海參多肽微囊制備工藝

喻樊 *，陳倩，蔡伶麗

1.江蘇省腫瘤靶向納米診療材料工程研究中心，鹽城師范學(xué)院（鹽城 224007）；2.鹽城師范學(xué)院藥學(xué)院（鹽城 224051）

海參多肽（sea cucumber peptide）食用安全，易消化吸收，并且具有降血壓、降低膽固醇、抗氧化、抗腫瘤、預(yù)防心腦血管疾病、提高免疫力、促進(jìn)礦物吸收、延緩衰老等生物活性[1-3]，近年來的關(guān)注度越來越高。但是多肽屬于熱敏性的物質(zhì)，陽光、空氣及溫度都會(huì)使其因降解而失活，從而大幅降低其營養(yǎng)及保健價(jià)值。微囊（microcapsule）是近40年應(yīng)用于食品和藥品的載體，具有掩蓋藥物的不良?xì)馕?，提高藥物的穩(wěn)定性及顯著延長藥效、降低毒性、提高活性和生物利用度等優(yōu)點(diǎn)，試驗(yàn)探究海參多肽微囊的制備工藝，旨在提高口服生物利用度及穩(wěn)定性。

1 材料與方法

1.1 主要材料與試劑

木瓜蛋白酶（≥1 000 U/mg，上海藍(lán)季生物）；乳鐵蛋白粉（食品級(jí)，河南萬邦實(shí)業(yè)有限公司）；淡干海參（煙臺(tái)瑞參堂水產(chǎn)有限公司）。

1.2 主要儀器與設(shè)備

紫外光譜（UV-1800，SHIMADZU）；紅外光譜（TENSORⅡ，BRUKER）；冷凍干燥機(jī)（FD-1D-80，北京博醫(yī)康實(shí)驗(yàn)儀器有限公司）；研磨機(jī)（IKA，TUBE-MILL）；實(shí)驗(yàn)型噴霧干燥機(jī)（SP-1500，上海順儀實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司）；紫外分光光度計(jì)（Lambda 950，美國PE公司）；掃描電子顯微鏡（Quanta 200，荷蘭FEI公司）。

1.3 海參多肽的制備

分別取0.2，0.8和1.0 g干海參粉，均加150 mL水，調(diào)pH至8.0。加入木瓜蛋白酶[13]，加酶量12%。將其放入水浴鍋中，于55 ℃恒溫水解8 h。待其酶解完成后，置于沸水浴中10 min，使酶失活。靜置冷卻后，以轉(zhuǎn)速4 000 r/min離心20 min，除去雜質(zhì)后，取其上清液，待水解液濃縮后，進(jìn)行冷凍干燥36 h，從而制得海參多肽。海參多肽得率按式（1）計(jì)算。

1.4 海參多肽微囊的制備

取0.2 g按1.3小節(jié)的方法制備的海參多肽，溶解在50 mL的2%的乳鐵蛋白溶液中，并對(duì)其進(jìn)行磁力攪拌。攪拌完成后對(duì)其進(jìn)行噴霧干燥。設(shè)置噴霧干燥條件：進(jìn)風(fēng)溫度170 ℃、進(jìn)樣速度7.0 mL/min、風(fēng)機(jī)頻率45 Hz。

1.5 單因素試驗(yàn)優(yōu)化微囊噴霧干燥工藝

1.5.1 進(jìn)風(fēng)溫度

在乳鐵蛋白溶液濃度2%、進(jìn)樣速度7.0 mL/min、風(fēng)機(jī)頻率45 Hz條件下，選擇170，180和190 ℃ 3個(gè)不同進(jìn)風(fēng)溫度開展試驗(yàn)，制得微囊。在三目生物顯微鏡下觀察微囊的形態(tài)，對(duì)其進(jìn)行分析比較。

1.5.2 進(jìn)樣速度

在乳鐵蛋白溶液濃度2%、進(jìn)風(fēng)溫度170 ℃、風(fēng)機(jī)頻率45 Hz條件下，選擇7.0，8.0和10.0 mL/min 3個(gè)不同進(jìn)樣速度進(jìn)樣，制得微囊。在三目生物顯微鏡下觀察微囊的形態(tài)，對(duì)其進(jìn)行分析比較。

