山楂果實提取物抗氧化能力

孫小晶，李丹丹 *，李瑩，修建華，王金華

1.河北科技大學(xué)食品與生物學(xué)院（石家莊 050000）；2.河北省山楂加工技術(shù)創(chuàng)新中心（承德 060000）

山楂是一種藥食同源食品，可以預(yù)防結(jié)腸炎[1]，也有保護心臟、作為抗氧化劑、抗炎和抗低血壓作用[2]，被認為有助于心血管系統(tǒng)的恢復(fù)[3]。因含有大量天然的具有治療特性的生物活性化合物，山楂在內(nèi)的藥草是全球市場藥物的豐富來源[4]。山楂中黃酮類化合物包括黃酮及其黃酮醇類[5]，以及二氫黃酮和二氫黃酮醇類[6]，這些物質(zhì)是以芹菜素和木犀草素為基本單位構(gòu)成山楂的基本功能成分。山楂中的多糖可用于調(diào)節(jié)人體腸道治療疾病[7]。多糖研究表明，它是具有降脂、抗氧化、抗腫瘤和抗炎特性的活性成分[8]。維生素C又稱抗壞血酸，是一種水溶性有機化合物，雖然沒有游離羥基，但是其在堿性環(huán)境下很容易被氧化。人體中所需的維生素C大多數(shù)以水果和蔬菜提供，因此測定山楂中維生素C含量是營養(yǎng)分析的重要內(nèi)容。關(guān)于山楂防治腫瘤、代用品，以及炮制、不良反應(yīng)方面的研究已取得一定進展，尤其是山楂用于防老抗衰、防治腫瘤的研究方面。

試驗采用不同提取方法提取山楂功能性成分，分別用DPPH法、羥自由基清除法、ABTS自由基清除法測定不同提取物的抗氧化能力，并對它們的清除自由基能力進行比較，以此評價其抗氧化能力，對于尋找新型高效的抗氧化劑及進一步開發(fā)利用山楂資源有一定意義。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

山楂（產(chǎn)自河北省興隆縣，鐵金星品種，選擇大小均勻、成熟度一致、無機械損傷、無病蟲害的大果鮮果果實）。

偏磷酸[阿拉丁試劑（上海）有限公司]；高嶺土（天津市永大化學(xué)試劑開發(fā)中心）；硫酸銨（天津市化學(xué)試劑一廠）；交聯(lián)葡聚糖凝膠（Sephadex G-25）、交聯(lián)葡聚糖凝膠（Sephadex G-100）、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH），均來自上海寶曼生物科技有限公司；磷酸、濃硫酸、苯酚、硝酸鋁（天津市永大化學(xué)試劑有限公司）；乙二胺四乙酸（EDTA）、葡萄糖，均來自天津市百世化工有限公司；亞硝酸鈉、抗壞血酸（天津市大茂化學(xué)試劑廠）；氫氧化鈉（廊坊市金海化工有限公司）；無水乙醇（天津市富宇精細化工有限公司）。

1.2 儀器與設(shè)備

101-OAB型電熱鼓風(fēng)干燥箱、DK-98-1型電熱恒溫水浴鍋（天津市泰斯特儀器有限公司）；JYL-350料理機（山東九陽小家電有限公司）；Adventurer分析電子天平（美國奧豪斯儀器有限公司）；KQ5200DE型數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器）；TGL-16G高速離心機（上海安亭科學(xué)儀器廠）。

1.3 方法

1.3.1 原料預(yù)處理方法

鮮山楂挑選→洗凈→去核→切片→烘干（50 ℃，16 h）→粉碎→過篩（0.125 mm孔徑，即120目）→山楂粉（裝密封袋備用）

1.3.2 山楂中主要功能性成分的提取

1.3.2.1 黃酮類化合物的提取

黃酮樣品的提取參考馮靖等[9]對黃酮的提取方法。

1.3.2.2 多糖的提取

多糖樣品的提取用NY/T 1676—2008《食用菌中粗多糖含量的測定》[10]的方法。

1.3.2.3 維生素C的提取維生素C的提取采用GB 5009.86—2016《食品中抗壞血酸的測定》[11]中的方法。

1.3.3 山楂提取物含量測定

1.3.3.1 黃酮類化合物含量測定

黃酮含量測定采用NaNO2-Al(NO3)3-NaOH比色法[12]。以吸光度為縱坐標(biāo)，以蘆丁標(biāo)品質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得標(biāo)準(zhǔn)曲線方程y=7.107 1x+0.044（R2=0.999 7）。

