三種不同滅活劑對豬細(xì)小病毒和豬圓環(huán)病毒的滅活效果研究

張春玲,趙本進(jìn),曹昌健,王瑞陽,錢忠輝,張俊平,葛宇燕,丁衛(wèi)星

(上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所,上海 201106)

豬細(xì)小病毒(Porcine parvovirus,PPV)是引起母豬繁殖障礙的主要病原體之一[1-2],其主要臨床表現(xiàn)為母源性繁殖障礙,同時(shí)還可引起仔豬的皮炎和腹瀉[3-4]。近幾年來,PPV的流行出現(xiàn)了一些新的特點(diǎn),PPV常常與PCV2、PRRSV、PRV中的一種或幾種病毒發(fā)生混合感染,使得病情復(fù)雜化,給臨床診斷和防控帶來了困難[5-7]。豬圓環(huán)病毒2型(Porcine circovirus type 2,PCV2)是已知的最小的動(dòng)物病毒之一,由于其攻擊豬體的免疫系統(tǒng),造成豬體免疫功能低下,抵抗力降低,進(jìn)一步導(dǎo)致其他病原的繼發(fā)或混合感染[8]。PCV2被公認(rèn)為是引起斷奶仔豬多系統(tǒng)消瘦綜合癥(PMWS)的主要病原,而PPV可刺激免疫系統(tǒng),促進(jìn)PCV2的增值,增強(qiáng)PCV2引起的PMWS,造成疫病的嚴(yán)重化[9-10]。

對于PPV和PCV2引起的各種疾病,目前國內(nèi)外主要運(yùn)用疫苗免疫預(yù)防,滅活疫苗因具有較好的安全性在防控中發(fā)揮著重要作用。在滅活疫苗的生產(chǎn)過程中,對病原微生物的滅活是整個(gè)過程中最關(guān)鍵、最基礎(chǔ)的部分。良好的滅活劑不僅有利于防止病原微生物感染,同時(shí)應(yīng)保留病原微生物良好的免疫原性,提高生物制劑的作用效果[9]。本試驗(yàn)采用甲醛、β-丙內(nèi)酯(BPL)和二乙烯亞胺(BEI)滅活PPV(S-1株)和PCV2(JSM株),探索3種滅活劑對PPV、PCV2的滅活效果,篩選最佳滅活參數(shù),旨在為進(jìn)一步研制PPV、PCV2滅活疫苗單苗以及二聯(lián)滅活疫苗奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 毒株及細(xì)胞

豬細(xì)小病毒(S-1株)、豬圓環(huán)病毒2型(JSM株)、ST細(xì)胞、PK-15細(xì)胞、豬細(xì)小病毒抗原均由上海佳牧生物制品有限公司保存。

l.2 主要試劑

甲醛(分析純)、二乙烯亞胺(BEI)、硫代硫酸鈉購自中國醫(yī)藥集團(tuán)有限公司化學(xué)試劑上海有限公司;β-丙內(nèi)酯購自德國Serva公司;豚鼠紅細(xì)胞懸液采自健康成年豚鼠(豚鼠購自上海生物制品研究所);硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基(TG)、胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基(TSB)、酪胨瓊脂培養(yǎng)基(GA)均購自北京中海生物科技有限公司。MEM和DMEM購自美國GIBCO公司;胎牛血清購自內(nèi)蒙古金源康生物工程股份有限公司?？筆CV2 Cap單克隆抗體購自韓國MEDIAN Diagnostics公司;羊抗鼠熒光二抗購自賽默飛世爾科技(中國)有限公司,D-氨基葡萄糖購自中國醫(yī)藥集團(tuán)有限公司。

1.3 滅活前病毒含量的測定

使用不含血清的細(xì)胞培養(yǎng)液將滅活前的PPV(S-1株)和PCV2(JSM株)病毒液進(jìn)行10倍稀釋,取10-4、10-5、10-6、10-74個(gè)稀釋度,分別接種生長良好的ST和PK-15單層細(xì)胞,每個(gè)稀釋度接種8個(gè)孔,每孔0.1 mL,在37℃、5% CO2培養(yǎng)箱孵育1 h。取出培養(yǎng)板,吸出病毒液,加入200μL含2%胎牛牛血清的細(xì)胞維持液,繼續(xù)培養(yǎng)72 h。收獲接種PPV(S-1株)的ST細(xì)胞,反復(fù)凍融3次。測定HA,HA≥25(微量法)者判為感染,計(jì)算PPV(S-1株)TCID50;通過IFA檢測接種PCV2(JSM株)的PK-15細(xì)胞,細(xì)胞有特異性熒光者判為感染。

