基于葉綠素?zé)晒獬上竦挠衩酌缙谌~片光合特性垂直分布

肖天璞，楊 麗，張東興，王糧局，張?zhí)炝?，杜兆輝，李鴻盛，夏徐隆

基于葉綠素?zé)晒獬上竦挠衩酌缙谌~片光合特性垂直分布

肖天璞，楊 麗，張東興，王糧局※，張?zhí)炝粒耪纵x，李鴻盛，夏徐隆

（1. 中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)工學(xué)院，北京 100083；2. 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部土壤-機(jī)器-植物系統(tǒng)技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100083）

作物的綜合光合作用能力直接決定糧食產(chǎn)量，探明作物光合特性分布機(jī)制是開發(fā)新品種、研發(fā)新農(nóng)藝的一個(gè)關(guān)鍵科學(xué)問題。為探究玉米植株光合特性的垂直分布規(guī)律，該研究利用熒光成像技術(shù)對(duì)不同品種和不同氮、水處理的5葉期樣本進(jìn)行圖像采集，對(duì)植株不同葉片的熒光淬滅特性及熒光參數(shù)進(jìn)行分析。熒光淬滅特性分析表明，葉片光量子產(chǎn)量隨垂直高度的增加呈上升趨勢(shì)；由非加權(quán)組平均法聚類產(chǎn)生的四類淬滅特性中，鄭單958在不同環(huán)境中的熒光淬滅垂直分布異質(zhì)性小于先玉335和浚單20。關(guān)鍵熒光參數(shù)分析結(jié)果表明，葉片最大光能轉(zhuǎn)換效率、實(shí)際光能轉(zhuǎn)換效率、光反應(yīng)電子傳遞活性隨垂直高度的增加呈上升趨勢(shì)，除衰老葉片外的非光化學(xué)能量耗散差異性不顯著。光合特性垂直分布分析表明，不同土壤氮含量下樣本的最大光量子效率（Fv/Fm）有較為顯著的二次函數(shù)分布特征，隨著土壤氮含量的降低，垂直分布的異質(zhì)性增大；不同品種間的穩(wěn)態(tài)光適應(yīng)光化學(xué)淬滅（qL_Lss）有較為顯著的一次函數(shù)分布特征，鄭單958表現(xiàn)出較強(qiáng)的抗逆性?；跈C(jī)器學(xué)習(xí)方法，以熒光參數(shù)垂直分布數(shù)據(jù)分類植株組別的結(jié)果表明，鄭單958樣本的最大光量子效率（Fv/Fm）、微量土壤氮含量下樣本的最大光量子效率（Fv/Fm）和干旱環(huán)境下樣本的穩(wěn)態(tài)非光化熒光淬滅（NPQ_Lss）判別準(zhǔn)確率分別達(dá)0.82、0.94和0.88，與其他處理及熒光參數(shù)相比，垂直分布規(guī)律更顯著；其他熒光參數(shù)的分布特征并不能有效判別樣本組別。將葉片按植株形態(tài)學(xué)自下而上排序，由植株葉片光合垂直異質(zhì)性關(guān)鍵葉片分析，第2片葉片可以作為垂直分布的“特征葉片”評(píng)估玉米品種和土壤氮含量，第1片葉片可以作為垂直分布的“特征葉片”評(píng)估植株土壤水含量。

葉綠素?zé)晒?；光合作用；玉米；垂直分?/p>

0 引 言

光合作用貫穿植物生長(zhǎng)發(fā)育的整個(gè)過程，是植物生長(zhǎng)發(fā)育的基礎(chǔ)[1]。作為一種高光效的C4植物，玉米的光合作用特性對(duì)其生物量的積累影響更為顯著，直接決定了玉米的產(chǎn)量[2]。目前工程領(lǐng)域的植株光合特性研究以葉片光合關(guān)聯(lián)性分析和脅迫分析為主，研究光合作用與葉片成分含量之間的關(guān)聯(lián)[3-4]，或通過分析生物脅迫[5-6]或非生物脅迫[7-9]下的葉片光合特性，實(shí)現(xiàn)逆境下植物生長(zhǎng)狀態(tài)的快速獲取。然而，植物體是一個(gè)具有復(fù)雜生理環(huán)境的整體，單一的葉片光合特征測(cè)量具有隨機(jī)性與片面性，不能精準(zhǔn)全面地表征整個(gè)植株的生長(zhǎng)狀態(tài)，難以探明復(fù)雜植物體的光合作用機(jī)制，而目前葉片光合作用在整個(gè)植株上的研究相對(duì)較少。

目前植物整株光合作用的相關(guān)研究主要分為兩種，一是研究葉片特征的垂直分布規(guī)律，另一種是垂直分布特性對(duì)光合作用影響的研究。Moulin等[10]研究了玉米植株垂直高度上葉面積、葉綠素含量的變化，并利用反射光譜對(duì)葉綠素含量進(jìn)行分層評(píng)估；Fan等[11]通過測(cè)量玉米葉面積的垂直分布，開發(fā)了一種更適用于現(xiàn)代玉米生長(zhǎng)的葉面積垂直分布方程；Lindquist等[12]通過測(cè)量與光合作用競(jìng)爭(zhēng)密切相關(guān)的葉面積指數(shù)，研究其垂直分布規(guī)律，分析不同玉米品種的耐密機(jī)制；Li等[13]通過研究不同水分條件下玉米葉片葉綠素和氮含量的垂直分布二次曲線規(guī)律，驗(yàn)證玉米葉片光合特性與水分含量的顯著相關(guān)性。以上研究?jī)?nèi)容多采用破壞性的測(cè)量方法或分層單點(diǎn)測(cè)量方法，這些方法通常測(cè)量復(fù)雜，易受到環(huán)境因素的影響。

