阿爾茨海默病大鼠模型建立與磁共振成像*

尹匯敏，郭宏，趙文靜，韓曉楠，金淼，崔紅升，程浩，王玥，孟鑫

（1.齊齊哈爾醫(yī)學院醫(yī)學技術(shù)學院，黑龍江 齊齊哈爾 161006；2.齊齊哈爾市第一醫(yī)院 放射科，黑龍江 齊齊哈爾 161006；3.齊齊哈爾醫(yī)學院附屬第三醫(yī)院 磁共振科，黑龍江 齊齊哈爾 161006；4.齊齊哈爾醫(yī)學院附屬第三醫(yī)院 醫(yī)務(wù)科，黑龍江 齊齊哈爾 161006）

阿爾茨海默病（Alzheimer's disease,AD）是一種以隱匿起病和進行性惡化為特征的神經(jīng)變性病，臨床表現(xiàn)主要為認知障礙、精神行為異常和社會生活功能減退［1-2］，AD 病程長、不可逆且目前臨床無特效藥物，早期診斷并進行臨床干預可有效延緩其進展［3］，提高患者生存質(zhì)量，減輕家庭及社會經(jīng)濟負擔。目前研究中AD 僅能通過組織病理明確診斷（即β-淀粉樣蛋白沉積），缺乏活體診斷其特異性的生物學工具［4］。大鼠模型能夠復制出AD 的部分神經(jīng)病理特征如神經(jīng)纖維的變性和淀粉樣蛋白的沉積。往期文獻研究結(jié)果表明采用D-半乳糖聯(lián)合三氯化鋁建造的大鼠模型效果顯著，該建模方法不僅可以模擬出AD 相關(guān)的行為學改變，而且亦可出現(xiàn)類似人類AD 的神經(jīng)病理學及病理生理學改變。此外，與其它動物模型相比該模型制作方法簡單、周期短且無創(chuàng)，有利于進一步的動物實驗研究［5］。

磁共振（magnetic resonance imaging,MRI）可在無創(chuàng)條件下對活體大腦進行結(jié)構(gòu)描述和體積測量［6-7］。最新高場強MRI 如7.0 T 小動物磁共振、9.4T 高場強高分辨率離體型磁共振也開始應(yīng)用于AD 大鼠模型掃描［8-9］。最新研究發(fā)現(xiàn)：AD 大鼠建模完成后可進行氫質(zhì)子磁共振波譜研究（proton magnetic resonance spectroscopy,1H-MRS），利用1H-MRS 可檢測N-乙酰天門冬氨酸（N-acetyl aspartic acid,NAA）/肌酸（creatine,Cr）改變，有助于AD 早期臨床診斷［4］；APP/PS1 轉(zhuǎn)基因AD 小鼠在磁共振彌散張量成像（diffusion tensor imaging,DTI）中顯示其大腦白質(zhì)腦區(qū)胼胝體、扣帶回、外囊等處出現(xiàn)各向異性分數(shù)（fractional anisotropy,FA）值的變化，反映了水分子在神經(jīng)纖維中向不同方向擴散的差異性，從而達到活體內(nèi)檢測大腦白質(zhì)纖維束完整性，分析AD 早期對大腦白質(zhì)的損害程度［10-11］；5XFAD 小鼠模型進行功能磁共振成像（functional magnetic resonance imaging,fMRI）以雙側(cè)海馬為感興趣區(qū)通過MateLab 平臺中SPM 軟件結(jié)合VBM 軟件分析發(fā)現(xiàn)在5XFAD 小鼠早期即存在海馬區(qū)組織微結(jié)構(gòu)完整性受損，背側(cè)海馬區(qū)組織微結(jié)構(gòu)完整性損害與其空間認知功能狀態(tài)相關(guān)［12］。由于多參數(shù)、多方位、多序列斷層成像的巨大優(yōu)勢以及功能成像的高速發(fā)展，磁共振已經(jīng)成為動物實驗研究中不可或缺的工具之一。但由于高場強小動物磁共振成本極高，大多科研院校及科研基地不具備此科研設(shè)備條件，設(shè)備的緊缺不利于AD 動物實驗的進一步研究發(fā)展。因此，本實驗擬通過D-半乳糖聯(lián)合三氯化鋁制備AD 大鼠模型，進行宏觀特征采集檢測大鼠行為表現(xiàn)，糖水偏好實驗、水迷宮行為學檢測確認建模結(jié)果，篩選出建模合格的大鼠與對照組大鼠同時進行顱腦磁共振掃描，經(jīng)后臺三維重建測量分析確定建模后大鼠與對照組大鼠腦結(jié)構(gòu)與腦體積差異，比較GE 3.0T 磁共振小動物線圈顱腦序列；Philips 1.5 T 磁共振Micro-47 mm 線圈Wrist 序列掃描的圖像質(zhì)量，提出適用于AD 大鼠顱腦掃描的醫(yī)用磁共振儀器和配套的線圈序列，為AD 大鼠的監(jiān)測診斷提供影像參考依據(jù)，為AD 動物實驗的進一步發(fā)展提供有力的輔助診斷工具。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

