海參粉微囊制備工藝

喻樊 *，蔡蓉，蔡伶麗

1.江蘇省腫瘤靶向納米診療材料工程研究中心，鹽城師范學院鹽城（鹽城 224007）；2.藥學院鹽城師范學院（鹽城224051）；3.江蘇省灘涂生物資源與環(huán)境保護重點建設實驗室（鹽城 224002）；4.南京工業(yè)大學（南京 210000）

海參，棘皮動物門海參綱物種，我國的海參種類有140余種，其中20余種可食用，而產于山東、遼寧的刺參最負盛名[1]?？茖W證明，海參中含有18種氨基酸與大量的酸性黏多糖、海參皂苷、膠原蛋白等活性物質，具有很高的營養(yǎng)價值和保健功能[2]。由于鮮活的海參不容易保存，這影響了海參的應用。

微囊是指固態(tài)或者液態(tài)藥物被高分子的材料包封形成的微小的囊狀粒子，直徑一般在1～250 μm。將海參制成微囊，具有提高穩(wěn)定性、掩蓋不良口味及氣味的優(yōu)點。由于噴霧干燥法制備微囊具有可控性好、操作簡便、產品分散等優(yōu)點，是最具有工業(yè)化應用價值的制備微囊的方法[3]，故試驗研究采用噴霧干燥法制備海參微囊，對海參產品的開發(fā)具有較大意義。

1 材料與方法

1.1 儀器與設備

實驗型噴霧干燥機（SP-1500，上海順儀實驗設備有限公司）；三目生物顯微鏡（XSP-8C，上海嚴豐精密儀器有限公司）；研磨機（TUBE-MILL，IKA）；冷凍干燥機（FD-1D-80，北京博醫(yī)康實驗儀器有限公司）；紫外/可見/近紅外分光光度計（Lamb da950，美國PE公司）；紅外光譜儀（TENSOR Ⅱ，德國布魯克光譜儀器公司）；環(huán)境掃描電子顯微鏡（Quanta 200，荷蘭FEI）。

1.2 材料與試劑

乳鐵蛋白粉（批號20210262517，河南萬邦實業(yè)有限公司）；淡干海參（煙臺瑞參堂水產有限公司）。

1.3 試驗方法

1.3.1 海參粉的制備

（1）回軟：在淡干海參中倒入0～5 ℃的純凈水，置于4 ℃冰箱中泡發(fā)24～48 h，每12 h換1次水。

（2）去沙嘴：用剪刀將海參開膛去沙嘴，去除海參的內臟。

（3）水煮：將海參放入鍋中小火煮70～90 min。

（4）泡發(fā)：出鍋后用涼水沖洗海參，將其用0～5 ℃純凈水泡發(fā)，置于4 ℃冰箱保存2～3 d，每12 h換1次水。

（5）冷凍保存：將上述泡發(fā)完成后的海參剪成厚度約2 cm小塊裝在培養(yǎng)皿中，冷凍保存24 h左右。

（6）冷凍干燥：將冷凍后的海參放入冷凍干燥機進行冷凍干燥。

（7）粉碎機粉碎：將干燥后的海參放入研磨機中進行粉碎，將粉碎后的海參粉放入干燥器中保存。

1.3.2 微囊的制備

（1）空白微囊的制備：取適量的乳鐵蛋白粉溶于純水中，靜置20 min，攪拌均勻，進行噴霧干燥即得。

（2）海參粉微囊的制備：取適量的乳鐵蛋白粉溶于純水中，靜置20 min，攪拌均勻，作為囊材溶液待用；取一定量的海參粉逐量加入到囊材溶液中，混合攪拌均勻后進行噴霧干燥，即得。