由山楂制備出的黃酮樣液取出2 mL，置于25 mL的容量瓶中，其余步驟同標(biāo)準(zhǔn)曲線制備，測定黃酮樣品吸光度。黃酮含量按式（1）計算。

式中：Y為樣品待測液中黃酮含量，mg/g；C為從標(biāo)準(zhǔn)曲線上查得被測液中黃酮的質(zhì)量濃度，mg/mL；V0為測量時定容體積，mL；V1為檢測時所取提取液體積，mL；V2為超聲提取后樣品定容體積，mL；m為提取黃酮時稱量山楂樣品質(zhì)量，g。

1.3.3.2 多糖含量測定

多糖含量測定采用苯酚-硫酸法[13]。以葡萄糖質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，繪出標(biāo)準(zhǔn)曲線，得標(biāo)準(zhǔn)曲線方程y=6.445 2x+0.150 6（R2=0.999 2）。

適當(dāng)稀釋樣品，使吸光度在0.2～0.8之間。吸取1.00 mL稀釋后的樣品溶液于20 mL試管中，樣品加量同上述標(biāo)準(zhǔn)曲線制備，測定多糖樣品吸光度。多糖含量按式（2）計算。

式中：ω為多糖含量，g/100 g；m1為葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線上查得的樣品稀釋液中含糖質(zhì)量，μg；V1為樣品定容體積，mL；m2為樣品質(zhì)量，g；V2為測吸光度時樣品稀釋液體積，mL。

1.3.3.3 維生素C含量測定

維生素C含量測定采用徐朝陽[14]的2,6-二氯靛酚滴定法。

2,6-二氯靛酚溶液標(biāo)定步驟：用移液管精確移取1 mL 1 mg/mL抗壞血酸標(biāo)準(zhǔn)溶液，置入50 mL錐形瓶中，再加入10 mL 20 mg/mL偏磷酸溶液，搖勻后用2,6-二氯靛酚溶液滴定，直至滴入最后一滴液體時，錐形瓶內(nèi)液體剛好出現(xiàn)粉紅色并保持15 s不褪色。同時，另取10 mL偏磷酸溶液做空白試驗，按式（3）計算滴定度。

式中：T為2,6-二氯靛酚溶液的滴定度，mg/mL；C為抗壞血酸標(biāo)準(zhǔn)溶液的質(zhì)量濃度，mg/mL；V為測滴定度所吸取抗壞血酸標(biāo)準(zhǔn)溶液體積，mL；V1為滴定抗壞血酸標(biāo)準(zhǔn)溶液所消耗的2,6-二氯靛酚溶液體積，mL；V0為滴定空白所消耗2,6-二氯靛酚溶液體積，mL。

精確移取10 mL樣品待測液于錐形瓶中，用標(biāo)定過后的2,6-二氯靛酚溶液進行滴定，反應(yīng)現(xiàn)象同滴定度測定試驗，同時做空白試驗。維生素C含量按式（4）計算。

式中：X為樣品待測液中抗壞血酸含量，mg/100 g；V為滴定待測液所需2,6-二氯靛酚溶液體積，mL；V0為滴定空白所需2,6-二氯靛酚溶液體積，mL；T為2,6-二氯靛酚溶液的滴定度，mg/mL；A為稀釋倍數(shù)；m為試樣質(zhì)量，g。

2 山楂各成分的抗氧化能力比較

2.1 DPPH自由基清除能力

使用DPPH方法對提取物的抗氧化活性進行體外評估[15]。測定步驟[16]：制得1.5×10-4mol/L的DPPH溶液，取2 mL該溶液，加入2 mL用無水乙醇溶解的試樣，用渦旋振蕩器振搖混合均勻，在25 ℃下避光放置，30 min后照紫外分光光度計，于517 nm測定吸光度，每個樣品測定3次。DPPH自由基清除率按式（5）計算。

