毛細管電泳-激光誘導(dǎo)熒光法測定細胞中谷胱甘肽

門 雪, 吳成新, 陳明麗, 王建華

(東北大學(xué)理學(xué)院化學(xué)系分析科學(xué)研究中心, 遼寧 沈陽 110819)

谷胱甘肽(GSH)是一種人體內(nèi)較豐富的含巰基的三肽化合物,在人體代謝中發(fā)揮重要的作用,如解毒作用和抗氧化作用等[1-5]。砷(As)和鉻(Cr)是工業(yè)上常用的兩種重金屬[6,7],其中As(Ⅲ)和Cr(Ⅵ)毒性較強且會通過呼吸道、消化道等方式進入人體而產(chǎn)生氧化應(yīng)激反應(yīng),從而引起人體內(nèi)GSH的變化[8,9]。人體內(nèi)GSH的水平變化與多種疾病密切相關(guān)[10],如糖尿病、帕金森氏癥和阿爾茨海默氏癥等,研究發(fā)現(xiàn),腦谷胱甘肽是輕度認知障礙和阿爾茨海默氏癥的一種新的生物標(biāo)志物[11]?，F(xiàn)在臨床上常用的GSH分析檢測方法包括電化學(xué)法[12]、熒光法[13]、高效液相色譜-質(zhì)譜法[14,15]、酶分析法[16,17]等。

毛細管電泳(CE)是一種具有納升級樣品量和較高分辨率等優(yōu)點的現(xiàn)代分離分析技術(shù),在生物樣品尤其是細胞檢測中具有極大的優(yōu)勢。激光誘導(dǎo)熒光法(LIF)是一種靈敏度極高的檢測器,因激光易于聚焦,具有高強度和單色性等特點,尤其適合與樣品量極少的毛細管電泳聯(lián)用。CE-LIF聯(lián)用法具有靈敏度高、樣品量小和設(shè)備簡單易造等特點,尤其適合細胞內(nèi)GSH的定量分析[18]。然而,上述方法中使用了乙腈等有機溶劑,有機溶劑的揮發(fā)會導(dǎo)致方法的穩(wěn)定性較差。

本文構(gòu)建了毛細管電泳-激光誘導(dǎo)熒光檢測系統(tǒng),優(yōu)化了緩沖溶液的成分和其他實驗條件,建立了一種穩(wěn)定且靈敏的GSH檢測方法。研究了肝癌細胞(HepG2)內(nèi)GSH含量與金屬形態(tài)和濃度之間的關(guān)系,從結(jié)果可以看出,細胞內(nèi)GSH水平的變化,在一定程度上可以用來評估細胞毒性。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

構(gòu)建毛細管電泳-激光誘導(dǎo)熒光檢測系統(tǒng),如圖1所示,其中,未修飾的熔融石英毛細管(內(nèi)徑50 μm,外徑360 μm,總長度29.5 cm,有效長度25.5 cm,河北永年銳灃色譜器件有限公司)作為分離毛細管。激光誘導(dǎo)熒光檢測器為實驗室基于共聚焦模式自主搭建[19],其主要參數(shù)如下:473 nm激光(20 mW,遠明激光,寧波)作為光源,激發(fā)光濾光片為470 nm的帶通濾光片(匯博光學(xué),沈陽),二向色鏡截止波長為500 nm(匯博光學(xué)),聚焦物鏡為40 X平場物鏡(型號NA. 0.6,工作距離3.98 mm,大悅維佳,北京),發(fā)射光濾光片為535 nm的帶通濾光片(匯博光學(xué)),采光針孔孔徑為0.4 mm,以光電倍增管(H10722-20,濱松,日本)作為光電探測器進行光信號采集和轉(zhuǎn)換,以數(shù)據(jù)采集卡(USB-6009, National Instruments,美國)及實驗室在LabVIEW平臺編寫的相關(guān)軟件進行儀器控制及數(shù)據(jù)采集。Allegra高速冷凍離心機和HERA Cell 150細胞培養(yǎng)箱分別購自美國Beckman Coulter公司和美國Thermo Scientific公司。SynergyH1酶標(biāo)儀和BX53M正置顯微鏡購自美國BioTek公司和日本Olympus公司。KQ-100DB超聲波清洗器和08-Ⅲ非接觸式超聲波細胞破碎儀分別購自江蘇昆山市超聲儀器有限公司和寧波新芝生物科技股份有限公司。XPE105DR分析天平購自上海梅特勒-托利多國際有限公司。

