種源差異對百里香揮發(fā)性物質(zhì)種類和含量的影響

任瑞芬，楊秀云*，劉 濤

(1.山西農(nóng)業(yè)大學 林學院，山西 太谷 030801；2.山西省桑干河楊樹豐產(chǎn)林實驗局云西林場，山西 左云 037100)

百里香(Thymusmongolicus)為唇形科(Lamiaceae)百里香屬(Thymus)的一種多年生草本植物，最早產(chǎn)于地中海沿岸地區(qū)，現(xiàn)廣泛分布于亞歐大陸溫帶地區(qū)[1-2]。我國作為主要分布區(qū)，不僅百里香種類較多(17種之多)，且分布范圍較廣(長江流域以北地區(qū)廣泛分布)[3]。百里香生長迅速、花量大、花期長，且植株各個部位均具有芳香氣味；同時，百里香還具有較強的生態(tài)適應(yīng)性，在多種環(huán)境條件惡劣、土壤質(zhì)地退化嚴重以及生境脆弱的地區(qū)均可以很好的生長；此外，百里香植株內(nèi)含化合物成分具有較強的抑菌及抗氧化作用[4-6]。因此，百里香在生態(tài)建設(shè)、園林綠化和美化、醫(yī)藥研發(fā)、食品以及畜牧產(chǎn)業(yè)等均具有廣闊的應(yīng)用前景[7-9]。

近年來，因百里香有廣闊的應(yīng)用前景，得到國內(nèi)外研究人員的高度重視，特別是在種質(zhì)資源的開發(fā)利用方面進行了大量的研究。目前，關(guān)于百里香種質(zhì)資源方面的研究主要集中于形態(tài)學、細胞學、孢粉學、分子水平以及揮發(fā)性物質(zhì)[10-12]。其中，關(guān)于百里香揮發(fā)性物質(zhì)的研究相對較多，不論是從揮發(fā)性物質(zhì)提取工藝方面，還是從揮發(fā)性物質(zhì)種類及其影響因素、應(yīng)用價值方面均進行了大量的探討[13-16]。但關(guān)于種源差異對百里香揮發(fā)性物質(zhì)的具體影響至今仍未報道。本研究以分布于山西省8個種源地的百里香為材料，探討種源差異對百里香揮發(fā)性物質(zhì)的影響，以期為百里香種質(zhì)資源的開發(fā)利用提供基礎(chǔ)的支撐。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

百里香分別收集于山西省朔州市右玉縣牛心鄉(xiāng)、大同市左云縣鵲兒河村、大同市渾源縣大磁窯鎮(zhèn)、忻州市繁峙縣砂河鎮(zhèn)、臨汾市蒲縣克城鎮(zhèn)、長治市沁源縣郭道鎮(zhèn)、晉城市澤州縣柳樹口鎮(zhèn)、運城市夏縣泗交鎮(zhèn)，種源地具體信息見表1。

將不同種源地的百里香引種于山西省晉中市太谷縣(34°36′40.44″N，110°15′E)，試驗地平均海拔1 000 m左右，年均氣溫9.8 ℃、年均日照時數(shù)2 530.8 h、年降水量462.9 mm，無霜期176 d。于生長期取植株離地面15 cm以上部位的幼嫩莖葉，剪成2～3 mm的小塊，立即稱取0.5 g置于固相微萃取儀采樣瓶內(nèi)(10 mL)。

表1 種源地位置及氣候信息

1.2 形態(tài)指標的測定

采用常規(guī)統(tǒng)計方法，對各個種源地百里香植株葉、莖、花相關(guān)的19個表型性狀進行觀測和統(tǒng)計，每個指標隨機選取10株測定，結(jié)果取均值。其中，葉片的長、寬以及面積均采用CAD光柵圖像法測定，測量精度為0.01 mm，其余關(guān)于長度、寬度等數(shù)據(jù)均采用電子游標卡尺，測量精度為0.01 cm；葉型指數(shù)為葉片長度與寬度的比值。