1.4 病毒的滅活

1.4.1 甲醛滅活

40%的甲醛溶液經(jīng)無菌PBS稀釋后,緩慢加入含500 mL病毒液的三角瓶中,充分混勻,使其濃度分別為0.05%、0.1%、0.2%、0.3%。37℃恒溫滅活,每隔一段時(shí)間搖勻一次,分別在24 h、36 h、48 h、60 h取樣一次。取樣后,所有樣品均4℃保存,用于共同檢測HA活性、無菌檢驗(yàn)及滅活檢驗(yàn)。

1.4.2 BEI滅活

將10%的BEI溶液緩慢加入到病毒液中,使其終濃度分別為0.05%、0.1%、0.2%、0.3%,32℃恒溫滅活,每隔一段時(shí)間搖勻一次,分別在24 h、48 h、60 h、72 h、84 h、96 h取樣一次,以總體積1∕10的硫代硫酸鈉終止滅活。取樣后,所有樣品均4℃保存,用于共同檢測HA活性、無菌檢驗(yàn)及滅活檢驗(yàn)。

1.4.3 BPL滅活

取PPV、PCV2病毒液500 mL分別置于三角瓶中,加入β-丙內(nèi)酯,使其終濃度分別為0.03%、0.04%、0.05%、0.06%。4℃恒溫滅活,每隔一段時(shí)間搖勻一次,分別在24 h、36 h、48 h、72 h、96 h取一次樣,37℃、2 h終止滅活。取樣后,所有樣品均4℃保存,用于共同檢測HA活性、無菌檢驗(yàn)及滅活檢驗(yàn)。

1.5 滅活檢驗(yàn)

將采集到的滅活病毒液分別接種ST細(xì)胞和PK-15細(xì)胞,收獲盲傳3代的細(xì)胞培養(yǎng)物,通過HA和IFA試驗(yàn)判定滅活結(jié)果。

1.5.1 HA測定

按現(xiàn)行《中國獸藥典》附錄中HA試驗(yàn)方法,對收獲的滅活樣品進(jìn)行HA效價(jià)測定,同時(shí)設(shè)置病毒滅活前以及健康細(xì)胞對照。

1.5.2 IFA試驗(yàn)

將收集的滅活后PCV2樣品,以10的倍比稀釋倍數(shù)與PK-15細(xì)胞同步接種于96孔板,72 h后,棄培養(yǎng)液,無菌PBS洗滌3次,每孔加入150μL預(yù)冷的70%乙醇溶液固定液,常溫固定10 min,棄固定液,室溫風(fēng)干5—10 min,無菌PBS洗滌3次,每孔加入50μL以無菌PBS 1∶200稀釋的PCV2 Cap蛋白單抗,37℃孵育1 h。無菌PBS洗滌3次,每孔加入50μL以無菌PBS 1∶100稀釋的FITC標(biāo)記的羊抗鼠IgG,37℃孵育1 h。無菌PBS洗滌3次,每孔加入100μL無菌PBS,置于熒光顯微鏡下觀察。

1.6 無菌檢驗(yàn)

參照現(xiàn)行《中國獸藥典》附錄中無菌檢驗(yàn)方法,取收獲的滅活樣品接種TG小管和GA斜面各2支,每支0.2 mL,1支置于35—37℃培養(yǎng),1支置于23—25℃培養(yǎng);另取0.2 mL,接種1支TSB小管,置于23—25℃培養(yǎng),均培養(yǎng)7 d,每日觀察培養(yǎng)基狀況。

2 結(jié)果與分析

2.1 PPV滅活前、后血凝活性(HA)檢測

豬細(xì)小病毒(S-1株)病毒液滅活前血凝價(jià)為211,使用甲醛滅活,隨著甲醛濃度、滅活時(shí)間的增加,病毒液滅活60 h后血凝價(jià)下降至26—25;同批病毒液使用BEI和BPL滅活,滅活劑的濃度、滅活的時(shí)長對病毒液血凝價(jià)無明顯影響,病毒液滅活后的血凝價(jià)基本保持不變(圖1)。

