改進(jìn)的QuEChERS-UPLCMSMS測(cè)定姜中32種氨基甲酸酯類(lèi)農(nóng)藥

唐翩翩，支紅峰*，朱玉真

永康市食品藥品檢驗(yàn)檢測(cè)中心（永康 321300）

氨基甲酸酯類(lèi)農(nóng)藥是三大農(nóng)藥種類(lèi)之一，隨著諸多劇毒有機(jī)磷和有機(jī)氯農(nóng)藥的逐步禁用，氨基甲酸酯類(lèi)農(nóng)藥在蔬菜上的應(yīng)用占比越來(lái)越高[1]，雖然殺蟲(chóng)效果顯著，但是有急性毒性作用，在農(nóng)產(chǎn)品中的殘留會(huì)對(duì)人畜危害嚴(yán)重[2-3]。其前處理方式主要包括：固相萃取、在線固相萃取、基質(zhì)固相分散萃取、凝膠滲透色譜、加速溶劑萃取和QuEChERS法[4-5]等。其中QuEChERS法有著明顯的效率和經(jīng)濟(jì)方法的優(yōu)勢(shì)。但是它凈化效果相對(duì)不好，基質(zhì)效應(yīng)強(qiáng)。目前關(guān)于QuECh-ERS法基質(zhì)效應(yīng)的研究較多，但是對(duì)于消除基質(zhì)效應(yīng)的研究較少[6]。應(yīng)用QuEChERS檢測(cè)果蔬農(nóng)殘的國(guó)家安全標(biāo)準(zhǔn)和文獻(xiàn)，定量方式均為基質(zhì)標(biāo)定量。文章計(jì)劃優(yōu)化方法條件，并結(jié)合稀釋?zhuān)⒁环N溶劑標(biāo)定量的方法，增加方法的適用性和便捷性。

1 材料與方法

1.1 主要材料與儀器

標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)：滅多威，丁硫克百威，異丙威，甲硫威，三羥基克百威，殺線威，呋線威，猛殺威，硫雙威，惡蟲(chóng)威，乙硫苯威，苯氧威，涕滅威等32種農(nóng)藥均為100 μg/mL，購(gòu)自農(nóng)業(yè)部環(huán)境保護(hù)科研監(jiān)測(cè)所。

試劑：乙腈、甲醇（色譜純，美國(guó)默克公司）；甲酸（質(zhì)譜級(jí)，美國(guó)Sigma公司）；乙酸銨（質(zhì)譜純，美國(guó)Sigma公司）；水（屈臣氏）；提取包（6 g無(wú)水硫酸鎂，1.5 g乙酸鈉）；凈化管[a）50 mg C18，50 mg PSA，150 mg MgSO4；b）50 mg PSA，50 mg GCB，150 mg MgSO4；c）25 mg PSA，2.5 mg GCB，150 mg MgSO4；d）50 mg PSA，150 mg MgSO4]：博納艾杰爾科技有限公司；生姜（市售）。

LC-30AD/API 5500高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀（島津液相/美國(guó)AB質(zhì)譜）；BSA822電子天平（德國(guó)賽多利斯股份公司）；Allegra 64R冷凍離心機(jī)（美國(guó)貝克曼庫(kù)爾特有限公司）；E0F0-945066多管漩渦混合器（美國(guó)Talboys）；K600食品加工機(jī)（德國(guó)博朗）。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

1.2.1.1 溶劑標(biāo)的配制

將標(biāo)液用色譜級(jí)甲醇溶解稀釋并定容成10 μg/mL，冷藏保存（0～4 ℃）。使用前配制成不同濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)工作液。

1.2.1.2 基質(zhì)標(biāo)的配制

取空白樣品，按照1.2.2小節(jié)前處理方式，取得上機(jī)液。按照不同的稀釋比，用甲醇稀釋?zhuān)渲苹|(zhì)標(biāo)。

標(biāo)液過(guò)0.22 μm PTEF濾膜上機(jī)。

1.2.2 樣品前處理

準(zhǔn)確稱(chēng)取15 g（精確至0.01 g）均質(zhì)后的樣品于干凈離心管中，放入一顆均質(zhì)子，加入15 mL乙腈。用多管渦旋混合器按2 500 r/min振蕩20 min，加入提取包，振蕩2 min后，按8 000 r/min離心5 min。取1 mL上清液，加入凈化管中，用多管渦旋混合器渦旋凈化1 min，按4 000 r/min離心。將離心后上清液，按照稀釋比用甲醇稀釋處理。處理后上清液過(guò)0.22 PTEF濾膜待上機(jī)。

