P-選擇素靶向碳化鐵納米顆粒的易損斑塊磁共振成像研究*

丁亞輝，陳艷，高雅芳，王程健，杜穎

（1.浙江省人民醫(yī)院 心內(nèi)科，浙江 杭州 310014；2.浙江中醫(yī)藥大學 第二臨床醫(yī)學院，浙江 杭州 310053；3.蚌埠醫(yī)學院 研究生院，安徽 蚌埠 233030）

斑塊的不穩(wěn)定性會增加不良心血管事件的發(fā)生率，其中易損斑塊破裂引起的血栓事件是引起嚴重不良事件的主要原因［1］。易損斑塊的早期診斷識別有助于盡早采取積極措施降低不良事件的發(fā)生。磁共振成像（magnetic resonance imaging，MRI）可通過多參數(shù)序列獲得較高的軟組織對比度從而提高斑塊成分的識別能力，有助于識別易損斑塊［2］。近幾年為了進一步提高MRI 對特定組織的分辨能力，結(jié)合分子靶向技術(shù)的磁共振成像技術(shù)得到了重視和發(fā)展。本研究對Fe5C2碳化鐵納米顆粒進行P-選擇素抗體/熒光修飾，制備一種靶向易損斑塊的MRI/熒光雙模對比劑并進行了體外血栓和動物活體成像研究。

1 材料和方法

1.1 碳化鐵納米顆粒合成

在油胺與十八烯組成的混合溶劑中加入適量誘導劑溴化胺，在180℃下加入前驅(qū)體Fe(CO)5并保溫60 min 得到bcc-Fe 晶種。將bcc-Fe 晶種加入到十八胺后再加入適量鹵化胺，將體系升溫到250～350°C 保溫120 min，催化有機相中的有機物斷裂與碳化，促使bcc-Fe 晶種碳化成Fe5C2碳化鐵納米顆粒。

1.2 納米顆粒表面修飾

1.2.1 親和素-生物素化碳化鐵納米顆粒（以下簡稱親和素納米顆粒）制備 取100μL 碳化鐵納米顆粒和100 mg 氨基PEG2000-生物素（廣州碳水生物科技）溶解于2 mL 二氯甲烷中，并加入0.4 mL雙蒸水后用超聲波震蕩儀聲震60 s。將所得產(chǎn)物與10 mL 3% 聚乙烯醇溶液混合，并用均質(zhì)機以15 000 rpm 均質(zhì)5 min，最后加入20 mL 2%異丙醇溶液在室溫下攪拌2 h，讓有機溶劑充分揮發(fā)。使用PBS 溶液離心洗滌3 次（4 000 rpm,5 min），去上清以去除未反應(yīng)的氨基PEG2000-生物素，收集沉淀獲取生物素化的碳化鐵納米顆粒。每1 mg 生物素化的碳化鐵納米顆粒用10 μg Dylight649 標記親和素（BioLegend,美國）進行孵育，以封閉納米顆粒表明的所有生物素基團。在室溫下緩慢搖晃孵育30 min，并用PBS 反復離心洗滌上述懸液3 次（4 000 rpm,5 min），去上清以去除未反應(yīng)的親和素，收集獲得純化的親和素納米顆粒。使用透射掃描電鏡對樣品的尺寸和形態(tài)進行表征。

1.2.2 生物素化P-選擇素抗體的制備 稱取2 mg Sulfo-NHS-LC-Biotinylation（ApexBio,美國），加入400 μL 無菌超純水充分溶解。將200 μL P-選擇素抗體（Biovision,美國）加入現(xiàn)配置的D-生物素-NHS（上海阿拉丁生化科技）溶液10 μL 中，搖勻，冰育2 h，取出反應(yīng)產(chǎn)物，滴入脫鹽柱中，1 000 g 離心2 min，除去緩沖反應(yīng)產(chǎn)物和過剩的生物素試劑。用生物素定量試劑盒（武漢華美生物）計算樣品中的生物素的濃度，并計算生物素/抗體偶聯(lián)比。

1.2.3 計算與氨基PEG2000-生物素以1∶3 摩爾比率的生物素化P-選擇素抗體 加入親和素納米顆粒懸液中，并在微孔板震蕩器上25℃孵育0.5 h，再以PBS 重懸洗滌上述反應(yīng)液，4 000 rpm 5 min離心3 次，棄上清以除去多余的生物素化抗體，即可得到純化的攜帶P-選擇素抗體的親和素納米顆粒（以下簡稱P-選擇素納米顆粒）。