1.3 揮發(fā)性物質(zhì)的測定

采用頂空固相微萃取自動進樣(solid-phase micro-extraction,SPME)。將采樣瓶置于萃取儀架臺，30 ℃震蕩0.5 min，萃取頭(DVB/CAR/PDMS)入深40 mm，頂空萃取10 min后快速移出，并立即插入設(shè)置好條件的GC-MS氣相層析的注射口，注射口溫度為270℃，熱解析5 min。

氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(gas chromatography-mass spectrometer,GC-MS)(AgilentHP 6890 Ⅱ聯(lián)接HP-5973N質(zhì)量檢測器)色譜柱為Supelco18275-06A PTE-5Capillary(30 m×0.25 mm×0.25 μm)；柱流量(恒流)1.0 mL·min-1；進樣口溫度240℃；進樣量為0.2 μL，不分流進樣；載氣為N氣；FID檢測器(300℃)。其中，進樣口升溫程序為初始溫度40℃(保持3 min)，4℃·min-1升溫至160℃，然后20℃·min-1升溫至240℃，保持3 min。

質(zhì)譜的質(zhì)量檢測范圍為45～500 u；電子倍增電壓(EMV)為1 435 V；電離電壓為70 eV；EI離子源(280℃)；傳輸線溫度為280℃；四極桿溫度為150℃。通過保留時間定性的方法和質(zhì)譜數(shù)據(jù)與NBS質(zhì)譜圖檢索系統(tǒng)進行比較進行成分鑒定，然后采用面積歸一化法進行揮發(fā)性物質(zhì)定量分析。每種源地重復3次，結(jié)果取其均值。

1.4 數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)采用SPSS17.0(Version 17.0 SPSS Inc.,Chicago,IL,USA)針對相對百分含量在任一種源地大于5%的物質(zhì)進行單因素Pearson相關(guān)性分析，采用Microsoft Excel 2013 software (Microsoft Corp.,Richmond,CA,USA)進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計和圖表繪制。

2 結(jié)果與分析

2.1 種源差異對百里香形態(tài)特征的影響

不同種源百里香的葉面積差異較大，介于26.454～58.20 mm2，其中沁源的葉片最大，繁峙的葉片最小(表2)。不同種源的葉長和葉寬的差異較小，8個種源地的平均葉長為13.20 mm、平均葉寬為4.6 mm。不同種源的單枝葉片數(shù)一般為14～20片，其中繁峙的葉片較多，為20片。右玉、左云、繁峙、澤州的葉片為披針形，葉型指數(shù)分別為4.07、3.36、3.93、2.99；渾源、沁源、蒲縣的葉片為卵形，葉型指數(shù)分別為2.85、2.16、2.41；夏縣的葉片為闊卵形，葉型指數(shù)為2.58。右玉、左云、繁峙的葉片顏色較深，而沁源、澤州、夏縣的葉片顏色較淺。沁源、澤州、夏縣種源的葉片主脈、側(cè)脈均清晰，且有輕微的突起；蒲縣和渾源的葉片僅主脈清晰；而右玉、左云、繁峙種源的葉脈不清晰。右玉、左云、繁峙、澤州種源的葉緣微曲，渾源、沁源、蒲縣、夏縣葉緣平展；另外，夏縣的葉尖較鈍，其他種源的葉尖相對較為銳尖。右玉、左云、渾源、沁源種源的葉柄稀生細毛；而夏縣的葉柄密生細毛；繁峙、蒲縣、澤州葉柄無毛。

表2 不同種源百里香屬植物的形態(tài)特征

不同種源百里香的莖長差異較小，介于10.87～14.08 cm；同一枝條的節(jié)間數(shù)為5～9節(jié)，但是渾源、沁源、蒲縣、夏縣的節(jié)間長均大于2 cm，而右玉、左云、繁峙、澤州的節(jié)間長均小于2 cm。