圖1 三種滅活劑對PPV(S-1株)血凝價(jià)的影響Fig.1 Effects of 3 inactivators on the hemagglutination value of PPV(S-1 strain)

2.2 滅活檢測結(jié)果

使用甲醛滅活的病毒液接種細(xì)胞后,盲傳F1—F2代細(xì)胞的生長狀況不良,貼壁率低,培養(yǎng)至72 h時(shí)約50%的細(xì)胞死亡。由表1可見,甲醛濃度與滅活效率成正比,除0.05%的甲醛外,0.1%、0.2%和0.3%的甲醛均可徹底滅活PPV(S-1株)與PCV2(JSM株),未觀察到滅活樣品細(xì)胞培養(yǎng)物接種的細(xì)胞出現(xiàn)細(xì)胞病變效應(yīng)(CPE),HA試驗(yàn)于滅活后48 h未檢測到血凝活性(HA=20),IFA試驗(yàn)于滅活后36 h未出現(xiàn)特異性熒光(TCID50=100),證明病毒滅活完全。

表1 37℃下甲醛對PPV(S-1株)、PCV2(JSM株)滅活試驗(yàn)結(jié)果Table 1 Inactivation results of PPV(S-1 strain)and PCV2(JSM strain)by formaldehyde at 37℃

BEI滅活的病毒液接種細(xì)胞后,細(xì)胞生長狀況良好,與正常健康細(xì)胞無明顯差異。由表2可見,收獲盲傳3代接毒細(xì)胞培養(yǎng)物,經(jīng)HA試驗(yàn),除0.05%滅活組外,其余處理均在滅活后80 h有效滅活PPV(S-1株)(HA=20);IFA試驗(yàn)中,所有滅活組均在80 h有效滅活PCV2(JSM株)(TCID50=100),證明滅活完全。

表2 32℃下BEI對PPV(S-1株)、PCV2(JSM株)滅活試驗(yàn)結(jié)果Table 2 Inactivation results of PPV(S-1 strain)and PCV2(JSM strain)by BEI at 32℃

BPL滅活的病毒液接種細(xì)胞后,細(xì)胞生長狀況良好,與正常健康細(xì)胞無明顯差異。由表3可見,收獲盲傳3代接毒細(xì)胞培養(yǎng)物,經(jīng)HA試驗(yàn)與IFA試驗(yàn),所有滅活組均可有效滅活PPV(S-1株)(72 h)和PCV2(JSM株)(96 h)。

表3 4℃下BPL對PPV(S-1株)和PCV2(JSM株)滅活試驗(yàn)結(jié)果Table 3 Inactivation results of PPV(S-1 strain)and PCV2(JSM strain)by BPL at 4℃

2.3 無菌檢驗(yàn)

對采集的所有滅活樣品,按照現(xiàn)行《中國獸藥典》附錄中無菌檢驗(yàn)方法進(jìn)行檢驗(yàn),所有樣品均無菌生長,符合藥典要求。

3 討論

滅活疫苗是先對病原微生物進(jìn)行培養(yǎng),然后用物理或化學(xué)的方法(通常是甲醛、二乙烯亞胺或β-丙內(nèi)脂)將其滅活。滅活的病原微生物喪失感染的能力,但需保留良好的免疫原性。豬細(xì)小病毒病滅活疫苗和豬圓環(huán)病毒2型滅活疫苗自應(yīng)用以來,廣泛使用的是甲醛溶液滅活,滅活劑甲醛的使用歷史最為悠久,使用經(jīng)驗(yàn)也比較豐富,但因其具有強(qiáng)刺激性和高致癌性,已經(jīng)不能滿足當(dāng)前對生物制品高安全性的需求。烷化劑二乙烯亞胺(BEI)和雜環(huán)類化合物β-丙內(nèi)酯(BPL)是另一類高效的病毒滅活劑[11],二者的滅活原理相似,目前已被廣泛用于人和動(dòng)物疫苗的滅活劑。