1.3 體外血栓模型檢測

取小鼠血液3 mL，加入凝血酶100 u，二磷酸腺苷0.5 mg 充分混合后迅速注入2 mm 內(nèi)徑的塑料管路中，以37℃恒溫孵育30 min。取長度約3 cm的血栓兩段，一端用絲線固定后，分別在相同濃度的親和素納米顆粒和P-選擇素納米顆粒試劑中浸泡反應(yīng)10 min，然后置入自制的流動腔沖洗裝置中，用PBS 溶液以10 cm/s 持續(xù)沖洗15 min，取出后用1%瓊脂糖溶液固定。使用小動物活體成像系統(tǒng)對血栓進行成像，使用654 nm 激發(fā)光激發(fā)熒光，以670 nm 進行熒光成像拍照，選定血栓成像的感興趣區(qū)（region of interesting，ROI）進行量化測定并進行。

1.4 小鼠動脈粥樣硬化斑塊在體磁共振檢測

6 周齡ApoE-/-小鼠喂食高脂高膽固醇飼料（含15% 的脂肪和0.25% 的膽固醇）連續(xù)24 周，取主動脈組織做冰凍切片，使用H&E 染色確認斑塊造模成功。

將6 只ApoE-/-小鼠分為三組，從尾靜脈注射300μL 濃度為0.3 mg/mL Fe 的親和素碳化鐵納米顆粒（親和素組）、P-選擇素碳化鐵納米顆粒（P-選擇素組）對比劑以及300μL PBS 溶液（對照組）經(jīng)尾靜脈注射入小鼠體內(nèi)，在注射后的24 h 進行MRI 成像。小鼠麻醉后固定為仰臥位，將小鼠的心胸部放置于掃描區(qū)域。采用德國Bruker 公司BioSpec 70/20 USR 7.0T 小動物磁共振，掃描序列及參數(shù)：T1 FLASH 序列，重復時間（TR）：40.8 ms，回波時間（TE）：2.3 ms，flip angel=40.0°，視野（FOV）：2.5×2.5 cm2；矩陣：256×256，層厚/層間距：1.0 mm/1.2 mm；T2 TurboRARE 序列，TR：800.0 ms，TE：25.0 ms，flip angel=90.0°，F(xiàn)OV：2.5×2.5 cm2；矩陣：256×256，層厚/層間距：1.0 mm/1.2 mm。T1 FLASH 序列圖像使用ImageJ 軟件比較分析主動脈粥樣硬化斑塊信號的鈣化，畫出ROI 測定MRI 信號強度，并與鄰近肌肉的信號強度進行比較，計算相對信號強度（relative signal intensity，rSI）。rSI=SIplaque/SImuscle。選擇3 個斑塊層面圖像，每個斑塊區(qū)域和鄰近肌肉各設(shè)定三個ROI 進行測量，取平均值后計算rSI。

1.5 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 19.0 軟件對MRI 圖像分析結(jié)果進行統(tǒng)計分析。計量資料以均數(shù)±標準差（）表示，多組比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 納米顆粒特征

使用透射掃描電鏡檢測顯示，親和素碳化鐵納米顆粒的直徑（15.98±2.11）nm（10.46 nm～21.45 nm），殼層結(jié)構(gòu)表現(xiàn)為非晶體結(jié)構(gòu)，大小基本一致，呈散在分布（見圖1）。使用小動物活體成像系統(tǒng)對親和素納米顆粒和P-選擇素納米顆粒試劑樣本進行熒光成像檢測，證實Dylight649 標記的親和素與碳化鐵納米顆粒偶聯(lián)成功。

圖1 親和素碳化鐵納米顆粒的透射掃描電鏡圖

2.2 體外血栓熒光成像

對每個血栓樣本取三個ROI 區(qū)域進行熒光強度測定并取平均值，結(jié)果顯示P-選擇素碳化鐵納米顆粒組的熒光強度平均比親和素碳化鐵納米顆粒的熒光強度升高21%。

2.3 小鼠主動脈斑塊MRI 成像

MRI 圖像顯示小鼠主動脈管壁均有增厚和斑塊形成。結(jié)果顯示，P-選擇素組相比親和素組和對照組有更高的rSI 值，差異有統(tǒng)計學意義（P=0.002），P 選擇素組和其他兩組兩兩比較差異有統(tǒng)計學意義（與對照組比較P=0.004，與親和素組比較P=0.001），親和素組和對照組之間差異無統(tǒng)計學意義（見表1）。同時在對比P-選擇素組同一易損斑塊的T1 FLASH 和T2 TurboRARE 圖像可以發(fā)現(xiàn)，易損斑塊在T1 FLASH 上呈現(xiàn)明顯的高信號（更亮，圖2 左側(cè)箭頭），而在T2 TurboRARE上則為明顯的低信號（更暗，圖2 右側(cè)箭頭），對比度明顯增強（見圖2）。