隨著高通量表型檢測(cè)技術(shù)的發(fā)展，光譜技術(shù)、高光譜成像技術(shù)也越來越多地應(yīng)用到光合作用分析中。相關(guān)研究表明高光譜成像可作為一種有效的技術(shù)手段，實(shí)現(xiàn)作物冠層對(duì)葉片特征垂直分布的預(yù)測(cè)。Wu等[14]采用多角度高光譜裝置對(duì)小麥進(jìn)行遙感，并評(píng)估了小麥冠層葉綠素含量的垂直分布；He等[15]基于高光譜遙感建立了水稻葉片氮含量的垂直分布預(yù)測(cè)模型。但基于光譜反射率反演葉片垂直分布特征的準(zhǔn)確率通常不夠穩(wěn)定，易受到外界反射信號(hào)的影響，并且不能夠很好地表達(dá)和監(jiān)測(cè)植株的生理狀態(tài)[16]。葉綠素?zé)晒獬上窦夹g(shù)是目前國(guó)際最流行的光合作用檢測(cè)技術(shù)之一，具有高通量、無損傷的優(yōu)點(diǎn)，并已成為作物育種中表型檢測(cè)的基本工具之一。同時(shí)，葉綠素?zé)晒膺€可闡明損傷機(jī)理和調(diào)節(jié)機(jī)制，在光合作用、植物脅迫的研究上得到了廣泛應(yīng)用。張佳菲等[17]通過快速葉綠素?zé)晒饧夹g(shù)，探究出不同氮素處理水平下油菜苗期冠層內(nèi)生化參數(shù)及光合性能的垂直分布變化特性；Feng等[18]利用冬小麥上層葉片葉綠素?zé)晒鈪?shù)評(píng)估了植株氮素狀況。目前，葉綠素?zé)晒饧夹g(shù)在整個(gè)植株水平的光合作用分布研究較少，多為單點(diǎn)測(cè)量熒光參數(shù)在垂直方向上的分布，不能全面獲得葉片表型數(shù)據(jù)，而在整個(gè)植株水平上以葉綠素?zé)晒獬上駷榉椒▽?duì)葉片光合作用特性的研究卻鮮有報(bào)道。

本研究設(shè)計(jì)了一組析因試驗(yàn)，以3個(gè)典型玉米雜交品種的不同土壤氮元素、水分處理的玉米5葉期（V5）植株為研究對(duì)象，采用葉綠素?zé)晒獬上竦姆椒?，無損高通量成像整株熒光狀況，通過對(duì)植株不同葉片的熒光淬滅特性及熒光參數(shù)進(jìn)行分析，研究玉米植株葉片的光合特性垂直分布，以期為探明植株內(nèi)光合特性分布機(jī)制提供一種研究方法和思路。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料準(zhǔn)備

育苗時(shí)間為2021年11月，地點(diǎn)為中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)水利與土木工程學(xué)院日光溫室（東經(jīng)116°21′，北緯40°）。選取市場(chǎng)上廣泛被應(yīng)用的3個(gè)玉米品種：鄭單958（ZD958）、先玉335（XY335）、浚單20（JD20）。

試驗(yàn)前期在植物工廠內(nèi)放置育苗盤進(jìn)行育苗催芽（溫度25℃），兩葉期選取長(zhǎng)勢(shì)良好且相近的、與試驗(yàn)需求同樣數(shù)量的玉米苗移栽至溫室（溫度20～25℃，濕度50%），考慮到冬季光照時(shí)間較短，每天17:00—19:00補(bǔ)光2 h，補(bǔ)光燈光照通量約500mol/(m2·s)。栽培介質(zhì)選擇草炭、珍珠巖、椰糠按質(zhì)量比2∶1∶1配比混合的土壤基質(zhì)[19]，育苗前肥料作基肥施加至土壤基質(zhì)。育苗盆使用內(nèi)徑16 cm的圓柱形育苗盆，每盆裝土壤基質(zhì)體積3 L，質(zhì)量約1 kg。

根據(jù)玉米盆栽種植的肥量需求，盆栽施肥量一般為田間施肥量的2～3倍[20]，考慮到土壤基質(zhì)質(zhì)量較輕，按比例調(diào)高施肥量。正常施肥量為純氮0.75 g/kg土、P2O50.50 g/kg土、鉀K2O 0.60 g/kg土，即每個(gè)盆載的正常施肥量為過磷酸鈣3.12 g、氯化鉀1.00 g；尿素1.63 g。試驗(yàn)中，設(shè)置微量氮肥（N0）、少量氮肥（N1）、正常氮肥（N2）3個(gè)梯度。每盆施加尿素分別為0、66%、100%正常量，即每盆施加氮肥的質(zhì)量分別為0、1.09、1.63 g。試驗(yàn)采用鄭單958（ZD958）、先玉335（XY335）、浚單20（JD20）3個(gè)玉米品種，微量氮肥（N0）、少量氮肥（N1）、正常氮肥（N2）3個(gè)施肥量進(jìn)行全因素試驗(yàn)，進(jìn)行6組重復(fù)，共計(jì)54盆，具體試驗(yàn)設(shè)計(jì)見表1。玉米溫室生長(zhǎng)期間，每7 d灌水200 mL，并進(jìn)行位置隨機(jī)化排布。數(shù)據(jù)采集時(shí)間為玉米植株5葉期，數(shù)據(jù)采集的前一周，只對(duì)6組重復(fù)中的3組（尾號(hào)1～3）進(jìn)行灌水處理（W），其他3組進(jìn)行干旱脅迫（D）。

表1 不同品種與施肥水平下玉米種植試驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.2 數(shù)據(jù)采集

本試驗(yàn)所采用的葉綠素?zé)晒獬上裣到y(tǒng)為FluorCam大型葉綠素?zé)晒獬上衿脚_(tái)（FC800-D/8080，Photon Systems Instruments，Czech Republic）。熒光成像平臺(tái)使用帶有定焦鏡頭的CCD相機(jī)，分辨率為720×560像素，幀率為50幀/s。光源由5組發(fā)光二極管組成，包括測(cè)量光（620 nm紅光）、紅外光（735 nm）、光化光Actinic1（620 nm紅光）、光化光Actinic2（冷白光）、飽和光（冷白光）5種光源，可實(shí)現(xiàn)最大光量子效率測(cè)量和葉綠素?zé)晒獯銣绶治觥Ｆ渲?，本試?yàn)中使用的光源有測(cè)量光、光化光Actinic2和飽和光源。圖像采集系統(tǒng)組成如圖1所示。

1.支架 2.成像系統(tǒng)主機(jī) 3.光源 4.高度調(diào)節(jié)滑道 5.主電源開關(guān) 6.CCD相機(jī) 7.網(wǎng)線 8.樣本 9.泡沫板 10.計(jì)算機(jī) 11.圖像采集軟件