不同種源地百里香的花序直徑和長度差異較小，花序的直徑為1.87～2.26 cm、長度為2.69～4.23 cm。但是，各種源地單個花序的小花朵數(shù)量差異較大，夏縣的單個花序的花朵數(shù)較多，為52朵；渾源的較少，僅34朵。各個種源地的單株花序數(shù)量差異較大，澤州的單株花序個數(shù)高達23個，而左云的單株花序個數(shù)僅10個。

2.2 種源差異對百里香揮發(fā)性物質(zhì)種類和含量的影響

8個種源地百里香共有的揮發(fā)性物質(zhì)為15種，但不同種源地間各組成成分的相對百分含量存在著一定的差異(表3)。其中β-蒎烯在渾源、繁峙、沁源、澤州、蒲縣、夏縣種源百里香的相對含量較高，分別為15.38%、28.55%、25.61%、16.97%、9.02%、6.47%，而右玉、左云種源地百里香的相對含量較低，分別為3.74%、3.88%。繁峙、沁源和夏縣種源地百里香的蒎烯相對含量較高，分別為22.88%、22.49%、17.68%；右玉種源地百里香的莰烯相對含量較高，為18.36%。

表3 不同種源地百里香的揮發(fā)性物質(zhì)種類和含量比較分析

此外，百里香揮發(fā)性成分因種源地差異呈現(xiàn)一定的特異性(表3)。在左云、渾源、蒲縣、澤州種源地百里香中鑒定到p-傘花烴，且相對含量較高，分別為52.65%、46.36%、29.04%、39.98%，而在其他種源地百里香中則未檢測出該成分。在右玉、蒲縣、澤州種源地百里香中鑒定到萜品烯，相對含量分別為24.68%、26.23%、7.20%，在其余各種源地百里香中均未鑒定出該類成分。

2.3 種源位置與百里香揮發(fā)性物質(zhì)含量的相關(guān)性分析

種源地經(jīng)度位置與β-蒎烯、3-辛酮以及2-異丙基-5-甲基茴香醚含量呈顯著正相關(guān)，與右旋萜二烯、萜品烯顯著負相關(guān)(表4)。種源地緯度位置與莰烯、2-異丙基-5-甲基茴香醚、萜品油烯以及1-石竹烯含量呈顯著正相關(guān)，與右旋萜二烯含量顯著負相關(guān)。種源地海拔位置與莰烯、萜品油烯、1-石竹烯、p-傘花烴、萜品烯以及桉葉油醇含量呈極顯著正相關(guān)，與蒎烯、右旋萜二烯含量呈極顯著負相關(guān)。

2.4 種源地生態(tài)環(huán)境因子與百里香揮發(fā)性物質(zhì)含量的相關(guān)性分析

種源地無霜期的持續(xù)時間與莰烯、2-異丙基-5-甲基茴香醚、香芹酚、萜品油烯、1-石竹烯以及桉葉油醇含量呈極顯著負相關(guān)，與右旋萜二烯含量顯著正相關(guān)(表5)。種源地年平均氣溫與莰烯、2-異丙基-5-甲基茴香醚、萜品油烯、1-石竹烯以及桉葉油醇含量呈顯著負相關(guān)，與蒎烯、右旋萜二烯含量顯著正相關(guān)(表5)。種源地年降水量與2-異丙基-5-甲基茴香醚含量呈極顯著負相關(guān)，與香芹酚含量呈極顯著正相關(guān)。種源地年日照時數(shù)與莰烯和萜品油烯含量顯著正相關(guān)。

種源地土壤酸堿度與百里香的右旋萜二烯含量呈極顯著負相關(guān)，但是與萜品油烯呈顯著正相關(guān)。種源地土壤酸堿度與其他各主要揮發(fā)性物質(zhì)未顯現(xiàn)相關(guān)。