實驗動物為十二周齡SD 大鼠24 只（雌雄各半），雄鼠質(zhì)量為（190±10）g，雌鼠質(zhì)量為（170±10）g，購自齊齊哈爾醫(yī)學院附屬第一醫(yī)院動物中心實驗室。所有大鼠均經(jīng)過Morris 水迷宮篩選，運動力表現(xiàn)靈活、反應(yīng)迅速。飼養(yǎng)溫度23℃，濕度30%～40%，光照量為12 小時黑白交替，通風良好，實驗組、對照組統(tǒng)一飼養(yǎng)于齊齊哈爾醫(yī)學院附屬第三醫(yī)院動物中心實驗室。本實驗所有操作均符合動物保護與使用實驗操作規(guī)范，實驗人員持有哈爾濱市科學技術(shù)局頒發(fā)的實驗動物從業(yè)人員培訓合格證。D-半乳糖（D810318 180.16MW）三氯化鋁（A800394 133.34MW）購自上海麥克林生化科技有限公司；水合氯醛（CAS NO：302-17-0）購自福晨（天津）化學試劑有限公司；大鼠維持飼養(yǎng)飼料購自沈陽茂華生物科技有限公司；大鼠電子天平稱購自中科生命高精度測量稱；一級蔗糖購自南寧糖業(yè)股份有限公司明陽糖廠。

1.2 儀器與設(shè)備

鼠博士Morris 水迷宮：型號RD1101-MWM，中國上海移數(shù)信息科技有限公司；Philips 1.5 T 磁共振Micro 47 mm 顯微線圈，荷蘭飛利浦公司；GE 3.0 T 磁共振小動物線圈，型號Magtron Model WK602，美國GE 公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 大鼠建模 所有大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1 周后，對照組和實驗組隨機分配各12 只（雌雄各半）。實驗組采用D-半乳糖聯(lián)合三氯化鋁連續(xù)8 周建模，建模方式為：上午腹腔注射生理鹽水配制的D-半乳糖溶液650 mg/（kg·d），下午灌胃生理鹽水配制的三氯化鋁550 mg/（kg·d）；對照組：上午腹腔注射等量生理鹽水，下午灌胃等量生理鹽水［5］，實驗組和對照組單鼠單籠同等條件飼養(yǎng)。氯化鋁活性較高，遇潮濕空氣易發(fā)生放熱反應(yīng)，釋放大量煙和熱，具有腐蝕性，實驗過程中應(yīng)做好個體防護。

1.3.2 糖水偏好實驗 造模8 周結(jié)束后所有大鼠正常飼養(yǎng)一天，測量大鼠體重并記錄。單籠飼養(yǎng)大鼠進行糖水偏好實驗：糖水（2%蔗糖）純凈水雙瓶供飲實驗組和對照組大鼠，由大鼠自由飲用且正常飼養(yǎng)不禁食，飲用24 小時后計算大鼠24小時內(nèi)的糖水、純凈水消耗量，計算糖水偏好百分比=糖水消耗量/（糖水+純水）×100%，實驗結(jié)束后恢復正常飲水等待下一步實驗。