圖2 P-選擇素組T1 FLASH 序列圖像

表1 不同對比劑小鼠主動脈斑塊MRI 相對信號強度的差異（）

表1 不同對比劑小鼠主動脈斑塊MRI 相對信號強度的差異（）

注：1）與對照組比較，P=0.173；2）與對照組比較，P=0.004；3）與親和素組比較，P=0.001。

3 討論

順磁性對比劑可以增強MRI 的T1 信號（更亮），降低T2 信號（更暗），從而提高MRI 的圖像對比度。氧化鐵納米顆粒是常用的MRI 對比劑，但其磁化強度中等對比增強效果欠佳。因此人們曾嘗試使用CoFe、FePt 等，但這些納米顆粒材料會出現(xiàn)嚴重的粒子聚集且大多數(shù)具有高毒性，因此限制了其應(yīng)用［3］。鐵碳化物（Fe3C、Fe5C2和Fe7C3）主要用于合金及硬質(zhì)涂層，具有良好的磁性。因此近幾年碳化鐵納米顆粒作為一種具有高磁化強度的新型材料被關(guān)注，尤其是Fe5C2?；贔e5C2制作的直徑約20 nm 碳化鐵納米顆粒能夠產(chǎn)生比傳統(tǒng)氧化鐵納米顆粒（Fe3O4）更顯著的MRI對比度增強（7.0T 時r2 值為428.5 m/MSvs.232.2 m/MS）［4］。同時碳化鐵納米顆粒表面的碳可以保護Fe5C2核不被氧化，在空氣中暴露1 周至2個月后飽和磁化強度也沒有明顯變化，而碳化鐵納米顆粒經(jīng)過酒石酸等包裹后的水溶液穩(wěn)定性好，至少3 個月的時間沒有任何沉淀［3-5］。本研究使用PEG2000 包裹后同樣發(fā)現(xiàn)碳化鐵納米顆粒的穩(wěn)定性很好，水溶液在存放3 個月以上也未發(fā)生明顯沉淀聚集現(xiàn)象。Fe5C2碳化鐵納米顆粒的毒性也較低，即使用100 μg/mL 濃度的碳化鐵處理，細胞存活率仍高達85%以上［4］。Fe5C2碳化鐵納米顆粒相比Fe3O4具有更好的對比度增強，給BALB/c 小鼠靜脈注射Fe5C2碳化鐵納米顆粒后發(fā)現(xiàn)，肝臟區(qū)域碳化鐵納米顆粒相比氧化鐵納米顆粒的T2 信號明顯變暗，對比度增強［4］。在腫瘤顯像中碳化鐵納米顆粒比氧化鐵納米顆粒有更顯著的信號變化［3］。

易損斑塊容易存在纖維帽破裂和斑塊內(nèi)出血誘發(fā)局部血小板的活化和聚集。血小板激活后，P-選擇素從α 顆粒轉(zhuǎn)移到血小板表面，可以讓特異性抗體與活化的血小板結(jié)合，成為重要的粘附分子［6-7］。因此P-選擇素也被用于活化血小板的重要分子靶標［8］。有研究將P-選擇素與超聲微泡橋接，構(gòu)建出具有血栓靶向能力的分子超聲對比劑，成功應(yīng)用于血管和心房血栓的超聲分子成像［9-10］。本研究體外血管流動腔模型實驗結(jié)果顯示，P-選擇素抗體化碳化鐵納米顆粒處理的血栓有更強的熒光強度，顯示出更好的血栓靶向能力。而在動脈粥樣硬化小鼠模型的活體MRI 檢測中發(fā)現(xiàn)，P-選擇素組的斑塊的rSI 顯著高于親和素組和對照組，這表明經(jīng)過P-選擇素修飾后的碳化鐵納米顆?？梢愿行У陌邢蛞讚p斑塊，提高易損斑塊的對比度，并且通過T1 和T2 影像對比，也有助于更好的識別易損斑塊。

綜上所述，使用P-選擇素修飾的Fe5C2碳化鐵納米顆?？梢杂行О邢蛞讚p斑塊，提高圖像對比度，對于無創(chuàng)診斷易損斑塊具有積極意義。