1.3.3 微囊制備工藝的優(yōu)化

采用單因素試驗法對微囊的制備工藝進行乳鐵蛋白溶液濃度、進風溫度、進料速度、風機頻率等影響因素的考察。以微囊形態(tài)為指標判定微囊效果的好壞。

1.3.3.1 乳鐵蛋白溶液濃度的選擇

固定其他參數(shù)不變，考察3種囊材溶液濃度（2%，3%和5%）對微囊成型的影響。依據(jù)微囊形態(tài)的好壞對囊材溶液濃度進行篩選。

1.3.3.2 進風溫度的選擇

固定其他參數(shù)不變，考察3種進風溫度（170，180和190 ℃）對微囊成型的影響。依據(jù)微囊形態(tài)的好壞對進風溫度進行篩選。

1.3.3.3 進料速度的選擇

固定其他參數(shù)不變，考察3種進料速度（0.4，0.5和0.6 L/h）對微囊成型的影響。依據(jù)微囊形態(tài)的好壞對進料速度進行篩選。

1.3.3.4 風機頻率的選擇

固定其他參數(shù)不變，考察3種風機頻率（30，45和60 Hz）對微囊成型的影響。依據(jù)微囊形態(tài)的好壞對風機頻率進行篩選。

1.3.4 微囊的形態(tài)觀察及粒徑分布

1.3.4.1 生物顯微鏡觀察

取少許微囊粉末置于載玻片上，滴加少量的純水，覆上蓋玻片，放置在三目生物顯微鏡下觀察微囊的形態(tài)[4]。

1.3.4.2 掃描電子顯微鏡（SEM）的測定

取海參粉、空白微囊、海參粉微囊作為樣品，噴金15 s后，置于電鏡測試儀器內，高壓15.00 kV進行測定。

1.3.4.3 粒徑分布測定

用生物顯微鏡觀察微囊形態(tài)，并且用顆粒成像儀軟件中的標尺測量100個微囊的粒徑，統(tǒng)計粒徑分布情況并作圖說明。

1.3.5 固體紫外的測定

分別放入樣品海參粉、乳鐵蛋白粉、乳鐵蛋白空白微囊、海參粉與乳鐵蛋白粉的物理混合物及海參粉微囊，掃描測定，掃描條件為200～1 000 nm。

1.3.6 紅外光譜的測定

采用KBr壓片法來進行紅外光譜的測定。打開紅外光譜儀的電源，預熱平衡，打開電腦，點擊進入紅外光譜分析軟件，點擊測定，使屏幕轉到測定界面，初始化儀器。在制片前用丙酮擦拭研缽及其他壓片工具，然后在紅外燈光照下，制備溴化鉀空白片和樣品壓片（樣品五種，海參粉、乳鐵蛋白粉、空白微囊、物理混合物、海參粉微囊），將壓制好的溴化鉀空白片放入紅外光譜儀的樣品架上，點擊測定按鈕下的背景按鈕，輸入光譜的名稱，確認采集參比背景光譜。背景圖譜采集完畢后將待測樣品放入光譜儀內，進行紅外掃描，掃描范圍為4 00～4 000 cm-1，掃描完畢保存數(shù)據(jù)后，運用Origin軟件繪圖并分析譜圖。

1.3.7 X射線衍射法（XRD）分析

將海參粉、乳鐵蛋白粉、空白微囊、乳鐵蛋白粉和海參粉的物理混合物、海參粉微囊等樣品分別進行X射線衍射測定。取干燥后的樣品研磨，壓片后置于X射線粉末衍射儀中掃描，設置衍射參數(shù)（10°～80°，10°/min），檢測條件：Cu靶，K線；掃描方式采用定性，步進掃描；管壓40 kV，管壓30 mA，掃描步長0.02°，掃描范圍10°～80°，掃描速度2°/min[14]。

2 結果與分析

2.1 微囊制備工藝考察結果分析

乳鐵蛋白溶液濃度2%和3%時制得的微囊形態(tài)不好，大小不均一。而5%濃度下所制得的微囊圓整光滑、成型效果好。因此應選擇5%濃度的囊材溶液制備微囊。進口溫度180 ℃和190 ℃下的微囊由于溫度較高，形態(tài)比較干癟，成型性差。170 ℃下的微囊形態(tài)可看出是光滑圓整的球形，成型性好。因此，選用進口溫度170 ℃制備空白微囊最適合。在噴霧干燥過程中，隨著進料速度的增加，粘壁現(xiàn)象變得嚴重，這可能是由于進料速度過大導致噴霧干燥不及，使得噴出的液滴在未曾達到表面干燥之前就和塔壁接觸因而粘在熱壁上[5]。因此物料流量0.4 L/h制得的微囊效果最好。45 Hz風機頻率條件下制得的空白微囊形狀圓整，分散相對比較均勻，無粘連現(xiàn)象，效果較好；30和60 Hz條件下的空白微囊成型性較差，粘連也相對嚴重，效果差。因為應該選擇45 Hz的風機頻率。

