血液中鳥氨酸在乳腺癌及乳腺良性腫瘤患者中表達差異及臨床意義研究

種一然，李錦成，陶維

（錦州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院1.外科學(xué)；2.乳腺外科，遼寧 錦州 121000）

乳腺癌仍然是世界范圍內(nèi)女性最常見的惡性腫瘤，也是主要的公共衛(wèi)生問題。在美國，2012-2016 年乳腺癌的年齡標(biāo)準(zhǔn)化發(fā)病率為每10 萬女性中有126.8 例；2013-2017 年乳腺癌年齡標(biāo)準(zhǔn)化死亡率為每10 萬女性中20.3 人［1］。與美國相比，中國乳腺癌的發(fā)病率相對較低，其年齡標(biāo)準(zhǔn)化發(fā)病率約為29/10 萬名女性。2011 年，中國女性因乳腺癌導(dǎo)致的年齡標(biāo)準(zhǔn)化死亡率為每10 萬人6.6人［2］。雖然中國乳腺癌發(fā)病率較低，但預(yù)計2021年35～69 歲女性中乳腺癌年齡標(biāo)準(zhǔn)化發(fā)病率將提高至每10 萬人85 人［3］。隨著乳腺癌發(fā)病率的增加，由乳腺癌引起的年齡標(biāo)準(zhǔn)化死亡率也可能會出現(xiàn)相同的趨勢［4］。為了更有效地預(yù)防和治療乳腺癌，尋找新的乳腺癌風(fēng)險評估和治療代謝物是非常有必要的。鳥氨酸是一種非必需氨基酸；它參與許多代謝途徑［5］。體內(nèi)外數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)，鳥氨酸及其相關(guān)代謝產(chǎn)物（即氨和聚乙烯甲胺）在癌細胞活動和腫瘤發(fā)生中起作用［5-8］。然而，目前還不清楚鳥氨酸是否與人類乳腺癌的發(fā)生有關(guān)?？紤]到乳腺癌的嚴(yán)重后果，了解這種關(guān)系可能有助于改善目前的乳腺癌風(fēng)險評估并制定新的治療策略。因此，本實驗研究了鳥氨酸水平與女性乳腺癌之間的關(guān)系。

1 資料與對象

1.1 研究設(shè)定和研究對象

本研究的所有參與者均來自于2017 至2018年間于錦州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院住院患者，共計407 例。本研究給參與者根據(jù)以下條件分成了實驗組和對照組的病例：①女性；②有效的血液鳥氨酸分析；③明確病理診斷為乳腺癌或非乳腺癌；④有完整真實有效的因變量數(shù)據(jù)（如年齡、體重、身高、月經(jīng)初潮年齡、高血壓病史、Ⅱ型糖尿病史、既往癌癥史、吸煙史、飲酒史、癌癥家族史和絕經(jīng)狀態(tài)）。該研究得到了錦州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院倫理審查委員會的批準(zhǔn)。保證了本研究所有參與者的知情權(quán)，并取得了參與者的書面知情同意。

1.2 病例和控制的評估

本研究根據(jù)病理科提供的術(shù)后病理檢查確定所有女性患者為乳腺癌病例或者是乳腺良性腫瘤病例。乳腺癌診斷的分期是由美國腫瘤聯(lián)合委員會制定的腫瘤轉(zhuǎn)移（TNM）分期法［9］。乳腺癌腫瘤組織學(xué)分級根據(jù)中國最新乳腺癌指南進行分級［10］。乳腺癌的分子分型包括：HER-2 擴增型、Luminal A、Luminal B 及三陰型［10］。同時這些病例也通過既定公認(rèn)的方法進行病理檢查、臨床檢查、病史詢問和其他檢查（即血液常規(guī)及傳染病檢查）［11］。在確定病例組和對照組之后，分別按年齡將實驗組與對照組進行匹配（±1 年），比例為1∶1。

1.3 因變量的確定

這項研究的因變量包括人口統(tǒng)計學(xué)方面因素［身體質(zhì)量指數(shù)（BMI）］、生活方式方面因素（吸煙和飲酒情況）、既往史（月經(jīng)初潮年齡、高血壓史、是否為絕經(jīng)狀態(tài)、Ⅱ型糖尿病史，自身既往腫瘤史和家族癌癥史）。BMI 中身高體重的測定方法：參與者穿著輕便的衣物光著腳站在電子秤上測量體重（精確到0.1 kg）。測量身高利用的是壁掛式視距儀（精確到0.1 cm）。BMI 的計算公式為：體重（kg）/高度的平方（m2）。按照最新指南公認(rèn)的高血壓定義為收縮壓≥140 mmHg（1 mmHg=0.133 kPa）或舒張壓≥90 mmHg。根據(jù)公認(rèn)的方法評估Ⅱ型糖尿病的診斷，即美國糖尿病協(xié)會更新的糖尿病患者醫(yī)療標(biāo)準(zhǔn)［12］。從臨床病歷記錄中提取月經(jīng)初潮年齡、既往癌癥史、吸煙史、飲酒史、癌癥家族史和是否處于絕經(jīng)狀態(tài)。