圖 1 毛細管電泳-激光誘導(dǎo)熒光檢測裝置示意圖Fig. 1 Schematic diagram of capillary electrophoresis-laser induced fluorescence detection device

硼砂(borate)、氫氧化鈉(NaOH)、十六烷基三甲基溴化銨(CTAB)、β-環(huán)糊精(β-CD)、亞砷酸鈉、砷酸氫二鈉、氯化鉻和重鉻酸鉀均購自國藥集團化學(xué)試劑有限公司,2,3-萘二甲醛(NDA)、谷胱甘肽、十二烷基硫酸鈉(SDS)、曲拉通X100(Triton X100)、二甲基亞砜(DMSO)、鹽酸(HCl)、乙腈(色譜級)和甲醇(色譜級)購自上海阿拉丁生化科技股份有限公司。三羥甲基氨基甲烷(Tris)、達爾伯克(氏)改良伊格爾(氏)(DMEM)培養(yǎng)基、磷酸緩沖鹽溶液(PBS)購自美侖生物技術(shù)有限公司,胎牛血清、抗生素(鏈霉素和青霉素)分別購自美國Clark和HyClone公司。HepG2細胞購自武漢普諾賽生命科技有限公司。實驗室用水由Milli-Q超純水系統(tǒng)(美國Millipore公司)制備。除標(biāo)有純度的試劑外,以上試劑均為分析純。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

準(zhǔn)確稱取適量GSH固體,溶于超純水中,配制成10.00 mmol/L的GSH溶液備用,4 ℃避光保存。取適量GSH標(biāo)準(zhǔn)儲備液,用超純水稀釋成濃度分別為0.01、0.05、0.20、0.50、1.00、2.00、5.00、20.00 μmol/L的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液。

1.3 樣品預(yù)處理

1.3.1細胞培養(yǎng)

HepG2培養(yǎng)基由50 mL胎牛血清(10%, v/v)、5 mL抗生素(青霉素100 U/mL,鏈霉素100 μg/mL)加入到450 mL DMEM高糖培養(yǎng)基中混合而成。HepG2細胞于37 ℃、5% CO2細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.3.2細胞活力的測定

將HepG2細胞接種在96孔板中貼壁生長,然后加入As(Ⅲ)、As(Ⅴ)、Cr(Ⅲ)和Cr(Ⅵ)溶液(0、2、5、10、20、50和100 mg/L)孵育6 h。用PBS清洗兩次,加入100 μL含有0.05 mg/mL噻唑藍(MTT)的培養(yǎng)基繼續(xù)孵育4 h。隨后,除去培養(yǎng)基,并在每個孔里加入150 μL DMSO(溶解甲瓚晶體),使用酶標(biāo)儀在570 nm處測量每孔的吸光度。

1.3.3砷和鉻孵育的細胞樣品制備

將HepG2細胞分別接種在25 cm2的培養(yǎng)瓶中以貼壁生長,再加入As(Ⅲ)、As(Ⅴ)、Cr(Ⅲ)和Cr(Ⅵ)溶液(2和5 mg/L)孵育6 h,同時設(shè)置空白對照組。用PBS清洗3次后,收集細胞,凍干后,加入100 μL背景緩沖溶液,超聲裂解后進行超速離心(12 000 r/min, 15 min),收集細胞裂解液并存放于-80 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.3.4GSH的標(biāo)記和胞內(nèi)成像

標(biāo)記GSH:采用文獻報道的GSH標(biāo)記方法[20],并對該方法進行了優(yōu)化。在背景緩沖溶液(20 mmol/L硼砂和2 mmol/Lβ-CD, pH 9.2)中加入1 μL GSH標(biāo)準(zhǔn)溶液(10 μmol/L)和細胞裂解液,然后加入100 μmol/L的NDA溶液,反應(yīng)5 min后,樣品注入分離毛細管。