圖像采集全程在黑暗狀態(tài)條件下進(jìn)行，成像空間內(nèi)無風(fēng)，避免葉片晃動(dòng)；試驗(yàn)前將待測(cè)植株在日光下充分光照20 min，光照強(qiáng)度350～400mol/(m2·s)，之后充分暗適應(yīng)30 min，以獲得最佳熒光狀態(tài)。植株橫向放置于圖像采集區(qū)，位置位于成像平臺(tái)的正中央，使用泡沫板固定位置以確保成像穩(wěn)定性；通過高度調(diào)節(jié)滑道進(jìn)行成像高度控制，成像平面距離鏡頭60 cm，保證每株成像面積不超過相機(jī)成像窗口面積的2/3；植株葉片的位置在鏡頭下的成像互不干擾且盡可能保持水平，確保成像的清晰有效。首先以5%的梯度進(jìn)行10組預(yù)試驗(yàn)成像，結(jié)果表明在最大飽和光強(qiáng)的30%（1 346.0mol/(m2·s)）及以上的脈沖作用下，樣本最大光量子效率Fv/Fm穩(wěn)定在0.78左右，已達(dá)到飽和點(diǎn)[21]，由此確定正式試驗(yàn)的飽和光強(qiáng)為30%。由玉米實(shí)際生長(zhǎng)環(huán)境下的光照[22]確定光化光（Actinic2）的強(qiáng)度為其最大光強(qiáng)的70%（382.9mol/(m2·s))。葉綠素?zé)晒獬上竦恼皆囼?yàn)采用淬滅分析（Quenching Analysis）[23]，試驗(yàn)進(jìn)行之前，將植株重新進(jìn)行20 min暗適應(yīng)，按隨機(jī)順序分別對(duì)每盆植株進(jìn)行成像試驗(yàn)，單次成像一盆植株。淬滅分析中，第一次暗適應(yīng)階段初始熒光Fo的持續(xù)時(shí)間5 s，飽和脈沖持續(xù)時(shí)間0.96 s，最大熒光Fm測(cè)量后的暫停時(shí)間為15 s；光適應(yīng)階段光化光的作用時(shí)間為70 s，脈沖數(shù)量6次，脈沖持續(xù)時(shí)間0.96 s，脈沖間隔分別為9、9、9、19、19 s；第二次暗適應(yīng)階段中脈沖數(shù)量為3次，脈沖持續(xù)時(shí)間0.96 s，脈沖間隔29 s。本試驗(yàn)中激發(fā)光作用時(shí)間點(diǎn)、作用環(huán)境及熒光淬滅動(dòng)力學(xué)曲線示意圖如圖2所示。

圖2 葉綠素?zé)晒忖绶治鍪疽鈭D

圖像采集時(shí)期為玉米植株5葉期（V5）。由于植株可能出現(xiàn)下層葉片衰老脫落的現(xiàn)象，每盆植株共獲取4～5個(gè)葉片的熒光圖像，由植株形態(tài)學(xué)由下至上的順序標(biāo)記葉片，分別記錄為“葉片1”～“葉片5”（若葉片1脫落，則只記錄“葉片2”～“葉片5”），試驗(yàn)共獲得245個(gè)熒光圖像樣本。

1.3 數(shù)據(jù)分析

通過感興趣區(qū)域（Region Of Interest，ROI）的選擇對(duì)玉米植株進(jìn)行圖像劃分，獲取每株玉米不同位置葉片的熒光淬滅動(dòng)力學(xué)曲線、熒光參數(shù)、熒光參數(shù)圖像。本研究中使用到的主要熒光參數(shù)符號(hào)、計(jì)算式及其概念描述如表2所示。采用一維卷積移動(dòng)平均對(duì)熒光淬滅動(dòng)力學(xué)曲線進(jìn)行降噪，并去除邊界效應(yīng)，以消除環(huán)境噪聲的干擾；采用基于層次化聚類方法的非加權(quán)組平均法（Unweighted Pair-group Method with Arithmetic Means，UPGMA）對(duì)熒光淬滅中的熒光參數(shù)進(jìn)行聚類分析[24]，以度量樣本間的相似度；采用曼-惠特尼U檢驗(yàn)（Mann-Whitney U test）進(jìn)行葉片間的顯著性分析[25]，以更好地分析復(fù)雜環(huán)境中的樣本；使用多元回歸擬合的方法進(jìn)行單個(gè)熒光參數(shù)的特征擬合；對(duì)于以多個(gè)葉片為特征的單個(gè)熒光參數(shù)以及以多個(gè)熒光參數(shù)為特征的單個(gè)葉片，采用支持向量機(jī)（Support Vector Machines，SVM）、隨機(jī)森林（Random Forest，RF）、偏最小二乘（Partial Least Squares，PLS）判別分析3個(gè)分類算法來進(jìn)行玉米品種、土壤氮含量、土壤水含量的判別建模[26-28]，并進(jìn)行了十折交叉驗(yàn)證，驗(yàn)證特征的規(guī)律性強(qiáng)弱；使用偏最小二乘變量重要性預(yù)測(cè)（Partial Least Squares-Variable Important in Projection，PLS-VIP）對(duì)熒光參數(shù)中的特征進(jìn)行評(píng)分[29]，篩選具有較高權(quán)重的特征葉片。

表2 本研究中使用的關(guān)鍵熒光參數(shù)、計(jì)算式及其概念

注：Fo：初始熒光；Fm：最大熒光；Fm_Lss：光適應(yīng)后的穩(wěn)態(tài)最大熒光；Fp：Kautsky誘導(dǎo)效應(yīng)最大熒光；Ft_Lss：光適應(yīng)穩(wěn)態(tài)熒光；Fv_Lss：穩(wěn)態(tài)可變熒光；Fq_Lss：穩(wěn)態(tài)淬滅熒光。

Note: Fo: initial fluorescence; Fm: maximum fluorescence; Fm_Lss: steady-state maximum fluorescence after light adaptation; Fp: Kautsky induced effect maximal fluorescence; Ft_Lss: light-adapted steady-state fluorescence; Fv_Lss: steady-state variable fluorescence; Fq_Lss: steady-state quenched fluoescence.