1.3.3 記憶行為學檢測（Morris 水迷宮）糖水偏好實驗結(jié)束一天后所有大鼠進行水迷宮記憶行為學測試，實驗時間為一周。實驗前將水池劃分為四個象限：東北、東南、西北、西南，并將透明站臺放置于西南象限，水應(yīng)沒過站臺。并開啟水迷宮自帶加熱恒溫器使水保持恒溫（25±1）℃，厚簾子遮擋水池使水面無光影，并在固定位置放置黑色三角形參照物，實驗中用可食用黑色染料將水染成純黑，突出白色大鼠輪廓，并在每次實驗后將大鼠擦干，防止體溫降低大鼠產(chǎn)生應(yīng)激性改變。實驗全程密切關(guān)注監(jiān)視器，防止大鼠體力不支導致溺水。

隱蔽站臺試驗：第1 天適應(yīng)性訓練，引導大鼠尋找水下隱藏站臺，訓練時間不計入實驗結(jié)果，引導大鼠找到站臺即結(jié)束訓練。每天實驗開始時將大鼠從任意象限一面池壁放入水中，設(shè)定尋找站臺時間限制為60～90 s，直至爬上隱藏站臺，記錄潛伏期時間（共六天，每天訓練四次），若大鼠60 s 內(nèi)未找到站臺，可手動引導其爬上站臺并停留10～20 s。

空間探索試驗：上一實驗步驟結(jié)束24 h 后撤掉設(shè)置的站臺，隨后記錄大鼠120 s 內(nèi)的游泳路徑，統(tǒng)計其在原隱藏站臺象限范圍內(nèi)的停留時間和穿越原站臺象限次數(shù)。

1.3.4 磁共振成像 水迷宮檢測結(jié)束1 天后分別使用Philips 1.5 T 磁共振Micro-47 mm 線圈Wrist序列、GE 3.0 T 磁共振頭頸部線圈垂體序列和動物線圈顱腦序列掃描所有大鼠，大鼠經(jīng)5%水合氯醛麻醉呼吸平穩(wěn)后俯臥位頭先進，行定位像掃描，調(diào)整至合適位置后行冠狀、矢狀、軸位T1WI、T2WI掃描。T1WI 參數(shù)為TE（echo time,TE）=90 ms，TR（repetition time）=1 000 ms，Averages=4，Slice Thickness=0.5 mm，F(xiàn)ield of view=120 mm×120 mm，gap=0.4 mm，matrix=256×256。T2 加權(quán)像參數(shù)為TR=5 000 ms，TE=36 ms，Averages=4，Slice Thickness=0.5 mm，F(xiàn)ield of view=120 mm×120 mm，gap=0.4 mm，matrix=256×256。數(shù)據(jù)經(jīng)后臺PACS系統(tǒng)上傳至Philips Medical Systems 工作站軟件，采用盲法由兩位MRI 主任醫(yī)師手動勾勒相關(guān)腦區(qū)并進行分析比較大鼠腦結(jié)構(gòu)改變情況，同時應(yīng)用3D 重建成像測量大鼠腦體積。

1.4 統(tǒng)計學方法

采用上海移數(shù)公司大鼠行為學分析軟件分析并記錄各行為學指標，實驗數(shù)據(jù)用SPSS 23.0 軟件（SPSS,Inc,Chicago,IL,USA）和R3.3.0（http：//www.r-project.org/）分析，計量資料用均數(shù)±標準差（）表示，正態(tài)分布的水迷宮數(shù)據(jù)采用雙因素方差分析，非正態(tài)分布采用秩和檢驗來比較組間差異，P＜0.05 差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 糖水偏好實驗結(jié)果

宏觀觀察發(fā)現(xiàn)實驗組大鼠毛發(fā)枯槁、畏光、活動力差，對照組一切正常。對照實驗開始前兩組大鼠稱重結(jié)果：雄鼠質(zhì)量為（190±10）g，雌鼠質(zhì)量為（170±10）g；建模結(jié)束后兩組大鼠稱重結(jié)果：對照組雄性：（306±8.72）g、雌性：（262±11.60）g，實驗組雄性：（270±7.65）g、雌性：（235±8.26）g，實驗組大鼠體重下降，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；糖水偏好百分比：對照組（82±5.03）%，實驗組為（63±12.67）%，兩組差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。

2.2 水迷宮測試結(jié)果

第1 天適應(yīng)性訓練不計入結(jié)果中，較之對照組，實驗組大鼠潛伏時間長，第6 天潛伏期實驗組為（15±14.3）s，對照組為（13±11.3）s，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），見表1；撤去隱藏站臺以后停留原站臺象限內(nèi)時間和穿越原站臺次數(shù)見表2。

