泰山蛹蟲草多糖對高脂高膽固醇誘導(dǎo)ob/ob小鼠非酒精性脂肪肝的影響

陳 昊，賈修濱，司艷紅，李彩柳，張 穎

(山東第一醫(yī)科大學(xué)·山東 濟南 250117)

目前，非酒精性脂肪肝(nonalcoholic fatty liver disease, NAFLD)發(fā)病率和早期診斷率逐年上升，且呈低齡化趨勢，全球患病率約25%，已成為發(fā)病最為普遍的一種慢性肝臟疾病，是世界性的公共的衛(wèi)生問題[1]。NAFLD與肝損傷和代謝紊亂密切相關(guān)[2]，主要源于肝臟內(nèi)脂肪堆積與變性以及由此引發(fā)的氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)，其中肝臟三酰甘油(TG)的含量增多是NAFLD的標(biāo)志性特征[3]，而游離脂肪酸(FFA)的過度攝取，最終會導(dǎo)致肝臟TG 增多[4]。NAFLD主要通過改變飲食和生活方式、去除疾病誘因等基礎(chǔ)防治手段進行干預(yù)，臨床上仍缺乏特效藥物[5]。因此，NAFLD的新藥開發(fā)具有重要的現(xiàn)實意義。

蛹蟲草又稱北蟲草、北冬蟲夏草、蛹草、蛹草菌、東北蟲草等[6]，蛹蟲草多糖(Cordyceps militaris polysaccharide, CMPS)是其主要活性成分，具有多種生物活性。課題組前期研究證實，CMPS可顯著降低細胞膽固醇(TC)水平[7]，促進CETP-tg小鼠膽固醇逆轉(zhuǎn)運(reverse cholesterol transport, RCT)，調(diào)控脂質(zhì)代謝[8]。基于上述研究，提示蛹蟲草多糖對肝臟脂質(zhì)具有調(diào)控作用。本實驗擬選用高脂高膽固醇誘導(dǎo)的肥胖型ob/ob小鼠作為動物模型，評價CMPS純品對脂質(zhì)代謝及肝功能的影響。

1 材料與方法

1.1 材料 SPF級8 周齡雄性ob/ob小鼠購于北京華阜康生物科技有限公司，體質(zhì)量(40±5)g，實驗動物許可證號：SCXK(京)2019-0008。小鼠飼養(yǎng)于濕度50%～60%、溫度(22±1)℃環(huán)境中，12 h/12 h循環(huán)光照。動物實驗遵循山東第一醫(yī)科大學(xué)實驗動物道德倫理委員會有關(guān)規(guī)定。蛹蟲草購于泰安市岱珍生物科技有限公司，經(jīng)山東第一醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院蘇延友教授鑒定為蟲草屬(Cordycps)真菌蛹蟲草[Cordycepsmilitaris(L.)Link]的子實體。常溫晾干，粉碎成粗粉(40目)，多糖的提取參照課題組以往方法[6]。非諾貝特購于索萊寶生物科技有限公司(純度≥99%)。小鼠高脂高膽固醇飼料訂制于北京華阜康生物科技有限公司。SOD、MDA、ALT、AST試劑盒：南京建成生物科技有限公司；TG、TC試劑盒：中生北控生物科技有限公司；FFAs試劑盒：朗頓，BPE20248。Hei-VAP Expert Control/Ultimate Control旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：德國Heidolph；FD8508真空冷凍干燥機：韓國Ilshin；Varioskan LUX多功能酶標(biāo)儀：Thermo Fisher；BX51倒置熒光顯微鏡：日本奧林帕斯；F6/10勻漿器：上海氟魯克；CUT4062石蠟切片機：德國萊卡。

1.2 動物分組、造模及給藥 雄性 ob/ob 小鼠40 只隨機分為模型組(Model)、非諾貝特組[20 mg/(kg·d)](Fenofibrate)及蛹蟲草多糖[25、50、100 mg/(kg·d)](Low,Middle,High)組，每組8只，均以高脂高膽固醇飼料(脂肪34.90%，膽固醇26.20%)飼養(yǎng)。藥物采用 3%羧甲基纖維素鈉溶解后，經(jīng)口灌胃給予相應(yīng)劑量，模型組同時給予一定劑量 3%羧甲基纖維素鈉，連續(xù)用藥12 周后處死小鼠，進行相關(guān)指標(biāo)檢測。

1.3 觀察指標(biāo)及檢測方法

1.3.1 小鼠一般情況記錄 記錄小鼠日食量、每周體質(zhì)量變化，用藥末處死小鼠，記錄肝臟重量，計算肝指數(shù)。

1.3.2 血脂檢測 末次給藥后，小鼠禁食12 h，內(nèi)眥取血，酶法檢測血清TC、TG、HDL-C水平，TC 減去 HDL-C即為Non-HDL-C 水平。