胞內(nèi)GSH成像:將HepG2細胞分別接種在96孔板中貼壁生長,再加入5 mg/L As(Ⅲ)、As(Ⅴ)、Cr(Ⅲ)和Cr(Ⅵ)溶液孵育6 h。經(jīng)PBS清洗2次后,每個孔里加入200 μL 1 mmol/L的NDA溶液,室溫下避光孵育10 min。經(jīng)PBS清洗3次以終止染色。最后,在每個孔里加入500 μL PBS,在正置顯微鏡下觀察和記錄,放大倍數(shù)為10倍。

1.4 實驗條件與數(shù)據(jù)處理

1.4.1CE-LIF條件

毛細管在使用前依次用甲醇、超純水、0.1 mol/L NaOH、超純水、0.1 mol/L HCl、超純水各沖洗10 min。每次進樣前,用0.1 mol/L NaOH、超純水和背景緩沖溶液沖洗1 min。重力進樣,抬高10 cm,進樣10 s,室溫20 ℃下,陽極進樣,陰極檢測,電壓為14 kV,激發(fā)波長為473 nm,發(fā)射波長為528 nm。背景緩沖溶液、GSH標(biāo)準(zhǔn)溶液和細胞裂解液在電泳之前需經(jīng)0.22 μm微孔濾膜(水系)過濾,并超聲脫氣5 min。

1.4.2數(shù)據(jù)處理

GSH的定量數(shù)據(jù)通過實驗室的電泳分析軟件計算峰面積后,再用Excel和GraphPad Prism進行繪圖和統(tǒng)計分析。電泳圖直接由Origin Pro2016繪制。

2 結(jié)果與討論

2.1 電泳條件優(yōu)化

2.1.1緩沖溶液種類和pH值的影響

電泳緩沖溶液對標(biāo)記反應(yīng)和電泳性能起著至關(guān)重要的作用。為了選擇合適的緩沖溶液,使用酶標(biāo)儀考察了在20 mmol/L的硼砂和Tris兩種緩沖溶液(Tris pH 7.4和pH 9.2,硼砂pH 9.2)下GSH(10.00 μmol/L)與NDA(100 μmol/L)的反應(yīng)動力學(xué)。每個條件運行時間30 min,時間間隔1 min,激發(fā)波長設(shè)為473 nm,發(fā)射波長設(shè)為528 nm,檢測高度為4.4 mm。結(jié)果如圖2所示,在硼砂緩沖液中(pH 9.2), NDA自身不發(fā)熒光,當(dāng)加入GSH后,NDA衍生GSH產(chǎn)生熒光產(chǎn)物[20],在5 min內(nèi)達到反應(yīng)平衡且在30 min內(nèi)保持穩(wěn)定,而在Tris緩沖液中(pH 9.2), GSH與NDA反應(yīng)在25 min達到平衡,平衡時NDA-GSH的熒光強度也弱于在硼砂緩沖液(pH 9.2)中的熒光強度。在pH為7.4的Tris緩沖液中,反應(yīng)平衡時間相較于在pH為9.2的Tris緩沖液中縮短10 min,但熒光強度較弱?？紤]到反應(yīng)時間和熒光強度,選擇pH為9.2的硼砂緩沖液作為GSH電泳分析的緩沖液。

圖 2 背景緩沖液對GSH與NDA反應(yīng)動力學(xué)的影響(n=3)Fig. 2 Effect of background buffers on reaction kinetics of NDA-GSH (n=3) NDA: 2,3-naphthalenedicarboxaldehyde; GSH: glutathione; Tris: tris(hydroxymethyl)aminomethane.