1.5.3 風(fēng)機(jī)頻率

在乳鐵蛋白溶液濃度2%、進(jìn)風(fēng)溫度170 ℃、進(jìn)樣速度7.0 mL/min條件下，選擇30，45和50 Hz 3個(gè)不同的風(fēng)機(jī)頻率進(jìn)樣，制得微囊。在三目生物顯微鏡下觀察微囊的形態(tài)，對(duì)其進(jìn)行分析比較。

1.6 微囊的顯微觀察

打開電鏡主機(jī)和電腦工作軟件，剪合適大小的導(dǎo)電膠貼于工作臺(tái)上。取適量噴干后的微囊粉末（樣品），置于導(dǎo)電膠上，涂抹均勻，用洗耳球擠壓吹去多余粉末。噴金，將樣品轉(zhuǎn)移到工作室中，關(guān)閉工作艙。抽真空，待真空達(dá)到后，調(diào)整工作距離至10 mm。用掃描電子顯微鏡（SEM）在15 kV調(diào)正樣品位置后，調(diào)整拍照位置和放大倍數(shù)進(jìn)行拍照，形態(tài)好的保存圖像，通過分析圖像觀測微囊形態(tài)[4-6]。

1.7 海參多肽微囊的表征

1.7.1 固體紫外的表征

取適量海參多肽、乳鐵蛋白、空囊、物理混合和海參多肽微囊作為樣品（所有樣品必須為粉末狀以便檢測），用紫外可見分光光度計(jì)在室溫（25 ℃）下對(duì)上述一系列樣品進(jìn)行掃描。采集分辨率4 cm-1在波長200～1 000 nm范圍內(nèi)的紫外吸收光譜，并用記事本保存數(shù)據(jù)，通過Orign 8.0軟件進(jìn)行作圖分析。

1.7.2 紅外的表征

采用KBr壓片法進(jìn)行紅外光譜的測定。打開紅外光譜儀及電腦工作軟件，在制片前用丙酮擦拭研缽及其他工具，在紅外燈光照下，制備溴化鉀空白片和樣品壓片（樣品5種，海參多肽、乳鐵蛋白、空囊、海參多肽與乳鐵蛋白物理混合、載藥囊，與溴化鉀混合比例為1∶100～1∶200）。將壓好的溴化鉀空白片，放入樣品架上，點(diǎn)擊數(shù)據(jù)采集，作為背景譜圖，采集完畢后，將樣品片放入光譜儀在4 000～400 cm-1檢測紅外吸收光譜。并用Excel保存數(shù)據(jù)點(diǎn)表后，運(yùn)用Origin 8.0軟件分析譜圖。

1.7.3 差示掃描量熱法（DSC）的表征

取適量海參多肽、乳鐵蛋白、空囊、物理混合和海參多肽微囊作為樣品，以空白坩堝為參比，以10℃/min的掃描速率升溫，在25～400 ℃掃描[7-8]。

1.7.4 X射線衍射法（XRD）的表征

取適量海參多肽、乳鐵蛋白、空囊、物理混合和海參多肽微囊，作為樣品進(jìn)行XRD分析，檢測的條件為Cu靶，K線；掃描方式：定性，步進(jìn)掃描；管壓40 kV，管流30 mA，掃描步長0.02°，掃描范圍10°～80°，掃描速度2°/min。取干燥后的樣品研磨，壓片，置于X射線粉末衍射儀上，設(shè)置衍射參數(shù)（10°～80°，10°/min）[9]。

