ANA-12在大鼠坐骨神經(jīng)慢性壓迫性損傷中對星形膠質(zhì)細胞活化和自噬的作用*

李珍，譚志榮，徐偉，陳亮

（1.湖南省婦幼保健院 麻醉科，湖南 長沙 410008；2.中南大學湘雅醫(yī)院 遺傳藥理學科，湖南 長沙 410008）

神經(jīng)性疼痛通常被定義為軀體感覺神經(jīng)系統(tǒng)（無論是外周還是中樞）損傷或功能障礙引起的疼痛，是一種復雜的疼痛障礙［1］。脊髓星形膠質(zhì)細胞在誘導和維持神經(jīng)性疼痛中起著關鍵作用［2］。神經(jīng)性疼痛總是伴隨著脊髓星形膠質(zhì)細胞的激活［3］。星形膠質(zhì)細胞是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中最豐富的細胞，與神經(jīng)元突觸形成密切相關［4］。星形膠質(zhì)細胞之間以及小膠質(zhì)細胞和神經(jīng)元之間的相互作用現(xiàn)在被認為是急性和慢性疼痛狀態(tài)的基本機制［5］。因此，了解星形膠質(zhì)細胞中的細胞內(nèi)信號傳導對于尋找神經(jīng)性疼痛的治療策略至關重要。

自2011 年被發(fā)現(xiàn)以來，ANA-12 已成為研究星形膠質(zhì)細胞功能障礙與疼痛超敏反應的關鍵工具［6-7］。ANA-12 阻斷BDNF 信號可降低脊髓炎癥并緩解急性痛和慢性痛［8］。然而，ANA-12 在神經(jīng)性疼痛相關星形膠質(zhì)細胞中的作用機制尚不清楚。目前，利多卡因等藥物已被證明能激活星形膠質(zhì)細胞的自噬，從而改善慢性收縮損傷誘導的坐骨神經(jīng)疼痛［9］，但均具有一定程度的副作用。因此，本研究致力于探究ANA-12 在大鼠坐骨神經(jīng)慢性壓迫性損傷中對星形膠質(zhì)細胞活化和自噬的作用，以期為ANA-12 在大鼠坐骨神經(jīng)慢性壓迫性損傷中的應用提供新的策略。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

ANA-12（0.05 mg，219766-25-3，Sigma，美國）；膠質(zhì)纖維酸性蛋白（glial fibrillary acidic protein，GFAP)抗體（1∶50，60190-1-Ig，Proteintech，美國）；LC3B 抗體（1∶50，18725-1-AP，Proteintech，美國）；CoraLite488-conjugated Affinipure Goat Anti-Mouse IgG（H+L，SA00013-1，Proteintech，美國）；CoraLite594-conjugated Goat Anti-Rabbit IgG（H+L，SA00013-4，Proteintech，美國）；其它常規(guī)化學試劑購自上海國藥生物。

1.2 儀器與設備

光學顯微鏡（BA410T，Motic，中國）；切片機（YD-315，浙江金華益迪試驗器材，中國）；包埋機（BMJ-A，常州中威電子儀器，中國）；足底觸痛儀（熱刺痛，ZS-PTM，北京眾實迪創(chuàng)，中國）；足底刺痛系統(tǒng)（針刺痛，ZS-CTY，北京眾實迪創(chuàng)，中國）。

1.3 實驗方法

1.3.1 實驗動物與分組處理 18 只成年Sprague Dawley（SD）大鼠（雄性，體重150～180 g）購自湖南斯萊克景達實驗動物有限公司。大鼠隨機分為假手術組、CCI 組（坐骨神經(jīng)慢性壓迫性損傷大鼠模型組）和ANA-12 組（坐骨神經(jīng)慢性壓迫性損傷大鼠+0.5 mg/kg ANA-12 干預組），每組6 只，其中假手術組僅暴露坐骨神經(jīng)，其余兩組造成坐骨神經(jīng)慢性壓迫性損傷（chronic constrictive injury,CCI）疼痛模型。ANA-12 組大鼠腹腔注射0.5 mg/kg ANA-12，每天1 次，連續(xù)14 d，術后立即給予第一次劑量。CCI 造模后14 d，頸椎脫臼處死大鼠，四肢固定，使胸腔完全暴露。大鼠主動脈通過左心室插管，采用0.9%生理鹽水溶液（200 mL）灌注心臟，然后分離大鼠脊髓組織。脊髓組織用4%的多聚甲醛固定，石蠟包埋，每塊組織連續(xù)切片，用于免疫熒光組化檢測。

1.3.2 動物模型制備 建立大鼠CCI 模型。每只大鼠于手術前腹腔注射30 mg/kg 戊巴比妥鈉麻醉。皮膚預備后，沿右側股骨下緣中部約作1 cm 切口。坐骨神經(jīng)暴露于肌肉的鈍性分離。然后用4-0縫合線在1 mm 間隔內(nèi)形成4 個松結。外膜輕度受壓，腳趾輕微抽搐。隨后，常規(guī)縫合肌筋膜和皮膚。如果造模后大鼠出現(xiàn)跛行，右側后肢出現(xiàn)輕度外翻，有舔、吊等后肢保護行為，說明CCI 模型建立成功。假手術組坐骨神經(jīng)暴露2～3 min，不打結，縫合肌筋膜和皮膚。