1.4 血液收集及處理

在患者進行任何臨床操作及治療前，用真空吸塵管收集實驗組和對照組的空腹血樣（空腹時間＞8 h）。利用干燥的血液濾紙，從收集的空腹血液樣本中提取干燥的血液斑點樣本。全部干燥的血斑樣本在-80℃保留，直到檢測完成。

1.5 鳥氨酸測定

鳥氨酸水平的測量是基于既定的方法［13］。在圓形濾紙片上用打孔器打出直徑為3 mm 的血片，之后將該濾紙片置于96 孔的過濾板中，每個孔中加入含內(nèi)標(biāo)的無水甲醇，再將孔板置于振蕩器內(nèi)，于室溫下振蕩20 min，用孔板離心機Rotor3以2 000 r/min×2 min 的程序進行離心，上層樣品板中的提取液通過濾膜過濾并收集于下層樣品板中。離心后將基層樣品板于氮氣中吹干。吹干后，每個孔中都加入衍生劑并密封，之后于65°C 的環(huán)境下孵育15 min 后進行衍生化。衍生后的溶液，在氮氣中吹干，流動相復(fù)溶。最后，采用液相色譜：LC20A（Shimadzu）和質(zhì)譜：SCIEX API 3200MD（AB）這二種儀器進行檢測，該平臺能夠靈敏地檢測生物分子［14］。

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法

研究采用SPSS24.0 和R 基礎(chǔ)統(tǒng)計軟件（版本3.5.3）分析數(shù)據(jù)。計數(shù)資料采用百分率（%）表示，組間比較運用χ2檢驗或Fisher 精確概率法。對計量資料進行正態(tài)性檢驗，符合正態(tài)分布的采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，組間比較采用兩獨立樣本t檢驗；不符合正態(tài)分布的計量資料以中位數(shù)（四分位間距）［M（P25,P75）］表示，采用Mann-WhitneyU檢驗。采用逐步法進行二元Logistic 回歸。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

本研究使用非條件Logistic 回歸分析來估計比值比（ORs）和相應(yīng)的95%置信區(qū)間（CIs），以確定鳥氨酸水平增加1 個標(biāo)準(zhǔn)差（SD）與乳腺癌之間的關(guān)系。鳥氨酸水平被轉(zhuǎn)換成對數(shù)模式來近似正態(tài)分布。最后的模型根據(jù)個人腫瘤史進行了調(diào)整。還考慮了納入最終模型的下列因變量：BMI、高血壓史、Ⅱ型糖尿病史、絕經(jīng)狀態(tài)、吸煙史、月經(jīng)初潮年齡、飲酒史與家族癌癥史。但是，在乳腺癌的雙變量分析中，均未達到P＜0.10 的標(biāo)準(zhǔn)，因此在最終的調(diào)整中被排除在外。本研究還使用了非條件Logistic 回歸分析模型來測試不同水平的鳥氨酸（四分位數(shù)）與乳腺癌之間的關(guān)系。根據(jù)鳥氨酸分布分為四分位數(shù)（百分比25、50 和75）。最后模型又根據(jù)自身腫瘤史進行了調(diào)整。

在非條件Logistic 回歸分析模型中，按照腫瘤臨床分期和腫瘤組織學(xué)分級進行亞組分析，以確定鳥氨酸（每增加1 個SD）和乳腺癌之間的關(guān)系是否隨臨床分期和腫瘤分級而改變。采用多元線性回歸模型檢驗病例間臨床分期與腫瘤組織學(xué)分級的相關(guān)性趨勢，其中以鳥氨酸的連續(xù)測量為自變量，臨床分期與腫瘤組織學(xué)分級為因變量。為了確定乳腺癌的分子亞型是否影響這種關(guān)聯(lián)，進行了非條件多變量Logistic 回歸分析，以估計鳥氨酸水平（每增加1 個SD）與乳腺癌分子亞型之間的關(guān)聯(lián)。用非條件Logistic 回歸分析模型中病例間的相互作用項［分子亞型*鳥氨酸水平（每增加1個SD）］來測試分子亞型與鳥氨酸水平之間的相互作用P。

2 結(jié)果

這項研究包括407 例乳腺癌病例和407 例乳腺良性腫瘤病例，共814 例病例進行了對比。對照組大多數(shù)（95.0%）患者為良性乳腺腫塊，其余為乳腺炎患者（3.1%），副乳腺良性腫塊（0.7%），乳腺增生（0.5%），腋窩良性腫塊（0.3%），胸壁良性腫塊（0.3%）或乳腺脂肪瘤（0.1%）。

實驗組平均年齡為（48.3±7.6）歲，對照組平均年齡為（48.4±7.7）歲。實驗組個人腫瘤史的患者比例高于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。實驗組年齡、BMI、高血壓史、Ⅱ型糖尿病史、絕經(jīng)狀態(tài)、吸煙史、月經(jīng)初潮年齡、飲酒史與家族癌癥史等與對照組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。見表1。鳥氨酸四分位數(shù)與BMI 呈負相關(guān)，本實驗研究的其他特征（年齡、初潮年齡、高血壓史、Ⅱ型糖尿病史、癌癥病史、吸煙史、飲酒史、癌癥家族史和絕經(jīng)狀態(tài)）與鳥氨酸水平無相關(guān)性。