1.2.3 儀器條件

1.2.3.1 色譜條件

色譜柱：Shim-pack XR-ODSⅢ 2.0 mm×150 mm，2.2 μm；水相流動(dòng)相（流動(dòng)相A）：0.1%甲酸-5 mmol/L乙酸銨；有機(jī)流動(dòng)相（流動(dòng)相B）：甲醇；流速：0.2 mL/min；柱溫：40 ℃；進(jìn)樣量：2 μL；梯度洗脫程序：流動(dòng)相A為0.1%甲酸-5 mmol/L乙酸銨水溶液，流動(dòng)相B為甲醇；初始流動(dòng)相1% B，1 min 35% B，6～10 min 37% B，7 min 45% B，23～26 min 98% B，26.1～29 min 1% B，29.1 min STOP。

1.2.3.2 質(zhì)譜條件

正離子模式，離子源：ESI；噴霧電壓（IS）：5 500 V；霧化器壓力（GS1）：45 psi；氣簾氣壓力（CUR）：38 psi；輔助氣壓力（GS2）：45 psi；離子源溫度（TEM）：500 ℃。

2 結(jié)果與分析

2.1 儀器條件的優(yōu)化

2.1.1 液相色譜條件的選擇

2.1.1.1 流速和梯度的調(diào)整

32種農(nóng)藥均為氨基甲酸酯類(lèi)農(nóng)藥，有較多的同分異構(gòu)體，如涕滅威和丁酮威、丁酮威砜和涕滅威砜等。為了更好地分離，使用了1%的有機(jī)相作為初始流動(dòng)相，同時(shí)在1～7 min采取了比較緩和的梯度，便于涕滅威和丁酮威的分離。最終確定表1的梯度洗脫方案，并考察了流速，比較了0.2和0.3 mL/min的流速，采用了分離效果較好的0.2 mL/min的流速。

2.1.1.2 進(jìn)樣體積

在同樣的條件下，進(jìn)樣體積越小，目標(biāo)物更易得到較高的離子化程度，使得基質(zhì)效應(yīng)更低[7]。較高的進(jìn)樣量也會(huì)增加溶劑效應(yīng)。經(jīng)試驗(yàn)總結(jié)，確定進(jìn)樣體積為2 μL。

2.1.2 質(zhì)譜參數(shù)的優(yōu)化

針泵進(jìn)樣，優(yōu)化出農(nóng)藥的子母離子、儀器參數(shù)等。根據(jù)備選子離子的受干擾和實(shí)際響應(yīng)情況，對(duì)備選的子離子進(jìn)一步篩選，確定檢測(cè)用子離子。涕滅威和殺線威選用[M+NH4]+。文章還考察了丁酮威的[M+NH4]+和[M+Na]+。在該文條件，丁酮威的[M+Na]+的子離子與[M+NH4]+的子離子相比，響應(yīng)更好，且被涕滅威子離子干擾較小。故丁酮威選擇了[M+Na]+為檢測(cè)母離子。優(yōu)化后的質(zhì)譜參數(shù)見(jiàn)表1。32種氨基甲酸酯類(lèi)總提取離子色譜圖見(jiàn)圖1。

圖1 32種氨基甲酸酯類(lèi)總提取離子色譜圖

表1 質(zhì)譜參數(shù)表

接表1

2.2 前處理?xiàng)l件優(yōu)化

2.2.1 凈化方式的選擇

QuEChERS凈化材料有GCB，PSA，C18。C18凈化劑屬于反相吸附劑，可以除去脂肪、類(lèi)脂。PSA凈化劑可以有效去除樣品中脂肪酸、某些極性親脂性色素、蠟質(zhì)和糖類(lèi)等。而GCB可以吸附平面結(jié)構(gòu)的色素和甾醇，在吸附色素方面，有另外兩種凈化材料不可比擬的效果。試驗(yàn)取1 mL提取液凈化，考察了四種凈化方式：a）50 mg C18，50 mg PSA，150 mg MgSO4；b）50 mg PSA，50 mg GCB，150 mg MgSO4；c）25 mg PSA，2.5 mg GCB，150 mg MgSO4；d）50 mg PSA，150 mg MgSO4。