1.3.3 痛閾測定 于CCI 模型建立后第0、3、5、7、14 天測定機械性反射閾值（mechanical withdrawal threshold，MWT）和熱收縮潛伏期（thermal withdrawal latency，TWL）。安靜大鼠右后肢足底逐漸加壓，直至出現(xiàn)回避腿舉升反應。記錄最大壓力（縮足閾值），以克表示。實驗重復6次，間隔5 min。去除最大值和最小值后，將MWT 計算為4 個值的平均值±標準差。用自動足底試驗測量大鼠損傷側的TWL 值。儀器發(fā)射紅外光照射大鼠右后肢足底。儀器自動切斷熱量供應，記錄從輻照開始到腳收縮逃逸發(fā)生的時間（潛伏期）。實驗重復6 次，間隔10 min。除去最大值和最小值后，將TWL 計算為4 個值的平均值±標準差。

1.3.4 免疫熒光組織化學 60℃烤片12 h。切片脫蠟、抗原修復。切片依次進行硼氫化鈉溶液浸泡、75% 乙醇溶液浸泡、蘇丹黑染液染色和5%BSA 封閉。滴加適當稀釋的一抗LC3B（1∶50）和GFAP（1∶50），4℃過夜。PBS 沖洗5 min×3 次。然后滴加 50～100 μL CoraLite488 -conjugated Affinipure Goat Anti-Mouse/Rabbit IgG 抗體，37℃孵育60～90 min，PBS 沖洗5 min×3 次。DAPI 工作液37℃染核10～20 min，PBS 沖洗5 min×3 次。緩沖甘油封片，置于熒光顯微鏡下觀察。

1.4 統(tǒng)計學方法

本研究資料統(tǒng)計分析均采用Graphpad Prism 8.0 統(tǒng)計軟件進行分析。計量資料以均數(shù)±標準差（）表示，首先進行正態(tài)性和方差齊性檢驗，檢驗符合正態(tài)分布且方差齊，組間采用非配對t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析或重復測量數(shù)據(jù)的方差分析，Tukey's 進行事后檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 各組大鼠患側機械性反射閾值測定結果

假手術組大鼠的MWT 值在術后第5 天略有降低，之后恢復，與術前相比差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），見圖1。CCI 大鼠的MWT 值在術后3、5、7 天逐步下降，至第14 天，與術前相比差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），見圖1。在第3 天，與假手術組相比，CCI 組大鼠的MWT 顯著降低（t=6.524,P＜0.001），ANA-12 干預使CCI 大鼠的MWT 值升高但差異無統(tǒng)計學意義（t=2.088,P=0.130）。在第5 天，與假手術組相比，CCI 組大鼠的MWT 顯著降低（t=10.490,P＜0.001）。ANA-12組大鼠的MWT 值也顯著高于CCI 組（t=4.541,P＜0.001）。在第7 天，與假手術組相比，CCI 組大鼠的MWT 顯著降低（t=13.050,P＜0.001），ANA-12干預使CCI 大鼠的MWT 值升高但差異無統(tǒng)計學意義（t=0.678,P=0.877）。在第14 天，與假手術組相比，CCI 組大鼠的MWT 顯著降低（t=12.000,P＜0.001）。ANA-12 組大鼠的MWT 值也顯著高于CCI 組（t=8.142,P＜0.001）。見表1。

表1 各組大鼠患側機械性反射閾值（MWT）比較（n=6,）

表1 各組大鼠患側機械性反射閾值（MWT）比較（n=6,）

注：1）與假手術組比較，P＜0.05；2）與CCI 組比較，P＜0.05。

圖1 各組大鼠患側機械性反射閾值（MWT）隨時間變化

2.2 各組大鼠患側熱收縮潛伏期測定結果

假手術組大鼠的TWL 值在術后第3 天略有降低，之后恢復，與術前相比差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），見圖2。CCI 大鼠的TWL 值在術后第3、5、7 天逐步下降，至第14 天，與術前相比差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），見圖2。與假手術組相比，在第3、5、7、14 天，CCI 組大鼠的TWL 均顯著降低（t=8.056,14.923,14.592,14.660,P＜0.001）。在第3、5、7、14 天，與CCI 組相比，ANA-12 組大鼠的MWT 顯著降低（t=3.962,P=0.001；t=4.622,P＜0.001；t=3.698,P=0.003；t=10.171,P＜0.001）。見表2。