因此，乳鐵蛋白粉空白微囊的最佳制備工藝是乳鐵蛋白溶液度5%、進風溫度170 ℃、進料速度0.4 L/h、風機頻率45 Hz。

2.2 微囊形態(tài)的觀察及粒徑分布

2.2.1 顯微鏡觀察

根據(jù)制備工藝優(yōu)化的結果，制備海參粉微囊，如圖1所示。微囊形態(tài)圓整，表面光潔，粒徑分布比較均勻，幾乎無粘連現(xiàn)象，表明該制備工藝下的微囊效果較好。

圖1 顯微鏡圖

2.2.2 掃描電子顯微鏡（SEM）觀察

利用掃描電子顯微鏡觀察海參粉、空白微囊、海參粉微囊的形態(tài)，如圖2所示。

圖2（A）與（C）比較，可以明顯看出海參粉制備成微囊前后的形態(tài)差別。圖2（B）與（C）的微囊圖片中大部分微囊有干癟現(xiàn)象，這可能是由于乳鐵蛋白粉硬度較低和拍電鏡圖前需要抽真空所導致；但可以看出微囊大致呈現(xiàn)較為規(guī)則的球形形態(tài)且表面光滑，粘連較少。從圖2（C）中可以看出海參粉微囊周圍并無游離的海參粉藥物，可以說明海參粉被全部包進微囊中[6]。

圖2 掃描電子顯微鏡圖片

2.2.3 微囊粒徑分布

將計數(shù)結果做成柱狀圖，如圖3所示。微囊粒徑有67%分布在4～6 μm之間，粒徑分布較均勻，效果較好。

圖3 微囊粒徑分布圖

2.3 固體紫外分析

由圖4可知：在230 nm處海參粉有1個吸收峰，可能是羥基或氨基的吸收峰；在280 nm左右處有1個弱吸收峰，可能是生色基團羰基；在380 nm處有1個吸收峰，說明存在1個非常大的共軛體系。乳鐵蛋白粉在230 nm處有1個極弱的吸收峰，說明存在羥基或者是氨基；340 nm處有1個吸收峰，說明存在幾個共軛體系；蛋白空囊在220 nm左右處有1個吸收峰，是由于肽鍵引起的，在280 nm左右處有1個吸收峰，是由于含酪氨酸殘基和色氨酸殘基引起。圖譜D沒有明顯的吸收峰，這可能是由于海參粉與乳鐵蛋白粉相互作用導致的。曲線E與曲線C相比，吸收峰大致相同，但是曲線E的吸收峰強度減弱，海參粉的特征吸收峰不存在，說明海參粉成功包覆于微囊中。

