、蛋白酶體抑制劑以及單克隆抗體藥物的應用顯著提高了多發(fā)性骨髓瘤的治療效果，延長了患者的生存時間[26]。但由于未識別到有效的激酶靶點，激酶抑制劑在多發(fā)性骨髓瘤的治療領(lǐng)域仍存在空缺。研究發(fā)現(xiàn)，GRK6在多發(fā)性骨髓瘤細胞系及患者組織中呈高表達[27]，抑制GRK6的表達能選擇性地對多種骨髓瘤細胞系產(chǎn)生致死作用，而在其他細胞系中無影響或僅有微弱的影響，說明GRK6對多發(fā)性骨髓瘤細胞的存活發(fā)揮了關(guān)鍵性作用，并且具備成為體內(nèi)耐受的藥物作用有效靶點的潛力[28]。在多發(fā)性骨髓瘤細胞MM1R細胞中敲低GRK6后，凋亡抑制蛋白B細胞淋巴瘤/白血病-2（B-Cell Leukemia/Lymphoma 2，BCL-2）的表達下降而促凋亡蛋白BCL-2相關(guān)X蛋白（BCL2-Associated X protein，BAX）的表達上升，具有促進細胞凋亡的作用，并且集中于晚期凋亡[27]。此外，GRK6的缺失還會導致信號傳導和轉(zhuǎn)錄激活因子 3（Signal Transducer and Activator of Transcription 3，STAT3）磷酸化水平下降，下游促生存蛋白髓樣細胞白血病蛋白-1（Myeloid Cell Leukemia 1，MCL-1）的表達量也降低，表明GRK6還能通過磷酸化激活STAT3信號通路促進多發(fā)性骨髓瘤細胞的存活[27-28]。目前已有針對治療多發(fā)性骨髓瘤而研發(fā)的GRK6的小分子抑制劑，該抑制劑能夠有效抑制GRK6的蛋白表達，并且對骨髓瘤細胞具有顯著的殺傷作用，與其他抗骨髓瘤藥物聯(lián)合使用后還會產(chǎn)生更好的治療效果[29]。

3.4 GRK6與神經(jīng)系統(tǒng)相關(guān)腫瘤

有研究發(fā)現(xiàn)，在人神經(jīng)母細胞瘤細胞系SH-SY5Y中過表達GRK6后，M3毒蕈堿乙酰膽堿受體（M3 muscarinic Acetylcholine Receptor，M3 mAChR）的磷酸化水平發(fā)生了明顯的增強并且導致受體同源脫敏[30]。M3 mAChR是典型的GPCR，在細胞內(nèi)受神經(jīng)遞質(zhì)乙酰膽堿的刺激而發(fā)生活化，能特異地與Gq類G蛋白結(jié)合，起始信號的傳遞。M3 mAChR廣泛分布于人類的神經(jīng)元細胞（中樞神經(jīng)細胞和周圍神經(jīng)細胞）以及非神經(jīng)元細胞中[31]，而在非神經(jīng)元細胞中表達的乙酰膽堿和乙酰膽堿受體能夠調(diào)控細胞增殖、遷移以及分化等重要功能，它的失調(diào)與多種癌癥的發(fā)生發(fā)展相關(guān)[31-34]。GRK6對M3 mAChR的活性具有負調(diào)控作用，內(nèi)源性和過表達的GRK6都能磷酸化M3 mAChR，促進它與Gαq/11解偶聯(lián)，終止下游信號的傳遞[35-36]。雖然GRK6的表達變化對神經(jīng)母細胞瘤的增殖生長或遷移是否產(chǎn)生了影響并未得到說明，但是鑒于M3 mAChR在其他癌癥中的關(guān)鍵性調(diào)控作用，發(fā)現(xiàn)GRK6對它的磷酸化脫敏作用對于癌癥發(fā)生機制的進一步理解具有重要的意義。

髓母細胞瘤（Medulloblastoma，MB）組織樣本中發(fā)現(xiàn)了GRK6的表達下調(diào)，并且在轉(zhuǎn)移性的腫瘤組織中表達量更少。分子機制研究表明，在MB中GRK6的表達和蛋白穩(wěn)定性被血小板衍生生長因子受體（Platelet-Derived Growth Factor Receptor，PDGFR）及其下游效應蛋白Src所抑制，GRK6的下調(diào)促進了趨化因子受體CXCR4介導的信號通路激活，使下游效應蛋白細胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶（Extracellular signal-Regulated Kinase，ERK）的磷酸化水平升高，導致了細胞遷移增加[37]。

GRK6在人膠質(zhì)瘤中發(fā)揮了促癌作用[38]。腫瘤組織中GRK6的表達量明顯高于正常腦組織，且病理分級越高的患者腫瘤組織內(nèi)GRK6的表達量越高。在膠質(zhì)瘤細胞中過表達和敲低GRK6后發(fā)現(xiàn)，GRK6通過調(diào)控細胞周期使細胞增殖能力顯著提升。此外，還發(fā)現(xiàn)GRK6高表達有助于膠質(zhì)瘤細胞對化療藥物替莫唑胺（Temozolomide，TMZ）產(chǎn)生耐藥性，降低藥物對細胞的毒性以及誘導的細胞凋亡，表明在臨床應用TMZ治療膠質(zhì)瘤時聯(lián)合使用GRK6小分子抑制劑可能會產(chǎn)生更好的治療效果。

4 結(jié)語

越來越多的研究表明GRK6與腫瘤的發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)，涉及呼吸系統(tǒng)、消化系統(tǒng)、血液系統(tǒng)以及神經(jīng)系統(tǒng)中的多種惡性腫瘤。但隨著研究的深入，發(fā)現(xiàn)GRK6的調(diào)控機制非常復雜，在各類型腫瘤中的表達量變化也不盡相同，提示GRK6功能的多樣性，且其可能會以組織或細胞依賴的方式發(fā)生改變。在肺腺癌和肝癌中的研究都發(fā)現(xiàn)GRK6的表達下調(diào)與基因啟動子區(qū)發(fā)生了高甲基化相關(guān)，說明甲基化修飾可能是體內(nèi)調(diào)節(jié)GRK6表達的一個重要手段，但是介導這一修飾作用的具體機制及相關(guān)的甲基轉(zhuǎn)移酶尚未得到鑒別，未來在該方向上的進一步研究將有助于增加人們對GRK6在惡性腫瘤中作用的理解。盡管在各種惡性腫瘤中發(fā)生的改變有所不同，但GRK6促進腫瘤遷移和侵襲的效應幾乎是共有的，表明GRK6在調(diào)控細胞遷移方面的重要性。目前GRK6在很多類型腫瘤中的作用及機制仍存在空缺，繼續(xù)探究GRK6在其他類型腫瘤中發(fā)揮的作用對于系統(tǒng)地闡明GRK6的功能具有重要的意義，也將為各類腫瘤的治療提供新的線索。