對(duì)試驗(yàn)結(jié)果分析后發(fā)現(xiàn)，從回收率上看，a凈化管與d凈化管相比回收率普遍較差，這表明C18對(duì)氨基甲酸酯類(lèi)農(nóng)藥存在明顯吸附，與馮婉瑩等[5]研究結(jié)果相同。GCB凈化效果明顯，它的添加會(huì)提高響應(yīng)比較差（如久效威）的農(nóng)藥的回收率和重復(fù)性。圖2是姜中久效威四種凈化方式的效果圖。凈化方式b定量離子的信噪比最高，而凈化方式a和d在凈化后仍有干擾。

圖2 姜加標(biāo)樣品在四種（a、b、c、d）凈化方式處理后的久效威兩個(gè)提取離子（219.1/57.0，219.1/76.0）提取離子圖

四種凈化方式的回收率如圖3所示。

圖3 四種凈化方式凈化姜的加標(biāo)回收率

GCB是把雙刃劍，它也會(huì)吸附平面結(jié)構(gòu)的農(nóng)藥[8]。文章發(fā)現(xiàn)GCB對(duì)姜中平面結(jié)構(gòu)農(nóng)藥有吸收。但是吸收與GCB的含量有關(guān)，且對(duì)回收率的影響與其他基質(zhì)相比較少，這可能是因?yàn)榻衅矫娼Y(jié)構(gòu)基質(zhì)（色素等）較多。平面結(jié)構(gòu)的基質(zhì)對(duì)農(nóng)藥起到了保護(hù)作用，減少了GCB對(duì)平面結(jié)構(gòu)農(nóng)藥的吸附。綜合SRSD值考慮，選擇了c作為篩查方法的凈化方式。

2.2.2 稀釋倍數(shù)

根據(jù)液質(zhì)的原理，稀釋會(huì)降低農(nóng)藥的基質(zhì)效應(yīng)[9]。文章嘗試通過(guò)稀釋減少農(nóng)藥基質(zhì)效應(yīng)。試驗(yàn)嘗試了稀釋5倍和稀釋25倍，結(jié)果如圖4所示。

由圖4可以看到。稀釋5倍回收率變化明顯。稀釋25倍大多數(shù)農(nóng)藥回收率變化不大。稀釋同樣使得農(nóng)藥的SRSD值變小。

圖4 稀釋倍數(shù)對(duì)農(nóng)藥回收率的影響

2.3 方法學(xué)評(píng)價(jià)

對(duì)32種農(nóng)藥進(jìn)行3個(gè)濃度水平的加標(biāo)試驗(yàn)，每個(gè)濃度水平重復(fù)6次，具體數(shù)據(jù)見(jiàn)表2。表2中的標(biāo)準(zhǔn)曲線為溶劑標(biāo)曲，加標(biāo)數(shù)據(jù)為溶劑標(biāo)定量結(jié)果。表2中的定量限是結(jié)合加標(biāo)樣品和基質(zhì)標(biāo)曲中農(nóng)藥定量離子響應(yīng)，以信噪比（rSN）為10，確定方法的定量限。

表2 32種農(nóng)藥在生姜基質(zhì)加標(biāo)的平均回收率，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差，線性方程和定量限（n=6）

丁酮威和久效威在50，75和100 μg/kg加標(biāo)。丁酮威回收率75.20%～109.65%，SRSD為7.50%～10.59%，定量限為1.7 μg/kg。久效威回收率在72.64%～80.23%之間，SRSD在8.5%～14.77%之間，檢出限為30 μg/kg。

在試驗(yàn)條件下，三種基質(zhì)中32種農(nóng)藥的平均回收率（63.06%～109.65%）和SRSD（2.08%～14.77%）均滿足GB/T 27404—2008《實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制規(guī)范 食品理化檢測(cè)》[10]的要求。溶劑標(biāo)和基質(zhì)標(biāo)，呈現(xiàn)良好的線性，相關(guān)系數(shù)＞0.99。除久效威外其余農(nóng)藥在10 μg/kg回收率均在80%以上，65%的農(nóng)藥在10 μg/kg加標(biāo)回收在90%以上。32種農(nóng)藥的定量限，除久效威為20 μg/kg，其余農(nóng)藥均在0.05～1.8 μg/kg。