表4 種源地位置與百里香揮發(fā)性物質(zhì)含量的相關(guān)性分析

表5 種源地生態(tài)因子與百里香揮發(fā)性物質(zhì)含量的相關(guān)性分析

3 結(jié)論與討論

右玉種源百里香的揮發(fā)性成分以莰烯和萜品烯為主、左云和渾源種源百里香的揮發(fā)性成分以p-傘花烴為主、繁峙和沁源種源百里香的揮發(fā)性成分以蒎烯和β-蒎烯為主、蒲縣種源百里香的揮發(fā)性成分以p-傘花烴和萜品烯為主、澤州種源百里香的揮發(fā)性成分以p-傘花烴和β-蒎烯為主、夏縣種源百里香的揮發(fā)性成分以右旋萜二烯和蒎烯為主?？梢?，百里香的揮發(fā)性物質(zhì)的種類因種源地不同存在著顯著的差異，這與多項已有研究結(jié)果一致。魏春雁[2]對比了多項關(guān)于百里香的研究，發(fā)現(xiàn)山東西部泰山、蒙山地區(qū)的百里香揮發(fā)性物質(zhì)多以酚類化合物為主，山東東部煙臺地區(qū)及中間過渡沂蒙山區(qū)的百里香揮發(fā)性物質(zhì)多以芳樟醇居多，或者是多種物質(zhì)混合型；而分布于黑龍江地區(qū)的百里香揮發(fā)性成分則以酚類、醇類、萜烯類等多種成分混合型為主。Salgueiro等[17]發(fā)現(xiàn)葡萄牙7個地區(qū)百里香精油的揮發(fā)性成分屬于4個不同的化學型。Mockute等[18]發(fā)現(xiàn)維爾紐斯10個不同地區(qū)百里香的揮發(fā)性成分分為香葉醇型、香芹酚型以及多種化合物混合型。

植物為適應(yīng)特定的地理環(huán)境特性，在生長發(fā)育過程中不僅在表型層面，而且在基因?qū)用婢a(chǎn)生了一定程度的適應(yīng)性變異，進而形成該物種在這種環(huán)境條件下所特有的種源特性[19-20]。已有研究表明，這種源地差異而形成的特性在植物表型性狀、生長發(fā)育規(guī)律以及內(nèi)部生物量等均產(chǎn)生的顯著的影響[21-23]。而揮發(fā)性物質(zhì)作為植物次生代謝產(chǎn)物的組成部分，在一定程度上種源特性對其具有重要的影響。本研究中，各個種源地百里香揮發(fā)性物質(zhì)中占比高的成分均與種源地經(jīng)緯位置、海拔、生態(tài)環(huán)境因子以及土壤酸堿度呈現(xiàn)了一定的相關(guān)性；且不同類型揮發(fā)性物質(zhì)含量的變化對種源地生態(tài)環(huán)境因子和位置的敏感性具有差異。如p-傘花烴和萜品烯均與種源地的海拔高度相關(guān)，β-蒎烯與經(jīng)度位置相關(guān)；蒎烯與種源地海拔高度平均氣溫相關(guān)；莰烯與種源地的無霜期持續(xù)時間、年平均氣溫、年日照時數(shù)相關(guān)，右旋萜二烯與種源地無霜期的持續(xù)時間、年平均氣溫以及土壤酸堿度相關(guān)?？梢?，種源地差異對百里香揮發(fā)性物質(zhì)含量產(chǎn)生了顯著的影響。

綜上所述，百里香揮發(fā)性物質(zhì)種類和含量因種源地差異而不同。其中，右玉、繁峙、沁源、夏縣種源地百里香的揮發(fā)性成分主要以萜烯類化合物為主，其相對含量達到總成分的45%以上，含量占比較高的成分為萜品烯、莰烯、β-蒎烯、蒎烯和右旋萜二烯等化合物；左云、渾源種源地百里香的主要揮發(fā)性成分為芳香烴類化合物，其中p-傘花烴的相對百分含量分別為總成分的52.65%、46.36%；蒲縣和澤州種源百里香的揮發(fā)性物質(zhì)則為萜烯類和芳香烴類化合物混合型。而這種因種源地不同而產(chǎn)生的差異主要源于種源地無霜期、年平均氣溫以及年日照時數(shù)等生態(tài)環(huán)境因子以及種源地土壤酸堿度的不同。