基于凋亡相關(guān)通路探討桑黃素對心肌氧化損傷的保護(hù)作用

謝碩崟，翟昌林，王海波

(1浙江中醫(yī)藥大學(xué)·浙江 杭州 310053；2嘉興市第一醫(yī)院·浙江 嘉興 314001)

近年來，隨著我國經(jīng)濟(jì)水平提升，人民膳食結(jié)構(gòu)發(fā)生了改變，并且伴隨人口老齡化程度的加重，各類心血管疾病的發(fā)病率和致死率持續(xù)增長[1]。心血管疾病的發(fā)生與心肌細(xì)胞凋亡具有密切的聯(lián)系，其中細(xì)胞內(nèi)活性氧(reactive oxygen species,ROS)是導(dǎo)致細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷的主導(dǎo)因子[2],冠心病無論是慢性穩(wěn)定型心絞痛或是心肌梗死以及冠脈開通過程中的缺血再灌注損傷均會導(dǎo)致心肌細(xì)胞產(chǎn)生大量的ROS[3]；因此，探究發(fā)現(xiàn)抑制心肌細(xì)胞凋亡及氧化應(yīng)激損傷的特異性藥物一直是臨床研究的重點。桑黃，味苦，性寒，歸肝、腎經(jīng)，《本草綱目》記載其能“利五臟，宣腸胃氣，排毒氣”，被列為“上藥”。桑黃素，又名桑色素，類黃酮類物質(zhì)，是桑黃中的主要有效成分之一，既往研究表明桑黃素具有抑制內(nèi)皮細(xì)胞炎癥反應(yīng)、降血脂等作用[4-6]。本研究觀察了桑黃素對于心肌過氧化損傷的保護(hù)作用及其與凋亡相關(guān)通路的相關(guān)性，現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 桑黃素：MACKLIN公司，貨號：C13876704；桑黃素溶液的配制：使用分析天平稱取桑黃素4.0 mg，加入500 μL DMSO溶液，徹底溶解后加入4.5 mL完全培養(yǎng)基，使用0.22 μm孔徑的過濾器過濾除菌，母液濃度為2.5 mmol/L，根據(jù)前期預(yù)實驗結(jié)果，選擇加入細(xì)胞中的終濃度為25 μmol/L。H9C2心肌細(xì)胞：上海中喬新舟生物科技有限公司。低糖DMEM培養(yǎng)基：Hyclone公司；胎牛血清：Gibco公司；CCK8試劑盒：Elabscience公司，貨號：E-CK-A362；ROS試劑盒：南京建成公司，貨號：E004-1-1；Western blot抗體：Affinity公司，Bax(貨號：AF0120)、Bcl-2(貨號：AF6139)、Caspase-3(貨號：AF6311)、β-actin(貨號：AF7018)；H2O2：環(huán)凱微生物，批號：6108124。ELX800酶標(biāo)儀：BIOTEK公司；LSR Fortessa流式細(xì)胞儀：美國BD；TZD-CL-200S顯影儀：廈門天中達(dá)生物科技；CKX41顯微鏡：奧林巴斯。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng) H9C2心肌細(xì)胞培養(yǎng)于37 ℃，含5%的二氧化碳培養(yǎng)箱中，使用低糖DMEM培養(yǎng)基添加10%的FBS，細(xì)胞生長至80%予以傳代。

1.3 細(xì)胞分組 H9C2心肌細(xì)胞傳代鋪板后分為3組。正常組(control組)：正常培養(yǎng)及同步換液處理；氧化損傷組(ODG組)：待實驗細(xì)胞生長密度達(dá)到70%時，加入H2O2,濃度設(shè)定為600 μmol/L,持續(xù)作用12 h；桑黃素組(Morin組)：在構(gòu)建氧化損傷模型前，加入桑黃素25 μmol/L，持續(xù)作用12 h。