式中：A1為DPPH溶液和試樣的吸光度；A2為乙醇溶解的試樣溶液的吸光度；A0為DPPH無水乙醇溶液的吸光度。

2.2 羥自由基清除能力

樣品均用95%乙醇溶液配制成質(zhì)量濃度為0.11 g/mL溶液，向4 mL樣品溶液中加入8.8 mmol/L H2O2溶液、9 mmol/L FeSO4溶液和9 mmol/L水楊酸溶液各0.5 mL，混勻，在37 ℃水浴加熱30 min，在510 nm波長處測定樣品吸光度（A1），將體系中的樣品溶液改為加入4 mL蒸餾水，測得空白對照吸光度（A0），將加入0.5 mL 8.8 mmol/L H2O2溶液代替為0.5 mL蒸餾水，測得樣品本底吸光度（A2），其中A1和A2每個質(zhì)量樣品濃度做3個平行，同按式（5）計算羥自由基清除率。

2.3 ABTS清除能力[17]

將過硫酸鉀儲備液（2.45 mmol/L）與ABTS儲備液（7 mmol/L）按體積比1∶1制備ABTS+自由基儲備溶液，并在黑暗中室溫保持16 h。ABTS+自由基儲備溶液用10 mmol/L磷酸鹽緩沖鹽水（pH 7.4）稀釋，在734 nm處的吸光度為0.700±0.020。將樣品與2.5 mL ABTS+自由基溶液混合并在室溫下反應(yīng)30 min，在734 nm處測定吸光度。同按式（5）計算ABTS清除率。

2.4 數(shù)據(jù)處理

所有試驗均重復(fù)3次。試驗結(jié)果表示為“平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差”，使用Origin 2018軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析并繪制圖表，采用IBM SPSS Statistics 25數(shù)據(jù)分析軟件對變化進行顯著性分析，并進行Duncan’s差異顯著性分析，P＜0.05表示差異顯著。

3 結(jié)果與分析

3.1 山楂中主要功能性成分含量

山楂中黃酮、多糖、維生素C含量見表1，黃酮、多糖、維生素C的含量有明顯差異。

表1 山楂中主要功能性成分含量

3.2 山楂各提取物抗氧化能力的研究

3.2.1 DPPH自由基清除能力

山楂不同提取物清除DPPH的能力如圖1所示。隨著加樣體積不斷增加，3種提取物清除DPPH自由基能力均呈現(xiàn)上升趨勢，不同樣品對DPPH自由基清除率隨體積升高而逐漸增強，在相同體積下，維生素C清除DPPH的能力最強。這是由于抗氧化劑的加入，配對了DPPH含有的孤對電子，DPPH溶液就由深紫紅色自由基形式還原成黃色的非自由基形式，褪色程度可反映待測物質(zhì)的抗氧化能力大小。在1.0 mL時，對DPPH自由基清除率為90.3%，高于其他2個樣品。通過方差分析，P＜0.05，有顯著差異。

圖1 山楂不同提取物對DPPH自由基的清除能力

山楂不同提取物對DPPH的IC50如表2所示。在清除率均為50%的情況下，維生素C濃度最小，多糖濃度最大。由此可得出，相比較山楂的其他提取物，維生素C清除DPPH自由基的能力最強，多糖最弱。趙二勞等[18]研究山楂提取物抗氧化能力，其研究結(jié)果：山楂提取物的抗氧化能力弱于維生素C，報道中山楂黃酮提取物清除 DPPH自由基的能力與試驗結(jié)果相同，這可能與樣品及研究方法不同有關(guān)。張全才等[19]研究山楂多糖的抗氧化活性研究，研究結(jié)果是：從整體來看維生素C的DPPH清除能力要強于山楂多糖，報道中山楂多糖清除DPPH自由基的能力與試驗結(jié)果相同。