表1 乳腺癌病例和乳腺良性腫瘤病例對照的特點

鳥氨酸水平每增加一個SD，乳腺癌的發(fā)病率就降低一個比率（=0.76,95%CI：0.65～0.89）。見表2。在調(diào)整絕經(jīng)后狀態(tài)后，顯著的負相關(guān)仍然存在（=0.76,95%CI：0.65～0.89），隨著每SD鳥氨酸水平的增加，乳腺癌風(fēng)險降低27%。當(dāng)鳥氨酸水平被劃分為四分位數(shù)時，與鳥氨酸水平低四分位數(shù)的女性相比，高鳥氨酸水平四分位數(shù)的女性患乳腺癌的風(fēng)險也更低（調(diào)整后=0.76,95%CI：0.51～1.13）。鳥氨酸水平與乳腺癌之間的關(guān)系和腫瘤臨床分期及腫瘤組織學(xué)分級無關(guān)（P＞0.05），見表3、表4。乳腺癌分子亞型間無相互作用（P=0.93），見表5。

表2 鳥氨酸與乳腺癌相關(guān)性的多變量Logistic 回歸

表3 鳥氨酸水平與腫瘤臨床分期關(guān)系

表4 鳥氨酸水平與腫瘤組織學(xué)分級關(guān)系

表5 鳥氨酸水平與腫瘤分子分型關(guān)系

3 結(jié)論

鳥氨酸程度越高，女性患乳腺癌的風(fēng)險就越低。鳥氨酸含量高是乳腺癌的潛在保護因素。通過本研究可以發(fā)現(xiàn)，鳥氨酸水平與女性乳腺癌之間存在顯著的負相關(guān)關(guān)系，這可能會對乳腺癌評估和治療方法產(chǎn)生重大的公共衛(wèi)生影響。未來的研究將證實本實驗的結(jié)果。

在這項年齡匹配的女性病例對照研究中，觀察到鳥氨酸水平與乳腺癌之間在統(tǒng)計學(xué)上呈顯著的負相關(guān)。這種關(guān)聯(lián)不隨臨床分期和腫瘤分級而改變，也不受分子亞型的影響?？紤]到這是第一次人類研究，表明鳥氨酸水平與乳腺癌之間的潛在保護關(guān)系，未來的流行病學(xué)研究將證實這個實驗的研究結(jié)果。

鳥氨酸與乳腺癌之間關(guān)系的潛在機制仍有爭議。一方面，鳥氨酸水平升高可以通過尿素循環(huán)減少氨的生成及其相關(guān)的氧化應(yīng)激反應(yīng)［15-16］，從而起到保護作用。因為較低的氧化應(yīng)激水平與有較低的乳腺癌風(fēng)險［17］。另一方面，鳥氨酸是促進癌癥進展的鳥氨酸脫羧酶（ODC）生產(chǎn)多胺的底物［5，7，18-19］。雖然鳥氨酸參與腫瘤發(fā)展的生物學(xué)機制是相互矛盾的，但根據(jù)本實驗的發(fā)現(xiàn)，前者可能是主要的作用機制。

本研究具有一定的臨床和公共衛(wèi)生意義。目前，左旋鳥氨酸及其與左旋天冬氨酸的混合物是降低急性肝功能衰竭和肝性腦病患者氨水平相對安全有效的藥物［15-16，20-21］。本研究表明鳥氨酸對乳腺癌患者的治療可能有額外的療效。此外，如果此發(fā)現(xiàn)可以通過前瞻性研究得到重復(fù)，那么鳥氨酸水平可能成為未來預(yù)測乳腺癌事件的一個獨立因素。乳腺癌仍然是女性的一個主要公共衛(wèi)生問題。然而，只有少數(shù)乳腺癌的危險因素可以有效地預(yù)防和并以此治療乳腺癌。此研究結(jié)果對于乳腺癌的治療和預(yù)測提供了一個潛在的新目標(biāo)。

在解釋此實驗的結(jié)果之前，應(yīng)該認(rèn)識到幾個局限性。首先，由于這是一項病例對照研究，無法對鳥氨酸水平與乳腺癌發(fā)病率之間的關(guān)系做出因果推斷。其次，一些乳腺癌的危險因素，包括體育活動，激素替代療法，己烯雌酚的使用，是不控制的。第三，本研究的大多數(shù)對照組（95%）為良性乳腺腫塊。使用健康的對照組是否會產(chǎn)生相似的結(jié)果還不清楚。最后，因為這項研究是基于醫(yī)院的數(shù)據(jù)進行的，它應(yīng)該被謹(jǐn)慎的看待，因為此實驗的發(fā)現(xiàn)可能不能推廣到一般人群。

總之，高水平的鳥氨酸是乳腺癌的一個潛在的保護因素。人們對鳥氨酸水平與女性乳腺癌之間關(guān)系的認(rèn)識得到了拓展。