2.1.2添加劑的選擇和條件優(yōu)化

為了在保證電泳穩(wěn)定性的同時提高NDA-GSH的靈敏度,使用酶標(biāo)儀考察了在20 mmol/L硼砂緩沖液中加入10 mmol/L SDS、5 mmol/L CTAB、5 mmol/L Triton X100和10 mmol/Lβ-CD時NDA-GSH的靈敏度。圖3a和3b中,反應(yīng)動力學(xué)的參數(shù)設(shè)置與2.1.1節(jié)相同，NDA-GSH的發(fā)射光譜是NDA與GSH衍生5 min后,在激發(fā)波長為473 nm下獲得的。結(jié)果表明,在硼砂緩沖液中加入以上4種添加劑后,NDA-GSH的靈敏度都有所提高,NDA-GSH的發(fā)光特性沒有明顯改變,發(fā)射波長保持在528 nm左右。當(dāng)CTAB和β-CD加入后,NDA-GSH的靈敏度明顯提高。SDS和Triton X100的加入也對提高NDA-GSH的靈敏度有所幫助,但是平衡時間在10 min內(nèi)。綜合考慮反應(yīng)時間和靈敏度,進一步在緩沖液中加入CTAB和β-CD進行電泳實驗。如圖3c所示,當(dāng)加入CTAB后,沒有樣品峰出現(xiàn),可能是CTAB作為一種陽離子型表面活性劑,改變了電滲流的方向。當(dāng)加入β-CD后,NDA-GSH的信號明顯增強,遷移時間也縮短至3 min內(nèi)。于是,進一步考察了β-CD的濃度對NDA-GSH靈敏度的影響。隨著β-CD濃度的增加,NDA-GSH的遷移時間縮短,其信號強度先增大后減小,在β-CD濃度為2 mmol/L時,NDA-GSH的信號最強(見圖3c)。因此,最終使用的背景緩沖溶液組成為20 mmol/L硼砂和2 mmol/Lβ-CD的混合溶液。

圖 3 硼砂緩沖液中的添加劑對NDA-GSH靈敏度的影響Fig. 3 Influence of additives in borate buffer on the sensitivity of NDA-GSH a. reaction kinetics of GSH with NDA (n=3); b. emission spectra of NDA-GSH; c. electrophoretograms of NDA-GSH. SDS: sodium dodecyl sulfate; CTAB: cetyl trimethyl ammonium bromide; β-CD: β-cyclodextrin. Peak identification: ※ NDA-GSH.

2.2 方法性能

2.2.1分析性能

采用1.2節(jié)的方法,制備0.01、0.05、0.20、0.50、1.00、2.00、5.00、20.00 μmol/L的GSH標(biāo)準(zhǔn)溶液,在優(yōu)化的條件下,每份溶液平行3次,用實驗室的電泳分析軟件對峰面積積分,以峰面積為縱坐標(biāo)(y), GSH的濃度為橫坐標(biāo)(x, μmol/L),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果表明,GSH在0.01～20.00 μmol/L范圍內(nèi),與峰面積呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系,回歸方程為y=0.21x+0.000 4,相關(guān)系數(shù)為0.999 3。以信噪比為3(S/N=3)和10(S/N=10)確定GSH的檢出限和定量限,分別為0.006 μmol/L和0.020 μmol/L。與現(xiàn)有的文獻[20]相比,該方法GSH的檢測靈敏度提高了約40倍。

2.2.2準(zhǔn)確度和精密度

以稀釋200倍的空白細胞裂解液為基質(zhì)進行低、中、高3個水平的加標(biāo)回收試驗,加標(biāo)濃度分別為0.10、1.00、10.00 μmol/L,在優(yōu)化的條件下,每個水平平行測定3次。結(jié)果如表1所示,GSH的回收率為95.7%～112.6%,精密度為3.8%～5.0%,表明該方法的準(zhǔn)確性和重復(fù)性良好,證明了其在細胞內(nèi)GSH分析中的可靠性。

表 1 GSH在細胞裂解液中的加標(biāo)回收率和精密度(n=3)Table 1 Spiked recoveries and relative standard deviations (RSDs) of GSH in cell lysate (n=3)

2.3 砷和鉻對HepG2細胞內(nèi)GSH水平的影響

2.3.1細胞活性和形態(tài)