2 結(jié)果與分析

2.1 葉片熒光淬滅特性垂直分布異質(zhì)性分析

熒光淬滅動(dòng)力學(xué)曲線表達(dá)了淬滅過程中不同時(shí)間的實(shí)際熒光產(chǎn)量，可通過反映PSⅡ的電子傳遞情況，表達(dá)葉片實(shí)際的光合作用強(qiáng)度，進(jìn)而表征植物的光合性能。如圖3為2種玉米品種、2種土壤氮含量、2種土壤水含量的綜合處理下，植株不同位置的葉片的熒光動(dòng)力學(xué)曲線分布圖，由熒光淬滅動(dòng)力學(xué)曲線的整體分布圖得出，葉片1的總體熒光強(qiáng)度最低，最大熒光Fm在300～550 (a.u.)之間；葉片2次之，最大熒光Fm在500～750 (a.u.) 之間；葉片3的最大熒光Fm在700～900 (a.u.)之間；葉片4、葉片5的最大熒光Fm相近，在800～1 100 (a.u.)之間。隨著葉片高度的增加，總體熒光強(qiáng)度呈逐漸增大趨勢(shì)，其中，葉片1～葉片3的光合作用能力具有較高的區(qū)分度；葉片3～葉片5的曲線仍呈遞增趨勢(shì)，但差別不明顯。受到多種處理相互作用的影響，每個(gè)位置的葉片都具有較寬的誤差帶，誤差帶最寬的部分位于Fm—Fm_Lss階段，表明光適應(yīng)部分的熒光參數(shù)更易受到品種、氮、水因素的影響。此外，隨著葉片高度的增加，植株葉片從Fm_L3到Fm_Lss的曲線斜率顯著增加，表明光適應(yīng)過程中較高位置的葉片產(chǎn)生了較快的熒光淬滅。

注：圖中葉片位置編號(hào)順序?yàn)橹仓晷螒B(tài)學(xué)由下至上，各葉片類別中心的加粗線為其動(dòng)力學(xué)曲線的均值，兩側(cè)為曲線誤差帶。曲線上方的標(biāo)記為熒光淬滅過程的關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)，其中，后綴Ln為第n次脈沖的光適應(yīng)熒光，Dn為第n次脈沖的暗弛豫熒光，下同。

不同的試驗(yàn)樣本按照不同試驗(yàn)處理可分為18組，每種處理的樣本按垂直高度上葉片的位置進(jìn)一步劃分為90類樣本。在葉綠素?zé)晒獬上裣到y(tǒng)獲得的101個(gè)熒光參數(shù)中，31個(gè)為基礎(chǔ)熒光參數(shù)，即直接由葉綠素?zé)晒獬上裣到y(tǒng)采集獲得的參數(shù)，70個(gè)為間接熒光參數(shù)?；谏鲜鰺晒鈩?dòng)力學(xué)曲線分布的分析，基礎(chǔ)熒光參數(shù)不足以表達(dá)不同樣本間的熒光淬滅特性，因此選取上述90種樣本及其對(duì)應(yīng)的31個(gè)與熒光強(qiáng)度直接相關(guān)的參數(shù)（包含基礎(chǔ)熒光參數(shù)31個(gè)，間接熒光參數(shù)16個(gè)），其中，基礎(chǔ)熒光參數(shù)分別為葉綠素?zé)晒獯銣绶治龆啻蚊}沖過程中初始熒光Fo、Kautsky誘導(dǎo)效應(yīng)最大熒光Fp、最大熒光Fm、光適應(yīng)即時(shí)熒光Ft的系列參數(shù)（Fp包含3種計(jì)算方式，其他參數(shù)包含其光適應(yīng)參數(shù)和暗弛豫參數(shù)），間接熒光參數(shù)分別為葉綠素?zé)晒獯銣绶治鲋锌勺儫晒釬v、淬滅熒光Fq的系列參數(shù)（包含其光適應(yīng)參數(shù)和暗弛豫參數(shù)）。對(duì)熒光參數(shù)值進(jìn)行對(duì)數(shù)處理后進(jìn)行了非加權(quán)組平均法聚類分析，得到垂直高度上5片葉片的熒光參數(shù)的聚類熱圖如圖4所示。受圖片尺寸限制，對(duì)顯示結(jié)果進(jìn)行等距采樣，其中樣本僅顯示30類，熒光參數(shù)僅顯示24個(gè)。

根據(jù)聚類結(jié)果，樣本聚類可分為四大類。其中，第一大類以葉片1的樣本為主，且顯著區(qū)別于其他類；第二大類以葉片2為主；第三大類以葉片3的樣本為主，但較高土壤氮含量處理下先玉335的較高位葉片以及較低土壤氮含量處理下浚單20的較低位葉片也有少量樣本分布在此類；第四大類以葉片5為主，且各品種的葉片3、葉片4均有出現(xiàn)。綜上分析，在5片葉片的垂直分布中，葉片1與葉片2不受品種、土壤氮含量、土壤水含量的影響，其熒光淬滅過程中的熒光參數(shù)均有較為顯著的區(qū)分特征。多數(shù)樣本的葉片3具有相同的熒光特性，但浚單20和先玉335的部分葉片樣本受到環(huán)境因素的影響，垂直分布特性發(fā)生了變化。多數(shù)樣本的葉片5具有相同的熒光特性，部分較高土壤氮含量中的樣本的葉片3、葉片4也與此類樣本有類似的熒光淬滅特征。對(duì)比上述結(jié)果可進(jìn)一步得出結(jié)論，鄭單958在不同土壤氮含量的條件下，垂直分布異質(zhì)性較其他兩個(gè)品種變化較小，擁有更強(qiáng)的耐低氮能力，這與齊紅志等[33]的研究結(jié)論相符。此外，土壤水含量并未對(duì)聚類結(jié)果產(chǎn)生顯著的影響。

注：熱圖中熒光參數(shù)值的大小以熱圖顏色表示，顏色越深，參數(shù)值越大。樣本聚類結(jié)果中，“l(fā)eaf n”代表植株形態(tài)學(xué)由下至上的第n片葉片，其他標(biāo)記釋義見表1。Ft為光適應(yīng)即時(shí)熒光；Fv為可變熒光；Fq為淬滅熒光，其他標(biāo)記釋義見表2。