2 結(jié)果與分析

2.1 海參多肽的得率

按1.3小節(jié)的方法制備海參多肽，分別水解0.2，0.8和1.0 g海參粉。計(jì)算結(jié)果顯示，得率為69.50%±2.53%。

2.2 單因素試驗(yàn)優(yōu)化微囊噴霧干燥工藝結(jié)果分析

2.2.1 進(jìn)風(fēng)溫度

進(jìn)風(fēng)溫度愈低，會(huì)導(dǎo)致液滴不完全干燥而粘于玻璃壁上，使得粉末收率大幅降低，并且極易堵塞噴嘴，造成噴霧中斷。進(jìn)風(fēng)溫度愈高，會(huì)使液滴表面溶液迅速揮發(fā)，囊內(nèi)外溫度還未平衡完全便形成硬囊殼，包于囊內(nèi)的剩余溶劑會(huì)進(jìn)一步迅速揮發(fā)使得囊殼破裂[10]。隨著溫度升高，微囊變得越來越干癟，有些破裂并且體積越來越小。170 ℃下的微囊形態(tài)較圓整光滑。因此，進(jìn)風(fēng)溫度170 ℃比較適宜。

2.2.2 進(jìn)樣速度

進(jìn)樣的快慢會(huì)影響微囊在干燥室中干燥的過程。7.0 mL/min流速下的微囊形態(tài)較圓整，并且粒徑大小均一。8.0 mL/min下的微囊有干癟，10.0 mL/min條件下的微囊形態(tài)或大或小。因此，進(jìn)樣速度7.0 mL/min比較適宜。

2.2.3 風(fēng)機(jī)頻率

風(fēng)機(jī)頻率的不同會(huì)影響微囊在干燥室中的干燥過程。30 Hz下的微囊干癟且有破裂；45 Hz下的微囊較為圓整，粒徑均一；60 Hz下的微囊干癟，粒徑或大或小。因此，風(fēng)機(jī)頻率45 Hz比較適宜。

2.3 海參多肽微囊的形態(tài)

從圖1（B）中可以看出，制備的海參多肽微囊表面光滑、粒徑大小適宜，無粘連。沒有發(fā)現(xiàn)囊芯物海參多肽，說明海參多肽成功包覆于囊中。在電鏡觀察發(fā)現(xiàn)微囊形態(tài)干癟，粒徑均勻，如圖1（B）所示；由電鏡低分倍率下觀測可以發(fā)現(xiàn)微囊成囊率高破損較少。在電鏡高分倍測可知微囊粒徑適宜，如圖1（C）所示，符合標(biāo)準(zhǔn)。

圖1 SEM圖

2.4 固體紫外譜圖的分析

圖2中從上往下依次是海參多肽、乳鐵蛋白、空囊、物理混合及海參多肽微囊，分別用紫外分光光度計(jì)測得數(shù)據(jù)，以O(shè)rigin 8.0軟件處理得到的疊加紫外圖譜。

從圖2（A）看出，海參多肽在200～220 nm處有強(qiáng)吸收，因?yàn)楹⒍嚯暮泄劝彼?，為芳環(huán)的雙鍵吸收。在230 nm有一個(gè)吸收峰，可能是羥基或氨基。在260～300 nm有弱吸收，可能是生色基團(tuán)羰基。從圖2（B）看出，乳鐵蛋白在340 nm處有特征吸收峰，存在幾個(gè)共軛體系?？漳遥▓D2 C）在220 nm處有一吸收峰是因?yàn)殡逆I引起的，在283 nm處有一吸收峰是由于含酪氨酸殘基和色氨酸殘基。圖2（D）為物理混合，主要體現(xiàn)海參多肽的吸收峰。與空囊相比，圖2（E）的吸收峰不明顯，但能說明海參多肽包覆于囊中。

圖2 固體紫外圖譜

2.5 紅外譜圖的分析

圖3中從上往下依次是海參多肽、乳鐵蛋白、空囊、物理混合及海參多肽微囊，分別用紅外光譜儀測得數(shù)據(jù)，以O(shè)rigin 8.0軟件處理得到的疊加紅外圖譜。

海參多肽中含有大量氨基酸，從圖3（A）可以看出，3 317 cm-1處的吸收峰說明海參多肽中存在—OH基團(tuán)。1 655 cm-1處為C＝O伸縮振動(dòng)，1 401 cm-1處為C—N伸縮振動(dòng)，說明海參多肽中存在酰胺鍵。1 238 cm-1處為N—H彎曲振動(dòng)或C—N伸縮振動(dòng)。1 035 cm-1處為C—O伸縮振動(dòng)，說明海參多肽存在羧基。675 cm-1處為—NH2的面外彎曲振動(dòng)。另外，在2 930 cm-1處為飽和的C—H的伸縮振動(dòng)，1 542 cm-1處的峰位為C＝C雙鍵的伸縮振動(dòng)，表明多肽中存在—C＝C基團(tuán)。