圖2 各組大鼠患側熱收縮潛伏期（TWL）隨時間變化

表2 各組大鼠患側熱收縮潛伏期（TWL）比較（n=6,）

表2 各組大鼠患側熱收縮潛伏期（TWL）比較（n=6,）

注：1）與假手術組比較，P＜0.05；2）與CCI 組比較，P＜0.05。

2.3 各組大鼠脊髓組織GFAP 和LC3B 免疫熒光組織化學結果

與假手術組相比，大鼠脊髓組織星形膠質(zhì)細胞GFAP 熒光密度在CCI 組顯著增加（q=19.850,P＜0.001）。ANA-12 治療后，CCI 大鼠脊髓組織星形膠質(zhì)細胞GFAP 熒光密度顯著降低（q=14.120,P＜0.001）。與假手術組相比，CCI 大鼠脊髓組織星形膠質(zhì)細胞LC3B 熒光密度顯著增加（q=9.000,P=0.002）。ANA-12 治療后，CCI 大鼠脊髓組織星形膠質(zhì)細胞LC3B 熒光密度顯著升高（q=9.108,P=0.002）。見圖3 和表3。

表3 脊髓組織星形膠質(zhì)細胞的GFAP 和LC3Ⅱ熒光密度統(tǒng)計（n=6,）

表3 脊髓組織星形膠質(zhì)細胞的GFAP 和LC3Ⅱ熒光密度統(tǒng)計（n=6,）

注：1）與假手術組比較，P＜0.05；2）與CCI 組比較，P＜0.05。

圖3 脊髓組織星形膠質(zhì)細胞的GFAP 和LC3Ⅱ熒光信號觀察

3 討論

在外周神經(jīng)損傷、組織損傷和關節(jié)炎疾病中，脊髓星形膠質(zhì)細胞從靜止狀態(tài)迅速轉變?yōu)榧せ顮顟B(tài)，這與慢性疼痛行為密切相關［10］。在慢性疼痛模型中，位于脊髓背角淺層的一組星形膠質(zhì)細胞控制了機械性疼痛超敏反應的產(chǎn)生［11］。激活的星形膠質(zhì)細胞調(diào)節(jié)炎性介質(zhì)、神經(jīng)營養(yǎng)因子、腺苷、趨化因子和神經(jīng)遞質(zhì)的釋放，導致持續(xù)性熱痛覺過敏和機械性痛覺過敏［12］。與假手術組相比，CCI大鼠的術后MWT 和TWL 值顯著降低，脊髓組織星形膠質(zhì)細胞活化水平升高，與前人研究一致。這些研究證明脊髓星形膠質(zhì)細胞活化與坐骨神經(jīng)壓迫性損傷疼痛密切相關，可能是治療的潛在靶點。

已知CCI 后脊髓背角突觸體素和GFAP 的表達均明顯增多，兩者可能同時參與了病理性神經(jīng)痛及其調(diào)節(jié)過程［13］。既往的研究證明芍藥苷緩解神經(jīng)病理性疼痛的機制可能與抑制脊髓小膠質(zhì)細胞活化有關［14］。ANA-12 治療可減輕大鼠膀胱炎相關的機械性異常疼痛，抑制星形膠質(zhì)細胞和小膠質(zhì)細胞的活化，減輕神經(jīng)炎癥［15］。ANA-12 治療促進了CCI 大鼠術后MWT 和TWL 值的恢復，抑制了脊髓組織星形膠質(zhì)細胞活化，與前人研究一致。這些研究證明ANA-12 治療有助于調(diào)節(jié)坐骨神經(jīng)壓迫性損傷的病理性神經(jīng)痛。

自噬是一種主要的細胞內(nèi)溶酶體清除途徑，涉及溶酶體降解和長壽命蛋白質(zhì)、氧化損傷蛋白質(zhì)和功能失調(diào)細胞器的循環(huán)［16］。目前的證據(jù)表明，自噬可能影響星形膠質(zhì)細胞的功能［17］。7,8-二羥基黃酮可以通過自噬改善1-甲基-4-苯基-1,2,3，6-四氫吡啶（MPTP）誘導的帕金森模型鼠運動障礙［18］。LC3B 是自噬途徑激活的標記物［19］。在髓母細胞瘤中，ANA-12 已用于研究凋亡、自噬和分化相關細胞內(nèi)信號和基因表達的調(diào)節(jié)［20］。我們的研究顯示CCI 大鼠脊髓組織發(fā)生星形膠質(zhì)細胞活化和LC3B 表達增加，ANA-12 治療抑制了脊髓組織星形膠質(zhì)細胞活化但促進了LC3B 的表達，可能是ANA-12 改善坐骨神經(jīng)壓迫性損傷相關神經(jīng)疼痛的潛在作用機制。

總之，ANA-12 治療通過抑制星形膠質(zhì)細胞的過度活化和促進LC3B 自噬進而改善大鼠坐骨神經(jīng)慢性壓迫性損傷的機械和熱縮足痛閾值，緩解了神經(jīng)性疼痛，為坐骨神經(jīng)慢性壓迫性損傷的治療提供了新的依據(jù)。