表1 兩組潛伏期比較（n=12,,s）

表1 兩組潛伏期比較（n=12,,s）

注：?與對照組比較，P＜0.05。

表2 兩組停留原站臺時間與穿越次數(shù)比較（）

表2 兩組停留原站臺時間與穿越次數(shù)比較（）

注：?與對照組比較，P＜0.05。

2.3 磁共振掃描結(jié)果

比較不同磁場線圈序列掃描結(jié)果：GE 3.0 T磁共振動物線圈、Philips 1.5 T 磁共振Micro-47 mm 線圈Wrist 序列顱腦結(jié)構(gòu)清晰分辨率高。相較于對照組，實驗組大鼠腦溝明顯增寬，腦體積減低，尤以海馬腦體積減低為主，實驗組大鼠海馬頭部間距（ineteruncal distance,IUD）增寬為（32±2.36）mm，而對照組大鼠IUD 為（28±1.92）mm。Philips 1.5 T 磁共振Micro-47 mm 線圈Wrist 序列掃描對照組大鼠冠狀位橫軸位磁共振像見圖1，GE 3.0 T 小動物線圈Magtron Model WK602 顱腦序列掃描實驗組大鼠冠狀位矢狀位橫軸位磁共振像見圖2，Philips 1.5 T Micro-47mm 線圈，GE 3.0 T Magtron Model WK602 小動物線圈見圖3。

圖1 對照組大鼠冠狀位橫軸位磁共振像

圖2 實驗組大鼠冠狀位矢狀位橫軸位磁共振像

圖3 兩組大鼠磁共振掃描所用線圈

3 討論

AD 是進行性認知功能障礙中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性病變［13］，其早期確診率低且無特效治療藥物。據(jù)流行病學統(tǒng)計顯示，AD 逐漸成為威脅老年人認知及社會生活功能減退的主要病因之一［14］。其病因至今仍未明確，最受認可的β 淀粉樣蛋白（Aβ）級聯(lián)假說目前也出現(xiàn)了較大爭議［15-16］。確認病因并早期診斷AD 進行臨床干預有利于提高患者生存質(zhì)量，減輕社會經(jīng)濟負擔。動物模型可模擬患者的部分病理特征，為AD 的研究和發(fā)展提供了理想的模型。AD 模型的建立目前有較多方式和途徑，主要包括自然衰老型：24 月齡大鼠與臨床患者各種病理特征相似，但成本過高且衰老大鼠免疫力過低易導致死亡；轉(zhuǎn)基因動物模型：APP、PS1、ApoE 等轉(zhuǎn)基因動物模型認知功能障礙明顯，蛋白沉積不明顯；化學損傷動物模型：Aβ1-42 海馬區(qū)注射［17］，建模時間短且效果顯著，是近年來模型建立的主要手段，但由于該方法技術(shù)要求高，容易對腦組織造成不確定損傷，導致顱內(nèi)血腫形成等缺點不利于磁共振圖像診斷。因此本研究選擇D-半乳糖聯(lián)合三氯化鋁進行AD 大鼠建模，D-半乳糖聯(lián)合三氯化鋁造模方法具有時間短、價格低、結(jié)果可靠穩(wěn)定等優(yōu)點。D-半乳糖可誘導體內(nèi)脂質(zhì)氧化應(yīng)激、非酶糖基化反應(yīng)產(chǎn)生自由基，使細胞代謝功能下降促使神經(jīng)衰老［17-18］，鋁濃度的升高促使大腦內(nèi)β-淀粉樣蛋白沉積、神經(jīng)元變性凋亡等與AD 的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，使動物發(fā)生學習記憶障礙的病理改變［19-22］。本研究中大鼠建模完成后經(jīng)宏觀觀察發(fā)現(xiàn)實驗組大鼠毛發(fā)枯槁、畏光、活動力差、體重減輕，糖水偏好實驗、水迷宮行為學檢測分析與對照組比較其差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），證明D-半乳糖聯(lián)合三氯化鋁是有效的建模途徑。