表2 不同提取成分對DPPH自由基的IC50

3.2.2 羥自由基清除能力

山楂不同提取物清除羥自由基的能力如圖2所示。隨著體積不斷增加，3種提取物清除羥自由基的能力都呈現(xiàn)上升趨勢，不同樣品對羥基自由基的清除率均隨體積升高而逐漸增強。且在相同體積下，維生素C清除羥自由基的能力最強。這是由于過氧化氫和亞鐵離子反應(yīng)生成·OH，水楊酸再與其反應(yīng)生成能在510 nm處有最大吸收的二羥基苯甲酸，而抗氧化劑能夠阻礙其生成，則反應(yīng)體系在相同波長下的吸光度就會相應(yīng)降低。在1.0 mL時，對羥基自由基的清除率為82.2%，高于其他2個樣品，與維生素C對羥基自由基的清除率最接近。通過方差分析，P＜0.05，有顯著差異。趙巖巖等[19]研究結(jié)果是：多糖清除羥自由基的能力呈現(xiàn)逐漸升高的趨勢，清除率最高可達81.6%，表明山楂多糖具有較好的清除羥基自由基的能力[20]。與試驗結(jié)果不同，可能是試驗方法與材料的不同。

圖2 山楂不同提取物對羥自由基的清除能力

山楂不同提取物對羥自由基的IC50如表3所示。在清除率均為50%的情況下，維生素C濃度最小，多糖濃度最大。由此可得出，相比較山楂的其他提取物，維生素C清除羥自由基的能力最強，多糖最弱。

表3 不同提取成分對羥自由基的IC50

3.2.3 ABTS自由基清除能力

山楂不同提取物清除ABTS自由基的能力如圖3所示。不同樣品對DPPH自由基的清除率均隨體積升高而逐漸增強。可以看出，隨著加樣體積不斷增加，3種提取物清除自由基的能力都呈現(xiàn)上升趨勢，且在相同體積下，維生素C的清除能力最強。這種評價抗氧化能力大小的原理是：ABTS易溶于水，是一種顯色劑，經(jīng)氧化反應(yīng)生成陽離子自由基，該自由基在734 nm處有最大吸收峰，若加入抗氧化物質(zhì)兩者就會發(fā)生反應(yīng)，則反應(yīng)體系在相同波長下的吸光度就會相應(yīng)降低。在1.0 mL時，維生素C對ABTS自由基的清除率為82.2%。通過方差分析，P＜0.05，有顯著差異。

圖3 山楂不同提取物對ABTS自由基的清除能力

山楂不同提取物對ABTS自由基的IC50如表4所示。在清除率均為50%的情況下，維生素C的濃度最小，多糖濃度最大。由此可得出，相比較山楂的其他提取物，維生素C清除ABTS自由基的能力最強，多糖最弱。鄭朋朋等[21]研究山楂多糖的提取及其抗氧化性作用，整體來看，維生素C對ABTS自由基清除能力要強于山楂多糖，與試驗結(jié)果相同。

表4 不同提取成分對ABTS自由基的IC50

4 結(jié)論

試驗采用最優(yōu)條件分別提取出山楂中的黃酮、多糖、維生素C，并通過試驗測定各提取物含量，計算得出：鐵金星山楂中含33.69 mg/g黃酮、3.84 g/100 g多糖、36.64 mg/100 g維生素C，其含量大小依次為多糖＞黃酮＞維生素C。

通過4種抗氧化能力測定方法，評價山楂4種成分的抗氧化活性得出：黃酮對自由基的清除率最高值分別為64%（DPPH自由基清除率），63.5%（羥自由基清除率）和66.2%（ABTS自由基清除率）；多糖對自由基的清除率最高值分別為60.1%（DPPH自由基清除率），51.3%（羥自由基清除率）和51.1%（ABTS自由基清除率）；維生素C對自由基的清除率最高值分別為90.3%（DPPH自由基清除率），82.2%（羥自由基清除率）和82.2%（ABTS自由基清除率）。DPPH自由基清除能力：維生素C＞黃酮＞多糖。羥自由基清除能力：維生素C＞黃酮＞多糖。ABTS自由基清除能力：維生素C＞黃酮＞多糖。從抗氧化試驗的測定結(jié)果可以發(fā)現(xiàn)，樣品黃酮含量高則抗氧化性也高，抗氧化性和黃酮含量具有正相關(guān)性。山楂中含量最多的多糖，在抗氧化能力方面卻最弱，而含量較少的維生素C和黃酮抗氧化能力相對較強。以上說明維生素C含量少卻抗氧化能力強，說明其自身抗氧化能力就很強，而多糖含量多抗氧化能力還弱，說明其自身抗氧化能力就很弱。

綜上所述，山楂中黃酮和維生素C抗氧化能力較強，今后可作為一個很好的抗氧化來源進行應(yīng)用。