從圖3（B和C）可以看出，乳鐵蛋白在3 422 cm-1處有酰胺基伸縮振動(dòng)產(chǎn)生的特征吸收峰；1 647 cm-1處為基團(tuán)—C＝O特征吸收峰。1 038 cm-1處為C—O伸縮振動(dòng)；1 394 cm-1處的峰位為C—N伸縮振動(dòng)，是乳鐵蛋白的特征吸收峰。另外，1 537 cm-1處的峰位為C＝C雙鍵的伸縮振動(dòng)，說明乳鐵蛋白中存在—C＝C基團(tuán)。

從圖3（D）可以看出，物理混合在3 732 cm-1處有—OH的吸收峰，可能是—OH形成分子內(nèi)氫鍵；3 311 cm-1處為—OH的特征吸收峰，929 cm-1處為飽和的C—H的伸縮振動(dòng)，1 652 cm-1處為—C＝O伸縮振動(dòng)，1 538 cm-1處的峰位為C＝C伸縮振動(dòng)，1 397 cm-1處的峰位為C—N伸縮振動(dòng)，1 036 cm-1處為C—O伸縮振動(dòng)，在指紋區(qū)676 cm-1也有一處吸收峰。分析可知，物理混合主要體現(xiàn)海參多肽的特征吸收峰。

觀察海參多肽微囊紅外圖譜，從圖3（E）分析出，2 930 cm-1處為飽和的C—H伸縮振動(dòng)，1 655 cm-1處為C＝O伸縮振動(dòng)，在1 401 cm-1處為C—N伸縮振動(dòng)為伯酰胺基的特征吸收峰。在指紋區(qū)有2個(gè)吸收峰，但在3 317 cm-1左右沒有吸收。另外，在1 035 cm-1處為C—O伸縮振動(dòng)，1 542 cm-1處為C＝C雙鍵伸縮振動(dòng)。分析可知，海參多肽被包進(jìn)乳鐵蛋白中，微囊制備成功。

圖3 紅外圖譜

2.6 X射線衍射法（XRD）的分析

圖4中從上往下依次是海參多肽、乳鐵蛋白、空囊、物理混合及海參多肽微囊，分別用XRD測得數(shù)據(jù)，以O(shè)rigin 8.0軟件處理得到的疊加XRD圖譜。

圖4 XRD圖譜

圖4（A）中海參多肽在2θ=23°處存在特征衍射峰。乳鐵蛋白在圖4（B）中出現(xiàn)2θ=19°，這是乳鐵蛋白的特征峰。圖4（D）為海參多肽與乳鐵蛋白的物理混合，可以看出衍射峰強(qiáng)度減弱，這是因?yàn)楹⒍嚯呐c乳鐵蛋白相互作用導(dǎo)致。圖4（E）為海參多肽微囊，可以看出在2θ=19°處存在衍射峰，海參多肽的特征峰消失，說明海參多肽被成功包裹在微囊中。

3 結(jié)論

試驗(yàn)采用噴霧干燥法制備海參多肽微囊，操作簡便，便于控制，不需要有機(jī)溶劑，適合工業(yè)化的生產(chǎn)[11-13]。通過單因素試驗(yàn)確定微囊的最佳噴霧干燥工藝：進(jìn)風(fēng)溫度170 ℃、進(jìn)樣速度7.0 mL/min、風(fēng)機(jī)頻率45 Hz。通過掃描電鏡觀察到此工藝下制得的微囊表面光滑、粒徑均一、無粘連現(xiàn)象。通過固體紫外、紅外和XRD對(duì)海參多肽、乳鐵蛋白、微囊等進(jìn)行一系列表征，分析得出海參多肽被包于微囊內(nèi)，并且以無定型形式存在。通過對(duì)噴霧干燥法制備海參多肽微囊的初略研究，表明該工藝具有一次成囊、迅速、較適合工業(yè)化生產(chǎn)的特點(diǎn)。