1.4 CCK8實驗 (1)消化對數(shù)生長期的H9C2心肌細(xì)胞，鋪96孔板，每孔鋪6 000個細(xì)胞，培養(yǎng)24 h；(2)3組細(xì)胞分別處理：其中正常組予以換液處理，氧化損傷組構(gòu)建氧化損傷模型，桑黃素組使用桑黃素25 μmol/L預(yù)處理12 h后構(gòu)建氧化損傷模型；(3)向每孔加入10 μL CCK8溶液；(4)使用酶標(biāo)儀設(shè)定450 nm檢測波長，測定各組吸光度值；(5)計算細(xì)胞活力值。細(xì)胞活力值=(實驗組OD值-空白孔OD值)/(正常組OD值-空白孔OD值)×100%。

1.5 流式細(xì)胞儀檢測心肌細(xì)胞ROS表達(dá) 細(xì)胞接種于6孔板，不同組別細(xì)胞經(jīng)過相應(yīng)處理后，將DCFH-DA(10 μmol/L)加入到6孔板中，37 ℃孵育30 min，PBS清洗細(xì)胞3次，導(dǎo)入流式細(xì)胞儀進(jìn)行細(xì)胞內(nèi)測定ROS表達(dá)。

1.6 Western blot檢測各組心肌細(xì)胞Bax、Bcl-2、Caspase-3蛋白表達(dá) PBS潤洗3組細(xì)胞，放置于冰上，加入RIPA裂解液提蛋白，BCA法測蛋白濃度，調(diào)整濃度一致后以1∶2的比例加入3×loading buffer,95 ℃變性5 min，制分離膠和濃縮膠，進(jìn)行蛋白電泳、轉(zhuǎn)膜，5%脫脂牛奶室溫?fù)u床上封閉2 h，PBS潤洗后4 ℃搖床上孵育一抗Bax(1∶1 000)、Bcl-2(1∶1000)、Caspase-3(1∶1 000)、β-actin(1∶1 000)，孵育時長12 h，PBS潤洗后加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗，室溫孵育2 h，PBS潤洗后ECL化學(xué)顯影，QuantityOne軟件計算各組條帶灰度值。

1.7 統(tǒng)計學(xué)方法 應(yīng)用SPSS24.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析，計量資料首先予以正態(tài)性檢驗，符合正態(tài)分布的數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，兩組間比較采用獨立樣本t檢驗，多組間比較采用方差分析，P<0.05認(rèn)為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組心肌細(xì)胞活性比較 見表1。

表1 各組心肌細(xì)胞活力值比較

2.2 各組心肌細(xì)胞內(nèi)ROS表達(dá)量的比較 通過流式細(xì)胞儀檢測各組心肌細(xì)胞內(nèi)ROS表達(dá)，與正常組相比，氧化損傷組與桑黃素組ROS表達(dá)量均明顯上升(均P<0.05)，與氧化損傷組相比，桑黃素預(yù)處理后，細(xì)胞內(nèi)ROS表達(dá)量明顯降低(P<0.05)。見圖1。

2.3 各組心肌細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的Western blot檢測結(jié)果 通過Western blot比較各組凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)，相較于正常組，氧化損傷組與桑黃素組促凋亡相關(guān)蛋白Caspase-3、Bax的表達(dá)量均明顯上升(均P<0.05)，與氧化損傷組相比，桑黃素預(yù)處理后，Caspase-3、Bax的表達(dá)量明顯降低(均P<0.05)，抗凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2表達(dá)量明顯上升(P<0.05);與此同時，氧化損傷組相較于正常對照組，抗凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2表達(dá)量明顯下降(P<0.05)，桑黃素組相較于正常組，Bcl-2表達(dá)量的比較無統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見圖2。

注：與正常對照組比較，*P<0.05；與氧化損傷組比較，#P<0.05圖1 各組心肌細(xì)胞內(nèi)ROS流式細(xì)胞檢測及熒光強度比較

注：與正常對照組比較，*P<0.05；與氧化損傷組比較，#P<0.05圖2 各組心肌細(xì)胞凋亡相關(guān)信號通路蛋白表達(dá)的Western blot檢測結(jié)果比較