圖4 5種樣品的固體紫外光譜圖

2.4 紅外光譜分析

如圖5所示：曲線A為海參粉樣品的紅外吸收光譜，海參粉屬于蛋白類物質所以含有大量氨基酸，曲線A在3 732 cm-1處有1個吸收峰，可以歸屬為—OH伸縮振動吸收峰，可能是—OH形成分子內氫鍵；3 315 cm-1處有1個吸收峰，可以歸屬為—NH2中的-NH伸縮振動特征吸收峰；2 921 cm-1處有1個吸收峰，可以歸屬為CH2中的—CH伸縮振動吸收峰；1 647 cm-1處有1個吸收峰，可以歸屬為C＝O伸縮振動特征吸收峰；1 542 cm-1處有1個吸收峰，可歸屬為苯環(huán)中的C＝C伸縮振動吸收峰；1 233 cm-1處有1個吸收峰，可以歸屬為C—C伸縮振動吸收峰；1 045 cm-1處有1個吸收峰，可以歸屬為C—O伸縮振動吸收峰。曲線B為乳鐵蛋白粉樣品的紅外吸收光譜，在3 422 cm-1處有一個特征吸收峰，可歸屬為酰胺基中的N—H伸縮振動吸收峰；在2 927 cm-1處有1個吸收峰，可歸屬為C—H伸縮振動吸收峰；1 647 cm-1處有1個吸收峰，可以歸屬為—C＝O伸縮振動吸收峰；1 537 cm-1處有1個吸收峰，可以歸屬為苯環(huán)的C＝C振動吸收峰；1 394 cm-1處有1個吸收峰，可歸屬為C—N伸縮振動吸收峰；1 238 cm-1處有1個吸收峰，可以歸屬為C—C伸縮振動吸收峰；1 076 cm-1處有1個吸收峰，可以歸屬為C—O伸縮振動吸收峰。曲線C為空白微囊樣品的紅外吸收光譜，與曲線B相比，它們具有相同特征峰，說明乳鐵蛋白制備成微囊后結構沒有發(fā)生太大的變化。曲線D為海參粉和乳鐵蛋白粉的物理混合物樣品的紅外吸收光譜，曲線D具有曲線A和B的特征峰。曲線E為海參粉微囊樣品的紅外吸收光譜，在3 372 cm-1處的特征峰消失；在3 294 cm-1處有1個吸收峰，可以歸屬為O—H或N—H伸縮振動吸收峰；在2 961 cm-1處有1個吸收峰，可以歸屬為C—H伸縮振動吸收峰；在1 654 cm-1處有1個吸收峰，可以歸屬為C＝O伸縮振動吸收峰；1 239 cm-1處有1個吸收峰，可以歸屬為C—C伸縮振動吸收峰；1 077 cm-1處有1個吸收峰，可以歸屬為C—O伸縮振動吸收峰。由分析可知，海參粉樣品中海參粉的特征峰消失或減弱，說明海參粉被包進微囊中，海參粉微囊制備成功[7-10]。

圖5 5種樣品的紅外吸收光譜圖

2.5 X射線衍射法（XRD）分析

由圖6可知：曲線A說明海參粉在19.5°處存在明顯的衍射峰；曲線B說明乳鐵蛋白粉在19°處有衍射峰；曲線C與曲線B有一樣的特征衍射峰；曲線D為海參粉與乳鐵蛋白粉的物理混合樣品，可以看出海參粉和乳鐵蛋白粉的晶體衍射峰仍存在，但是衍射峰的強度減弱，這是可能是因為海參粉與乳鐵蛋白粉相互作用所導致；圖譜E為海參粉微囊，在19°處存在乳鐵蛋白粉的特征衍射峰，海參粉的特征衍射峰消失，說明海參粉被成功包覆于微囊中。

圖6 5種樣品的XRD分析圖

3 討論與結論

試驗從囊材溶液濃度、進口溫度、物料流量、風機頻率等方面對微囊制備工藝進行研究考察，以微囊的形態(tài)為指標以確定最佳制備工藝。利用掃描電子顯微鏡拍攝微囊圖片觀察微囊形態(tài)并且分析海參粉有沒有被包進微囊內。通過固體紫外、紅外光譜、差示掃描量熱法（DSC）、X射線衍射法（XRD）對微囊進行表征。

通過單因素試驗法確定微囊的最佳制備工藝：乳鐵蛋白溶液濃度5%、進風溫度170 ℃、進料速度0.4 L/h、風機頻率45 Hz。在生物顯微鏡下觀察到，在此工藝下所制得的微囊圓整光滑、大小均一、無粘連現(xiàn)象，效果較好。粒徑測定結果顯示有67%分布在4～6 μm，粒徑分布較均勻，效果較好。

利用掃描電鏡拍攝海參粉、空白微囊、海參粉微囊3種樣品，通過觀察和比較可知，海參粉被成功制備成微囊，并且海參粉被完全包進微囊中。同時還觀察到微囊的形態(tài)表面雖然光滑圓整，但大多數(shù)都有干癟的現(xiàn)象，對此現(xiàn)象可能是因為壁材乳鐵蛋白粉硬度較低、噴霧干燥時溫度過高、電鏡掃描時需要抽真空，這還需要進一步的研究證明。

除此之外，試驗還將海參粉、乳鐵蛋白粉、空白微囊、海參粉與乳鐵蛋白粉的物理混合物、海參粉微囊5種樣品一起進行固體紫外分析、紅外光譜分析、X射線衍射法（XRD）分析。分析結果顯示海參粉被成功包進微囊中[11-12]。

試驗采用噴霧干燥法制備海參微囊，可以提高海參的穩(wěn)定性，還可以掩蓋海參的腥臭味，具有廣闊應用前景。