為了研究砷和鉻對HepG2細胞產(chǎn)生的毒性大小與細胞內(nèi)GSH含量的關(guān)系,首先考察了不同價態(tài)的砷和鉻對細胞的活性影響(見圖4)。從圖4可知,在研究的濃度范圍內(nèi),As(Ⅲ)和Cr(Ⅵ)對細胞的毒性隨濃度的增加逐漸增大,而As(Ⅴ)和Cr(Ⅲ)沒有表現(xiàn)出對細胞有明顯的毒性。質(zhì)量濃度為5 mg/L的As(Ⅲ)、As(Ⅴ)、Cr(Ⅲ)和Cr(Ⅵ)對細胞刺激后的細胞活性分別為96%、98%、96%和89%。4種元素形態(tài)對細胞產(chǎn)生的毒性大小順序為:Cr(Ⅵ)>As(Ⅲ)≈Cr(Ⅲ)>As(Ⅴ)?？疾炝? mg/L(低劑量)和5 mg/L(高劑量)的4種元素形態(tài)對細胞內(nèi)GSH含量的影響。根據(jù)文獻[21]報道,細胞內(nèi)GSH的含量隨著暴露金屬濃度的增加而減少。因此,考察了高劑量的4種元素刺激細胞時的細胞成像效果。如圖4所示,以高劑量刺激細胞仍然可以檢測到NDA-GSH的熒光信號,表明以高劑量刺激細胞確保了細胞內(nèi)可檢測的GSH,并且不會影響細胞的形態(tài)。另外,通過Image J軟件進行平均熒光強度分析,5 mg/L的As(Ⅲ)、As(Ⅴ)、Cr(Ⅲ)和Cr(Ⅵ)對細胞刺激后的胞內(nèi)NDA-GSH的平均熒光強度值依次為69.9、54.1、62.6、54.7和48.5。平均熒光強度值越大,說明GSH含量越高。Cr(Ⅵ)刺激后胞內(nèi)的NDA-GSH熒光強度最低,說明胞內(nèi)GSH含量最低,并且Cr(Ⅵ)的細胞毒性最強。初步表明細胞毒性越強,其胞內(nèi)GSH含量越低。

圖 4 (a)HepG2細胞的細胞活性(n=4)和(b)胞內(nèi)GSH成像Fig. 4 (a) Cell viability (n=4) and (b) intracellular GSH imaging of HepG2 cells HepG2 cells were stimulated with As(Ⅲ), As(Ⅴ), Cr(Ⅲ) and Cr(Ⅵ) for 6 h.

2.3.2砷和鉻的形態(tài)和濃度對HepG2細胞內(nèi)GSH含量的影響

用構(gòu)建的毛細管電泳-激光誘導(dǎo)熒光系統(tǒng)研究了砷和鉻的形態(tài)和濃度對HepG2細胞內(nèi)GSH含量的影響。以低劑量和高劑量As(Ⅲ)、As(Ⅴ)、Cr(Ⅲ)和Cr(Ⅵ)刺激HepG2細胞6 h后,在優(yōu)化的電泳條件下,胞內(nèi)的GSH含量和細胞裂解液電泳結(jié)果如圖5所示,通過與標(biāo)準(zhǔn)品電泳譜圖的遷移時間比對和標(biāo)準(zhǔn)加入法來鑒別細胞裂解液中的GSH。通過統(tǒng)計學(xué)分析,相比對照組,以低劑量和高劑量的As(Ⅲ)、As(Ⅴ)和Cr(Ⅲ)刺激細胞,胞內(nèi)GSH的含量變化沒有顯著差異。然而,相比對照組,以高劑量Cr(Ⅵ)刺激細胞,胞內(nèi)GSH的含量顯著降低(P<0.01),并且胞內(nèi)GSH的含量與以高劑量Cr(Ⅲ)刺激細胞時具有明顯差異(P<0.05)。這進一步表明了細胞毒性越大,胞內(nèi)GSH的含量越低。

圖 5 (a)HepG2細胞內(nèi)的GSH含量的統(tǒng)計分析(n=3)和(b)細胞裂解液的電泳圖Fig. 5 (a) Statistical analysis of GSH content in HepG2 cells (n=3) and (b) electrophoretograms of the cell lysate a. HepG2 cells were stimulated by As(Ⅲ), As(Ⅴ), Cr(Ⅲ) and Cr(Ⅵ) for 6 h (n=3, t-test, **P<0.01, * P<0.05, comparison of differences between the two groups).

3 結(jié)論

本研究建立了一種毛細管電泳-激光誘導(dǎo)熒光檢測HepG2細胞中GSH含量的方法。通過該方法研究了砷和鉻的形態(tài)和濃度對HepG2細胞內(nèi)GSH含量的影響,以毒性較強的高劑量Cr(Ⅵ)刺激細胞導(dǎo)致胞內(nèi)GSH含量顯著降低,表明胞內(nèi)GSH含量與細胞毒性相關(guān),即細胞毒性越大,胞內(nèi)GSH的含量越低。該方法靈敏度高,穩(wěn)定性好，準(zhǔn)確度高,為重金屬的濃度監(jiān)測和評估重金屬對細胞的毒性影響提供了新的手段。