由熒光動(dòng)力學(xué)曲線表征的47個(gè)熒光參數(shù)聚類為三大類，包含了不同類型信息，但同時(shí)具有一定共線性，需要利用數(shù)據(jù)挖掘產(chǎn)生的具有更為明確意義和普遍性的指標(biāo)進(jìn)行表達(dá)。

2.2 葉片熒光參數(shù)的垂直分布異質(zhì)性分析

2.2.1 葉綠素?zé)晒鈪?shù)圖像分析

通過不同處理下各熒光參數(shù)成像結(jié)果的對(duì)比，篩選出了不同處理下熒光參數(shù)峰值差異顯著，且不同重復(fù)中空間分布一致性較強(qiáng)的3個(gè)參數(shù)：Fv/Fm、qL_Lss和Rfd_Lss。將上述3個(gè)參數(shù)的典型圖像進(jìn)行了可視化對(duì)比，結(jié)果如圖5所示。

圖5 不同品種、氮環(huán)境下的葉綠素?zé)晒獬上駡D

最大光量子效率Fv/Fm的分布范圍主要在0.6～0.8，且正常土壤氮含量下的Fv/Fm參數(shù)值明顯高于微量土壤氮含量，表明土壤氮含量會(huì)顯著影響葉片光合反應(yīng)中心內(nèi)的最大光能轉(zhuǎn)換效率。由于葉片衰老的影響，葉片1與其他葉片相比在整體上表現(xiàn)出了顯著的差異，但參數(shù)在各葉片內(nèi)部各點(diǎn)的分布上差異不明顯，表明正常生長(zhǎng)的葉片最大光能轉(zhuǎn)換效率在垂直高度上的差異性較小。

穩(wěn)態(tài)光化學(xué)淬滅系數(shù)qL_Lss的分布范圍主要在0.5～1.0之間，且正常土壤氮含量下的qL_Lss參數(shù)值明顯高于微量土壤氮含量，表明土壤氮含量會(huì)顯著影響葉片光合反應(yīng)中心內(nèi)的光化學(xué)反應(yīng)比例[34]。在垂直高度的分布上，葉片的光化學(xué)淬滅呈上升趨勢(shì)，表明較高位置的葉片具有較高的電子傳遞活性；在葉片內(nèi)分布上，熒光參數(shù)較大值主要分布在葉片中部，而在葉片邊緣、葉片尖部和生長(zhǎng)點(diǎn)的值較小，表明此部位在光合作用中具有較高的電子傳遞活性。

穩(wěn)態(tài)熒光衰減率Rfd_Lss的分布范圍主要在0～2之間，熒光參數(shù)值的分布隨土壤氮含量的不同產(chǎn)生了顯著的差異。垂直分布上，微量土壤氮含量的葉片4、葉片5與較低位葉片顯著不同，而正常土壤氮含量的葉片3及其以上的葉片沒有明顯的變化，表明土壤氮含量的降低會(huì)顯著降低植株整體的葉片活性。參數(shù)在葉片內(nèi)各點(diǎn)的分布上與參數(shù)qL_Lss類似，熒光參數(shù)較大值主要分布在葉片中部，說明此葉片部位的葉片活性較強(qiáng)。

綜合葉片熒光參數(shù)成像結(jié)果可知，葉片3及以上的葉片熒光參數(shù)異質(zhì)性明顯降低，且顯著受到不同土壤氮含量的影響；不同玉米品種的熒光特征沒有產(chǎn)生顯著的成像差異，因此需要進(jìn)一步研究其分布規(guī)律，探究品種間光合作用特性的顯著性差異。

2.2.2 熒光參數(shù)垂直分布異質(zhì)性分析

為探究不同位置葉片熒光參數(shù)分布特性，選取了多因素綜合作用下各葉片的典型熒光參數(shù)進(jìn)行分析，圖6展示了不同位置葉片關(guān)鍵熒光參數(shù)的分布差異。其中，圖6 a為各葉片的Fv/Fm分布，結(jié)果表明隨著垂直高度的增加，其最大光量子效率Fv/Fm呈明顯的上升趨勢(shì)，且葉片1與葉片2（<0.001）、葉片4與葉片5（<0.05）之間具有顯著性差異。這表明隨著垂直高度的增加，葉片的PSⅡ最大光能轉(zhuǎn)化效率增大，臨近衰老的葉片（葉片1）與正常生長(zhǎng)的葉片相比，PSⅡ最大光能轉(zhuǎn)化效率顯著降低，新生葉片（葉片5）與正常生長(zhǎng)的葉片相比，PSⅡ最大光能轉(zhuǎn)化效率顯著增大。圖6b為各葉片的△F/Fm’分布，結(jié)果表明隨著垂直高度的增加，其實(shí)際光量子效率均值呈上升趨勢(shì)，這表明隨著垂直高度的增加，葉片的PSⅡ?qū)嶋H光能轉(zhuǎn)換效率增大。葉片1與葉片2之間、葉片2與葉片3之間、葉片4與葉片5之間的差異不明顯（≤1.00）；葉片1、葉片2、葉片3與葉片4、葉片5之間具有顯著性差異（<0.001）。這表明葉片4和葉片5在實(shí)際的光合作用中具有更大優(yōu)勢(shì)。圖6 c為各葉片的qL_Lss分布，結(jié)果表明隨著垂直高度的增加，光化學(xué)淬滅分3個(gè)層次顯著增加，葉片1為第一層，葉片2、葉片3為第二層，葉片4、葉片5為第三層，表明植株的光反應(yīng)電子傳遞活性逐級(jí)增高，葉片4、葉片5的反應(yīng)中心電子傳遞活性最強(qiáng)。張子山等[35]的研究表明了隨著葉片的衰老，最大光能轉(zhuǎn)換效率和電子傳遞活性均有降低趨勢(shì)，與本文上述研究結(jié)果相符。圖6 d為各葉片的NPQ_Lss分布，結(jié)果表明隨著垂直高度的增加，葉片2及其以上葉片穩(wěn)態(tài)非光化學(xué)淬滅NPQ_Lss差異并不顯著，初步判斷葉片1的非光化學(xué)淬滅相對(duì)較高的主要原因是其本身光合機(jī)構(gòu)的老化。