本試驗(yàn)以傳統(tǒng)滅活劑甲醛作對照,用BPL和BEI對豬細(xì)小病毒(S-1株)和豬圓環(huán)病毒2型(JSM株)進(jìn)行滅活,通過血凝試驗(yàn)、滅活檢驗(yàn)等檢測滅活效果。37℃條件下,隨著甲醛濃度、滅活時(shí)間的增加,PPV(S-1株)血凝價(jià)呈現(xiàn)逐漸下降的趨勢,由滅活前的211下降至26—25;同批病毒液經(jīng)BEI和BPL滅活,滅活劑的濃度、滅活的時(shí)長對豬細(xì)小病毒(S-1株)血凝效價(jià)無顯著影響,滅活后的病毒液血凝價(jià)在211—212。血凝價(jià)滴度下降和上升可能的原因,首先與甲醛、BEI、BPL的滅活原理有關(guān),甲醛滅活是與病毒蛋白質(zhì)的胺基結(jié)合,從而形成羥甲基衍生物,或者二羥甲基衍生物,后者進(jìn)一步再與酰胺發(fā)生交聯(lián)反應(yīng)[13-14],病毒蛋白質(zhì)因而變性,這種變性往往是不可逆的,嚴(yán)重破壞病毒衣殼蛋白;BEI、BPL均直接作用于病毒核酸,使其結(jié)構(gòu)發(fā)生變化不再具有復(fù)制能力,這種變化不影響病毒蛋白成分,最大程度地保留了病毒的抗原性[15-16]。其次,在滅活過程中,病毒液中的細(xì)胞進(jìn)一步被破碎,病毒顆粒得以充分釋放,進(jìn)而提升了滅活后的病毒效價(jià)。隨劑量增大,溫度升高,BEI的滅活效率有遞增趨勢,但有研究表明,高溫狀態(tài)下的BEI具有一定的毒性[17],28—32℃是其安全有效的溫度。終濃度為0.1%的BEI在32℃下,80 h和72 h可有效滅活PPV(S-1株)和PCV2(JSM株)。BPL是一種雜環(huán)類化合物,常溫下是無色粘稠狀液體,高溫會(huì)降解,影響滅活效率,需要冷凍保存,其在4℃條件下,對病毒具有很強(qiáng)的滅活作用。

在滅活程序中,隨著滅活劑濃度的提高、滅活時(shí)間的延長,其滅活效果愈加確實(shí)。然而,滅活時(shí)間并非越長越好,游離狀態(tài)的滅活劑會(huì)持續(xù)對抗原產(chǎn)生破壞作用。同時(shí),若游離的滅活劑隨疫苗注射到機(jī)體后,會(huì)產(chǎn)生強(qiáng)烈的刺激作用,表現(xiàn)出機(jī)體對疫苗的應(yīng)激反應(yīng)[18]。為了減少對抗原的損傷,避免過多的疫苗副反應(yīng),在滅活結(jié)束后往往添加滅活終止程序:如通過加入焦亞硫酸鈉終止甲醛滅活,加入硫代硫酸鈉終止BEI滅活,而BPL極易水解,無需添加終止劑,37℃水浴2 h后即可水解為無毒性的人體脂肪代謝產(chǎn)物——β-羥基丙酸。

本研究顯示,3種滅活劑均可有效地滅活PPV(S-1株)和PCV2(JSM株),但甲醛對豬細(xì)小病毒表面抗原損傷嚴(yán)重。BEI作為滅活劑首先需要經(jīng)過氫氧化鈉進(jìn)行環(huán)化,其次滅活時(shí)間較長,延長了企業(yè)的生產(chǎn)周期,增加了企業(yè)的生產(chǎn)成本,32℃的滅活溫度適宜細(xì)菌生長,再次加大的企業(yè)對無菌控制的壓力。BPL以其高效的滅活效率:滅活程序簡單,滅活時(shí)間短,37℃僅需2 h即可完全水解,無殘留,縮短了疫苗的生產(chǎn)周期,提高了經(jīng)濟(jì)效益,可作為疫苗企業(yè)優(yōu)選的滅活劑。根據(jù)試驗(yàn)數(shù)據(jù),結(jié)合生產(chǎn)成本和生產(chǎn)周期,本研究制定的對豬細(xì)小病毒(S-1株)和豬圓環(huán)病毒2型(JSM株)最佳滅活程序?yàn)?在4℃條件下,終濃度為0.05%的BPL滅活48 h。