磁共振成像因其無創(chuàng)、軟組織分辨率高等絕對優(yōu)勢逐漸成為AD 早期診斷標記的有利工具，最新高場強MRI 如7.0 T 小動物磁共振、9.4 T 高場強高分辨率離體型磁共振也逐漸開始應(yīng)用于AD 大鼠模型掃描［8-9］。但高場強小動物磁共振價格昂貴，大多科研基地不具備此科研設(shè)備條件，不利于AD 動物實驗的進一步研究發(fā)展。本研究經(jīng)過前期多次預實驗，比較了AD 大鼠模型在GE 3.0 T小動物線圈顱腦序列、Philips 1.5 T 磁共振Micro-47 mm 線圈Wrist 序列掃描的多層圖像發(fā)現(xiàn)Philips 1.5 T 磁共振Micro-47 mm 線圈Wrist 序列掃描圖像結(jié)構(gòu)清晰，易于分辨，可用于AD 大鼠模型診斷，可為動物實驗提供更簡易便捷的成像方式［21-22］。影像學可采用多種方法測量體積的大小，本研究以海馬頭部間距IUD 測量確定腦體積改變，測量方法是在冠狀面前聯(lián)合第一次出現(xiàn)的層面測量海馬頭部間的最短距離，IUD 增寬反應(yīng)了海馬的萎縮，IUD 超過30 mm 即診斷為AD 大鼠［5］，這有助于對AD 大鼠模型的診斷和對病程的監(jiān)測。磁共振數(shù)據(jù)經(jīng)Philips Medical Systems 后處理工作站中三維分析3D 感興趣區(qū)測量比較發(fā)現(xiàn)：較之對照組，實驗組大鼠腦溝增寬。因大腦灰質(zhì)皮層萎縮導致的大鼠腦溝增寬可為AD 大鼠的診斷提供依據(jù)。因此，我們認為Philips 1.5 T 磁共振Micro-47 mm 線圈Wrist 序列可能為AD 大鼠提供較高質(zhì)量磁共振圖像。本研究基于以往研究結(jié)果并結(jié)合科室現(xiàn)有的醫(yī)療設(shè)備研究發(fā)現(xiàn)GE 3.0 T、Philips 1.5 T 不同場強磁共振儀器的不同線圈及掃描序列可得出較高質(zhì)量大鼠顱腦磁共振圖像，這有助于進一步認識AD 大鼠病程中顱腦病變的發(fā)生發(fā)展及其相互聯(lián)系，可對AD 大鼠模型動物實驗及應(yīng)用的影像技術(shù)后續(xù)研究提供客觀參考。

本研究創(chuàng)新之處在于對AD 模型大鼠采用醫(yī)用磁共振微線圈和動物線圈同時進行顱腦掃描，比較不同設(shè)備下實驗組和對照組大鼠腦結(jié)構(gòu)和腦體積差異，認為Philips 1.5 T 磁共振Micro-47 mm 線圈可為AD 大鼠動物學實驗提供有利的診斷。本研究亦存在一定的不足之處，即主觀評價法存在一定誤差，需要在后續(xù)的實驗中補充更精確的評價方法，同時應(yīng)在今后的課題研究中通過增加AD 大鼠模型功能磁共振檢測：即灌注成像（perfusion weighted imaging,PWI）和磁敏感成像（susceptibility weighted,SWI）檢測灰質(zhì)皮層萎縮腦血流灌注異常情況和淀粉樣蛋白沉積過程中引起的（Fe,Cu,Al）等金屬元素的沉積；氫質(zhì)子波譜檢測N-乙酰天門冬氨酸/肌酸（NAA/Cr）的異常代謝；靜息態(tài)功能磁共振檢測AD 大鼠局部和全腦異常自發(fā)神經(jīng)活動和腦區(qū)功能連接，更加深入的研究AD 大鼠顱腦改變在磁共振圖像上的表現(xiàn)。

綜上所述，D-半乳糖聯(lián)合三氯化鋁可建造有效的阿爾茨海默病大鼠模型，本研究呈現(xiàn)的Philips 1.5 T 磁共振Micro-47 mm 線圈同GE3.0 T動物線圈均可清晰顯示大鼠腦結(jié)構(gòu)，可用于阿爾茨海默病大鼠病程監(jiān)測和診斷，可為動物實驗研究提供參考思路。