2.3 葉片光合特性的垂直分布規(guī)律探究

2.3.1 不同處理下葉片光合特性垂直分布規(guī)律研究

為了探究不同處理下植株葉片光合特性的垂直分布規(guī)律，對(duì)上述處理的葉片關(guān)鍵熒光參數(shù)在垂直方向的分布進(jìn)行了擬合，如圖7所示。由圖7 a可知，不同土壤氮含量處理樣本的Fv/Fm參數(shù)在95%水平下有顯著的二次函數(shù)分布特征，隨著葉片高度的增加，PSⅡ反應(yīng)中心內(nèi)的最大光能轉(zhuǎn)換效率呈增大趨勢(shì)，且增幅越來越小，表明新生葉片的最大光合作用效率高于較早生長(zhǎng)的低位葉片，且隨葉片高度的增加，葉片間的最大光能轉(zhuǎn)換效率差距逐漸縮小。此外，對(duì)植株不同氮含量處理會(huì)顯著影響熒光參數(shù)的垂直分布特性，隨著土壤氮含量的增加，垂直分布曲線的二次項(xiàng)系數(shù)和截距均呈增大趨勢(shì)，整體曲線的高度增加，且微量土壤氮含量條件對(duì)垂直分布產(chǎn)生了更大的影響，其葉片4的Fv/Fm到達(dá)了曲線最高點(diǎn)，這是因?yàn)橥寥赖繒?huì)顯著影響葉片蛋白質(zhì)生成，進(jìn)而影響其葉綠素含量，導(dǎo)致低位葉片的較早衰老，高位葉片養(yǎng)分不足[36]。由圖7b可知，不同品種間的qL_Lss參數(shù)分布近似于一次函數(shù)，隨著垂直高度的增加，樣本的光化學(xué)淬滅呈增加的趨勢(shì)，3個(gè)品種的斜率從大到小依次為鄭單958、先玉335、浚單20，說明其光反應(yīng)電子傳遞活性垂直分布差異依次減?。秽崋?58的曲線擬合F值顯著大于其他兩個(gè)品種，表明該品種葉片qL_Lss參數(shù)線性分布規(guī)律更強(qiáng)，進(jìn)而說明不同氮含量處理對(duì)該品種葉片光化學(xué)淬滅的差異影響較小，驗(yàn)證了該品種對(duì)土壤氮含量有較強(qiáng)的抗逆性[37]。

a. Fv/Fmb.△F/Fm’c. qL_Lssd. NPQ_Lss

注：相鄰葉片的曼-惠特尼U檢驗(yàn)結(jié)果在圖中標(biāo)出，其中“*”代表≤0.05；“**”代表≤0.001。

Note: The results of the Mann-Whitney U test for adjacent leaves have been marked in the figure, where “*” represents≤0.05; “**” represents≤0.001.

圖6 多因素影響下各葉片熒光參數(shù)分布差異

Fig.6 Differences in the distribution of fluorescence parameters of leaves under the influence of multiple factors

圖7 部分熒光參數(shù)在不同處理?xiàng)l件下的垂直分布規(guī)律

為了進(jìn)一步探究玉米植株在多種處理?xiàng)l件下的垂直分布規(guī)律，以葉片熒光參數(shù)分類植株組別的能力來量化葉片垂直分布規(guī)律性強(qiáng)弱。本試驗(yàn)以同一植株5葉片的熒光參數(shù)為特征，選擇典型機(jī)器學(xué)習(xí)分類算法建立玉米品種、土壤氮含量、土壤水含量的判別模型。模型建立時(shí)采用十折交叉驗(yàn)證的方法進(jìn)行數(shù)據(jù)集劃分以保證數(shù)據(jù)分布的一致性，并避免過擬合的產(chǎn)生。關(guān)鍵熒光參數(shù)在3種分類器下的判別準(zhǔn)確性結(jié)果如表3所示。

表3 關(guān)鍵熒光參數(shù)在3種分類器下的樣本類型判別準(zhǔn)確率

注：SVM、RF、PLS分別為支持向量機(jī)、隨機(jī)森林和偏最小二乘算法。

Note: SVM, RF, PLS are support vector machines, random forest, partial least squares, respectively.

為充分表達(dá)整體判別效果，將3種分類器判別結(jié)果的平均值作為熒光參數(shù)的評(píng)估標(biāo)準(zhǔn)。由判別結(jié)果分析，對(duì)玉米品種、土壤氮含量、土壤水含量判別的最佳熒光參數(shù)分別為Fv/Fm、Fv/Fm和NPQ_Lss，其平均判別準(zhǔn)確率分別為60.00%、71.33%和66.67%，均高于隨機(jī)判別準(zhǔn)確率33.33%、33.33%和50.00%。選擇判別準(zhǔn)確率最高的分類器模型，并分別繪制上述特征熒光參數(shù)的交叉驗(yàn)證混淆矩陣，如圖8所示。

玉米品種的判別分析中，F(xiàn)v/Fm的準(zhǔn)確率相對(duì)較高，表明不同玉米品種PSⅡ最大光能轉(zhuǎn)換效率的垂直分布規(guī)律性最強(qiáng)，其中，以鄭單958的最大光量子效率垂直分布規(guī)律性最為顯著，如圖8a所示。在土壤氮含量的判別分析中，F(xiàn)v/Fm的判別準(zhǔn)確率最高，表明不同土壤氮含量下PSⅡ最大光能轉(zhuǎn)換效率的垂直分布規(guī)律性最強(qiáng)，進(jìn)一步說明土壤氮含量會(huì)對(duì)葉片光能轉(zhuǎn)換效率產(chǎn)生影響。如圖8b所示，由交叉驗(yàn)證混淆矩陣可知，微量氮含量的判別準(zhǔn)確率達(dá)0.94，遠(yuǎn)超其他兩個(gè)水平，可知玉米植株在環(huán)境嚴(yán)重缺少氮元素的情況下其生長(zhǎng)發(fā)育有極高的概率會(huì)受到影響，在環(huán)境少氮的情況下，有50%以上的概率其生長(zhǎng)發(fā)育會(huì)受到影響。在土壤水含量作用下，3種判別方法的效果均不夠理想，其中非光化學(xué)淬滅NPQ_Lss的判別準(zhǔn)確率相對(duì)較高，由圖8c NPQ_Lss的交叉驗(yàn)證混淆矩陣可知，植株有0.88的概率在干旱脅迫后，垂直分布規(guī)律產(chǎn)生變化。

a. 玉米品種偏最小二乘判別中的Fv/Fm參數(shù)a. Fv/Fm in PLS of maize varieties discriminationb. 土壤氮含量隨機(jī)森林判別中的Fv/Fm參數(shù)b. Fv/Fm in RF of soil nitrogen content discriminationc. 土壤水含量支持向量機(jī)判別中的NPQ_Lss參數(shù)c. NPQ_Lss in SVM of soil water content discrimination