1.3.3 肝組織相關(guān)指標(biāo)檢測 4 ℃條件下，稱取適量新鮮肝臟于PBS中勻漿，離心勻漿液(1 000 g)15 min，取上清液，BCA測定肝組織蛋白含量；賴氏法檢測肝組織中谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)與谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)活力；分別采用WST-1法和TBA法檢測肝組織(SOD)活性和(MDA)含量；酶法測定上清液中TG、TC含量，ELISA方法檢測游離脂肪酸(FFAS)含量；另取部分新鮮肝臟10%甲醛固定，石蠟包埋，組織切片(5 μm)，HE染色后進行病理學(xué)檢測。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法 統(tǒng)計學(xué)分析采用t檢驗，實驗結(jié)果采用平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，P<0.05視為有顯著性差異。

2 結(jié)果

2.1 蛹蟲草多糖對高脂高膽固醇o(jì)b/ob小鼠日食量和體質(zhì)量的影響 各組小鼠平均日食量基本相同，與模型組相比，無顯著變化。前5周，各組體質(zhì)量差異不明顯。自第6～12周末，多糖高劑量組與非諾貝特組體質(zhì)量明顯低于模型組(P<0.05)。見圖1～圖2。

圖1 各組ob/ob小鼠日食量變化

注：與模型組比較，*P<0.05圖2 各組ob/ob小鼠體質(zhì)量變化

2.2 蛹蟲草多糖對高脂高膽固醇飲食ob/ob小鼠血脂的影響 見表1。

表1 各組ob/ob小鼠血脂水平比較

2.3 蛹蟲草多糖對高脂高膽固醇飲食ob/ob小鼠肝臟指數(shù)及脂質(zhì)的影響

2.4 蛹蟲草多糖對高脂高膽固醇飲食ob/ob小鼠肝組織病理變化的影響 HE染色結(jié)果顯示，模型組肝細胞內(nèi)出現(xiàn)大量脂滴，部分肝細胞甚至出現(xiàn)壞死。

表2 各組ob/ob小鼠肝臟指數(shù)和肝組織TC、TG、FFA水平比較

蛹蟲草多糖劑量依賴性地改善肝組織脂肪變性，高劑量多糖組肝組織中央靜脈和小葉結(jié)構(gòu)清晰可見。見圖3。

圖3 各組ob/ob小鼠肝組織病理變化(HE，×200)

2.5 蛹蟲草多糖對高脂高膽固醇飲食ob/ob小鼠肝組織氧化應(yīng)激的影響 見表3。

表3 各組ob/ob小鼠肝組織SOD活性、MDA含量的比較

2.6 蛹蟲草多糖對高脂高膽固醇飲食ob/ob小鼠肝功能的影響 見表4。

表4 各組ob/ob小鼠肝組織ALT、AST水平的比較

3 討論

NAFLD 被認(rèn)為是代謝性疾病。2020年國際上將 NAFLD 更名為代謝相關(guān)脂肪性肝病(metabolic associated fatty liver disease, MAFLD)[9]。肝臟作為脂質(zhì)代謝的重要器官，主要負(fù)責(zé)脂肪酸的攝取、脂肪酸的合成以及脂肪酸向其他組織的輸出及重新分布[3]。肝臟脂肪變性是導(dǎo)致非酒精性脂肪肝的最主要因素，主要表現(xiàn)為肝臟 TG 增多[10-11]。而肝臟脂肪酸的攝取增多和氧化易導(dǎo)致肝臟 TG 異常增多和脂肪變性，在氧化應(yīng)激和脂質(zhì)過氧化等作用下肝細胞最終發(fā)生損傷、炎癥、纖維化等病理改變[12]。因此，非酒精性脂肪肝的主要誘因之一就是肝細胞脂肪酸攝取增多導(dǎo)致的脂肪變性。

目前，臨床仍缺乏 NAFLD 的有效治療藥物，主要通過飲食、運動等生活方式調(diào)控和防治。我國地域遼闊，藥用植物資源豐富，部分天然藥物富含活性成分，在調(diào)控脂質(zhì)代謝和非酒精性脂肪肝方面功能顯著[13-16]。本實驗結(jié)果顯示，泰山蛹蟲草多糖可顯著抑制肝臟攝取FFA，降低肝組織TG 含量。另外，通過減少氧化物質(zhì)MDA含量和升高抗氧化物質(zhì)SOD活性抗氧化應(yīng)激反應(yīng)。因此，泰山蛹蟲草多糖可通過調(diào)控血脂代謝和氧化應(yīng)激，改善高脂高膽固醇飲食誘導(dǎo)的脂質(zhì)蓄積和肝臟功能，降低NAFLD患病風(fēng)險。今后將進一步明確其防治非酒精性脂肪肝的分子機制和作用靶點。