3 討論

桑黃素屬于天然的五羥基黃酮的一種，廣泛分布于自然界之中，可提取自桑橙樹、黃桑木等桑科植物或多種中草藥[7]，同時也普遍存在于海藻、番石榴葉、洋蔥等植物中[8]。關(guān)于桑的用藥最早記載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，之后的本草中也均有收錄[7]。目前多種研究證實桑黃素具有抗腫瘤、抗炎、抗氧化應(yīng)激等多種活性[9-11]?；邳S酮類化合物多數(shù)具備抗氧化作用的特性，本研究重點從抗氧化應(yīng)激及凋亡的角度探索了桑黃素對于心肌過氧化損傷的保護(hù)作用。

桑黃素通過抗氧化應(yīng)激對多種器官發(fā)揮保護(hù)作用的研究已經(jīng)得到了廣泛驗證[9,12]，Pragna等[13]構(gòu)建高糖誘導(dǎo)的鼠神經(jīng)損傷模型，發(fā)現(xiàn)桑黃素可調(diào)節(jié)Nrf2-NF通路平衡發(fā)揮保護(hù)作用，Lee等[14]發(fā)現(xiàn)桑黃素可抑制過氧化氫酶活化從而抑制倉鼠成纖維細(xì)胞的氧化損傷，Khalid S. AlNumair等[15-16]通過異丙腎上腺素構(gòu)建了大鼠心梗模型，通過桑黃素預(yù)處理發(fā)現(xiàn)具有心肌細(xì)胞的保護(hù)作用，但缺乏機制方面的探索。本研究基于以上研究構(gòu)建了大鼠H9C2心肌細(xì)胞的過氧化氫氧化損傷模型，發(fā)現(xiàn)桑黃素預(yù)處理可有效減輕心肌細(xì)胞的氧化損傷及凋亡，并進(jìn)一步探討了各組心肌細(xì)胞內(nèi)ROS的表達(dá)及凋亡相關(guān)通路蛋白的表達(dá)。

相關(guān)研究顯示：心肌損傷過程中會導(dǎo)致ROS爆發(fā)，ROS的表達(dá)過量會引起線粒體膜通透性轉(zhuǎn)換孔(mitochondrial permeability transition pore,MPTP)大量開放，并且該過程不可逆[17],持續(xù)的缺血缺氧、氧化性損傷、鈣離子超載、磷酸鹽濃度增高均會導(dǎo)致線粒體去極化加重，導(dǎo)致MPTP一直處于開放狀態(tài)，導(dǎo)致分子量大于1.5 kd的物質(zhì)輕易進(jìn)入線粒體內(nèi)膜，引起ATP耗竭、線粒體腫脹、離子平衡失調(diào)、最終心肌細(xì)胞致死[18-19]。MPTP開放的過程中Bcl-2家族蛋白也發(fā)揮了調(diào)控作用[20]，Bax作為促凋亡蛋白可與VDAC或ANT結(jié)合從而加劇MPTP的開放，而Bcl-2具有競爭性結(jié)合ANT的作用發(fā)揮抗凋亡作用[21]，同時，Bcl-2的表達(dá)提升具有抑制ROS生成的作用，阻斷下游Caspase級聯(lián)凋亡的活化，進(jìn)一步發(fā)揮凋亡抑制作用[22]。本研究同時測定了Bax與Bcl-2的表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)桑黃素預(yù)處理在心肌過氧化損傷過程中可有效降低Bax的表達(dá)、提升Bcl-2的表達(dá)。

綜合上述，桑黃素可能通過調(diào)控凋亡相關(guān)通路抑制MPTP開放發(fā)揮對雙氧水致心肌細(xì)胞氧化損傷的保護(hù)作用。