由于試驗(yàn)樣本是在多個(gè)脅迫因素綜合作用下培育，可能加劇了不同樣本間的差異，導(dǎo)致在葉片光合特性的垂直分布規(guī)律研究中，樣本的規(guī)律性沒有得到很好地體現(xiàn)。具體表現(xiàn)在：不同土壤氮含量條件下的曲線擬合值不穩(wěn)定，不同土壤水含量條件下的特征擬合結(jié)果2較低，土壤水含量分類判別準(zhǔn)確率較低等。擬在后續(xù)研究中適當(dāng)增加水分脅迫組別和程度，進(jìn)一步揭示水脅迫對(duì)光合特性垂直分布規(guī)律的影響；針對(duì)作物生長(zhǎng)期對(duì)垂直分布規(guī)律具有顯著影響，延長(zhǎng)作物的生長(zhǎng)至10葉期，探究不同生長(zhǎng)階段光合特性垂直分布的變化；擴(kuò)大樣本數(shù)量，減小微氣候或個(gè)體差異產(chǎn)生的影響。

2.3.2 植株葉片垂直光合異質(zhì)性關(guān)鍵葉片研究

為了探究葉片垂直分布中影響樣本類型判別的關(guān)鍵葉片，基于上述分類結(jié)果，選取了品種、土壤氮含量、土壤水含量判別分析中的最優(yōu)熒光參數(shù)進(jìn)行偏最小二乘變量重要性預(yù)測(cè)（PLS-VIP），以進(jìn)一步進(jìn)行特征變量篩選。同時(shí)，以每片葉片的5個(gè)關(guān)鍵熒光參數(shù)（見表2）為特征，使用支持向量機(jī)、隨機(jī)森林、偏最小二乘判別分析3種判別方法來進(jìn)行玉米品種、土壤氮含量、土壤水含量的建模及預(yù)測(cè)。將各位置葉片的平均判別結(jié)果按葉片位置繪制成趨勢(shì)圖，各位置葉片的變量VIP得分和平均判別準(zhǔn)確率結(jié)果如圖9所示。

a. 玉米品種判別a. Varieties differentiationb. 土壤氮含量判別b. Nitrogen content differentiationc. 土壤水含量判別c. Water content differentiation

如圖9a所示，在玉米品種判別分析中，基于單個(gè)熒光參數(shù)（Fv/Fm）、多個(gè)葉片為特征的特征變量選擇和基于多個(gè)熒光參數(shù)、單個(gè)葉片為特征的判別分析表現(xiàn)出相同的趨勢(shì)，且均在葉片2上展現(xiàn)出較高的判別性能。這表明葉片2可以作為玉米品種判別的“特征葉片”。如圖9b所示，在土壤氮含量判別分析中，在以單個(gè)熒光參數(shù)（Fv/Fm）、多個(gè)葉片為特征的特征變量選擇中，葉片1、葉片2判別均產(chǎn)生了有效貢獻(xiàn)（VIP得分大于1），且葉片1的得分較高；在以多個(gè)熒光參數(shù)、單個(gè)葉片為特征的判別分析中，葉片2具有最高的平均判別準(zhǔn)確率。因此，葉片2可以作為土壤氮含量判別的“特征葉片”。如圖9c所示，在土壤水含量判別分析中，基于單個(gè)熒光參數(shù)（NPQ_Lss）、多個(gè)葉片為特征的特征變量選擇和基于多個(gè)熒光參數(shù)、單個(gè)葉片為特征的判別分析表現(xiàn)出相同的趨勢(shì)，且在葉片1、葉片5上展現(xiàn)出較高的判別性能，但葉片1的特征評(píng)分和判別準(zhǔn)確率均略高于葉片5，表明葉片1可以作為土壤水含量判別的“特征葉片”。

3 結(jié) 論

本研究以3種玉米品種在3種氮含量和2種水含量環(huán)境下的苗期植株為研究對(duì)象，利用葉綠素?zé)晒獬上窦夹g(shù)，從葉綠素?zé)晒獯銣缣匦?、葉綠素?zé)晒鈪?shù)特征、葉綠素?zé)晒鈪?shù)垂直分布規(guī)律、垂直分布異質(zhì)性關(guān)鍵葉片4個(gè)方面進(jìn)行了植株葉片光合特性的垂直分布研究。主要有以下結(jié)論：

1）在葉綠素?zé)晒獯銣缣匦陨?，植株形態(tài)學(xué)由下至上的第1和第2片葉片（葉片1和葉片2）不受品種、土壤氮含量的影響，其淬滅特性均有較為顯著差異。鄭單958在不同土壤氮環(huán)境下的熒光淬滅異質(zhì)性小于先玉335和浚單20，擁有更強(qiáng)的耐低氮能力。

2）在葉綠素關(guān)鍵熒光參數(shù)垂直分布上，參數(shù)Fv/Fm表明衰老、正常、新生葉片的光合作用最大光能轉(zhuǎn)換效率依次顯著增大，該特征在葉片內(nèi)部各點(diǎn)的分布上差異性較?。粎?shù)△F/Fm’表明植株形態(tài)學(xué)由下至上的第4和第5片葉片（葉片4和葉片5）的實(shí)際光能轉(zhuǎn)換效率具有顯著優(yōu)勢(shì)；參數(shù)qL_Lss表明光反應(yīng)電子傳遞活性隨垂直高度的增加分3個(gè)等級(jí)逐級(jí)增大；參數(shù)NPQ_Lss表明葉片的非光化學(xué)能量耗散在正常葉片中差異性較小，在衰老葉片中顯著增大。