試驗(yàn)結(jié)果表明，相應(yīng)農(nóng)藥的定量限小于文獻(xiàn)中傳統(tǒng)QuEChERS方法的定量限。許文娟等[11]對(duì)5種蔬菜17種氨基甲酸酯類(lèi)農(nóng)藥進(jìn)行檢測(cè)的定量限是2.7～5.5 μg/kg。馮婉瑩等[5]檢測(cè)菠菜中五種氨基甲酸酯類(lèi)農(nóng)藥定量限在0.25～0.5 μg/kg。文獻(xiàn)同時(shí)提到不采用基質(zhì)校正，回收只有40%～50%。久效威定量限為30 μg/kg，也小于文獻(xiàn)中的王連珠等[12]方法的定量限50 μg/kg。陳俊秀等[12]檢測(cè)了胡蘿卜中五種氨基甲酸酯類(lèi)農(nóng)藥，定量限為3～16 μg/kg。這主要是因?yàn)橐嘿|(zhì)的基質(zhì)效應(yīng)多為基質(zhì)抑制[6,11]。五倍稀釋后，信噪比的降低要小于稀釋倍數(shù)。方法條件的優(yōu)化和儀器靈敏度的提高，也是定量限降低的原因。采用稀釋方法，也會(huì)因?yàn)楦蓴_濃度減少，使得SRSD值略小。陳俊秀等[13]檢測(cè)的5種農(nóng)藥的SRSD值為12.01%～15.02%，文章相應(yīng)農(nóng)藥的SRSD值為2.18%～9.89%。其他農(nóng)藥，如丁酮威及其代謝物、茲克威等，文獻(xiàn)中對(duì)其檢測(cè)方法的研究較少，但是其均為曾廣泛使用，但目前被歐盟等禁用的農(nóng)藥。其檢測(cè)數(shù)據(jù)表明，方法能滿足它們的檢測(cè)需要。

目前在果蔬農(nóng)藥多殘留檢測(cè)中，QuEChERS方法須通過(guò)基質(zhì)標(biāo)校正基質(zhì)效應(yīng)?；|(zhì)對(duì)農(nóng)藥的影響各不相同。在篩查時(shí)，選擇有代表性的基質(zhì)配制基質(zhì)標(biāo)，比較困難。雖然有研究通過(guò)試驗(yàn)數(shù)據(jù)建議在果蔬農(nóng)殘監(jiān)測(cè)中選擇某種樣品作為代表基質(zhì)，但是這種試驗(yàn)多有其局限性[6]，無(wú)法達(dá)成定論。Ferrer等[9]的研究發(fā)現(xiàn)稀釋15倍，其研究中的65%的農(nóng)藥基質(zhì)效應(yīng)可忽略不計(jì)。但是早期儀器的靈敏度不足，限制了該方法的應(yīng)用。

文章的試驗(yàn)結(jié)果表明：在目前的儀器條件下，通過(guò)優(yōu)化試驗(yàn)方法和稀釋減少基質(zhì)效應(yīng)，已經(jīng)具備可行性。隨著儀器靈敏度的提高，稀釋法降低基質(zhì)效應(yīng)，以其通用性和簡(jiǎn)便性必將是未來(lái)校正基質(zhì)效應(yīng)的趨勢(shì)。

2.4 實(shí)際樣品的檢測(cè)

檢測(cè)了本地20批生姜樣品，結(jié)果均未檢出。將方法擴(kuò)展應(yīng)用于日常檢測(cè)中出現(xiàn)的三個(gè)韭菜和二個(gè)辣椒中克百威陽(yáng)性樣品的檢測(cè)，兩個(gè)平行樣品的相對(duì)偏差＜10%，回收率＞90%。

3 結(jié)論

文章建立了QuEChERS-LCMSMS測(cè)定姜中32種氨基甲酸酯類(lèi)農(nóng)藥殘留檢測(cè)的方法。方法采用改進(jìn)的QuEChERS方法處理，溶劑標(biāo)定量。該方法具有檢出限低、重復(fù)性好、操作簡(jiǎn)便的優(yōu)點(diǎn)，可以滿足基層地區(qū)農(nóng)藥殘留量篩查的需要。文章選用姜這種富含硫化物的蔬菜，基質(zhì)在果蔬中較為復(fù)雜[11]。32種農(nóng)藥也有一定的代表性。文章證明了稀釋降低基質(zhì)效應(yīng)方法的可行性，為降低基質(zhì)效應(yīng)提供了新的思路。