3）葉綠素?zé)晒鈪?shù)垂直分布規(guī)律上，不同熒光參數(shù)的垂直分布擬合效果均不夠理想。其中，參數(shù)Fv/Fm在不同的土壤氮含量下的垂直分布與二次曲線有較高的擬合特征，隨著土壤氮含量的降低，垂直分布的異質(zhì)性增大；qL_Lss在不同品種間的垂直分布與一次曲線有較高的擬合特征，垂直分布異質(zhì)性表現(xiàn)由大到小依次為鄭單958、先玉335、浚單20，鄭單958的抗逆性較強(qiáng)。支持向量機(jī)、隨機(jī)森林、偏最小二乘判別分析的判別結(jié)果表明，F(xiàn)v/Fm對(duì)不同玉米品種的判別準(zhǔn)確率最高，鄭單958樣本的判別準(zhǔn)確率達(dá)0.82，垂直分布規(guī)律更顯著；Fv/Fm對(duì)不同土壤氮含量的判別準(zhǔn)確率最高，微量土壤氮含量下的樣本判別準(zhǔn)確率達(dá)0.94，垂直分布規(guī)律更顯著；NPQ_Lss對(duì)不同土壤水含量的判別準(zhǔn)確率較高，干旱環(huán)境下的樣本判別準(zhǔn)確率達(dá)0.88，垂直分布規(guī)律性更顯著。

4）在玉米品種和土壤氮含量的分析中，葉片2可以作為區(qū)分玉米品種的“特征葉片”；在土壤水含量的分析中，葉片1可以作為土壤水含量評(píng)估的“特征葉片”。

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Vertical distribution of photosynthetic characteristics of maize leaves at the seedling stage using chlorophyll fluorescence imaging

Xiao Tianpu, Yang Li, Zhang Dongxing, Wang Liangju※, Zhang Tianliang, Du Zhaohui, Li Hongsheng, Xia Xulong

(1.,,100083,; 2.,100083,)

Leaf photosynthetic characteristics of maize seedlings can greatly contribute to the accuracy of phenotype detection. This study aims to determine the vertical distribution of leaf photosynthesis in three maize varieties at the seedling stage (five-leaf stage). The chlorophyll fluorescence imaging was also utilized to clarify the combined influence of different environmental nitrogen and water content. The results were as follows. 1) The leaf 1 and leaf 2 were not affected by the species, nitrogen, and water treatment, in terms of the chlorophyll fluorescence quenching, indicating the more significantly different fluorescence intensities. The unweighted pair-group method with arithmetic means (UPGMA) cluster analysis was conducted to produce the four levels of differentiation with the leaf position as the dominant factor. The clustering of ZD 958 was less heterogeneous than XY 335 and JD 20 under different environmental factors. There were no outstanding clustering characteristics for the nitrogen and water content. 2) In the vertical distribution of key chlorophyll fluorescence parameters, the parameter Fv/Fm indicated that there was a significant increase in the maximum photosynthetic light energy conversion efficiency of senescent, normal, and neonatal leaves in sequence. There was no variation in the feature within the leaves. The parameter △F/Fm' indicated that the high morphological positions were greatly contributed to the actual light energy conversion efficiency of the two leaves. The parameter qL_Lss indicated that the photoreactive electron transfer activity increased in the three steps with the increase of vertical height. The parameter NPQ_Lss indicated that the less variable non-photochemical energy dissipation was found in the normal leaves, but the significant increase in the senescent leaves. 3) A high fitting characteristics with the quadratic function were found in the vertical distribution of the maximal PSⅡ efficiency (Fv/Fm) at the different ambient nitrogen levels. The heterogeneity of the vertical distribution increased, as the ambient nitrogen level decreased. A high fitting characteristics with the primary function were also found in the vertical distribution of the steady-state light-adapted quenching (qL_Lss) at the different varieties. The heterogeneity of the vertical distribution was ranked in the order of the ZD 958 > XY 335 > JD 20. Among them, the ZD 958 was more resistant to the stress. A comparison was made on the Support Vector Machines (SVM), Random Forest (RF), and Partial Least Squares Discriminant Analysis (PLS-DA). The maximal PSⅡ efficiency (Fv/Fm) of ZD 958, the samples under the trace ambient nitrogen content, and the steady-state non-photochemical quenching (NPQ_Lss) of samples under the drought environment were detected with 0.82, 0.94, and 0.88 accuracy, respectively. There was much more significant pattern of vertical distribution compared to other treatments and fluorescence parameters. 4) The plant leaves were numbered from the bottom to the top in the “key leaf” analysis of leaf photosynthetic heterogeneity. The “key leaf” was then selected as the second leaf, second leaf and first leaf for the identification of maize varieties, the environmental nitrogen, and water content assessment in the discriminant analysis of varieties, water, and nitrogen content treatment, respectively.

chlorophyll fluorescence; photosynthesis; maize; vertical distribution

10.11975/j.issn.1002-6819.2022.16.018

S126

A

1002-6819(2022)-16-0162-10

肖天璞，楊麗，張東興，等. 基于葉綠素?zé)晒獬上竦挠衩酌缙谌~片光合特性垂直分布[J]. 農(nóng)業(yè)工程學(xué)報(bào)，2022，38(16)：162-171.doi：10.11975/j.issn.1002-6819.2022.16.018 http://www.tcsae.org

Xiao Tianpu, Yang Li, Zhang Dongxing, Wang Liangju, et al. Vertical distribution of photosynthetic characteristics of maize leaves at the seedling stage using chlorophyll fluorescence imaging[J]. Transactions of the Chinese Society of Agricultural Engineering (Transactions of the CSAE), 2022, 38(16): 162-171. (in Chinese with English abstract) doi：10.11975/j.issn.1002-6819.2022.16.018 http://www.tcsae.org

2022-03-25

2022-08-11

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（32071915）

肖天璞，博士生，研究方向?yàn)閿?shù)字農(nóng)業(yè)信息獲取。Email：xtianpu@163.com

王糧局，博士，副教授，研究方向?yàn)橹参锉硇?、畜禽信息智能感知。Email：wangl@cau.edu.cn