活體共聚焦顯微鏡在評(píng)估2型糖尿病患者角膜神經(jīng)形態(tài)學(xué)變化中的臨床應(yīng)用

陳麗妃， 黃 慧， 沈朝蘭， 陳 琦， 李 敏

糖尿病是一種全身代謝性疾病，糖尿病視網(wǎng)膜病變(diabetic retinopathy，DR)是最常見的眼部并發(fā)癥，也是眼科醫(yī)師關(guān)注的焦點(diǎn)。然而，糖尿病在角膜中亦會(huì)引起病變。據(jù)估計(jì)，在糖尿病這一終生疾病的整個(gè)過(guò)程中，47%～64%的糖尿病患者存在糖尿病角膜病變[1]。糖尿病角膜病變的組織生理功能改變包括角膜上皮細(xì)胞傷口愈合不良、角膜神經(jīng)纖維形態(tài)改變、內(nèi)皮細(xì)胞損傷及泵功能改變?；铙w共聚焦顯微鏡(in-vivo confocal microscopy，IVCM)檢查是20世紀(jì)90年代發(fā)展起來(lái)的一項(xiàng)具有劃時(shí)代意義的技術(shù)，具有快速、無(wú)創(chuàng)、高分辨、實(shí)時(shí)的特點(diǎn)，可以實(shí)現(xiàn)對(duì)活體組織的超微結(jié)構(gòu)進(jìn)行無(wú)創(chuàng)性檢查，精準(zhǔn)地獲取和分析角膜各層面的二維圖像和整個(gè)角膜的三維圖像。本研究運(yùn)用IVCM評(píng)估2型糖尿病患者角膜神經(jīng)形態(tài)學(xué)變化，探討其與DR的關(guān)系，以期為糖尿病早期周圍神經(jīng)病變的診斷提供了一種新型、靈敏和非侵入性的檢測(cè)手段。

1 對(duì)象與方法

1.1研究對(duì)象 選取2017年12月至2019年12月確診的2型糖尿病患者180例，于廣西壯族自治區(qū)人民醫(yī)院眼科行直接或間接眼底鏡檢查，根據(jù)其是否合并DR將其分為非糖尿病視網(wǎng)膜病變(non-diabetic retinopathy,NDR)組(90例，90眼)和DR組(90例，90眼)。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)確診2型糖尿病[2]；(2)角膜組織透明；(3)無(wú)眼部外傷及眼部手術(shù)史；(4)無(wú)角膜感染病變史；(5)無(wú)角膜接觸鏡佩戴史；(6)未服用過(guò)影響角膜代謝的藥物；(7)無(wú)其他影響周圍神經(jīng)的全身非糖尿病病變。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)合并中樞或其他周圍神經(jīng)疾?。?2)合并惡性腫瘤；(3)合并結(jié)締組織?。?4)營(yíng)養(yǎng)不良；(5)合并慢性肝炎疾??；(6)合并甲狀腺疾病等內(nèi)分泌疾??；(7)合并精神心理疾病；(8)合并活動(dòng)性眼病、青光眼、翼狀胬肉、皰疹病毒角膜病變、其他角膜感染病變、角膜云翳、角膜斑翳、角膜白斑。另選擇同期健康志愿者90名(90眼)作為對(duì)照組。三組年齡、性別差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性。見表1。本研究獲醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(編號(hào)：KY-G2R-2019-053號(hào))，研究對(duì)象均知情同意參與。

表1 三組基線資料比較

1.2IVCM檢查方法及觀察指標(biāo) 由具有豐富IVCM操作及臨床經(jīng)驗(yàn)的眼科醫(yī)師采用Heidelberg Engineering GmbH生產(chǎn)的IVCM(Heidelberg Retina Tomograph-Ⅲ)進(jìn)行檢查。受試者取坐位，用0.5%鹽酸丙美卡因滴眼液對(duì)受檢眼進(jìn)行表面麻醉，裝置好一次性角膜接觸帽，調(diào)整顯微鏡物鏡位置，予開瞼器打開雙瞼，受試者頭部固定于顯微鏡物鏡前，雙眼按照指示燈方向注視正前方。檢查者將顯微鏡物鏡向前移動(dòng)直到輕觸角膜中央表面，逐漸推進(jìn)鏡頭，逐層顯示角膜各層組織。采集角膜上皮下神經(jīng)叢圖像8～10張存儲(chǔ)，深度50～60 μm，每張圖像觀察的范圍是400 μm×400 μm。從存儲(chǔ)的圖像中選擇6張清晰度好，能反映角膜中央部位神經(jīng)纖維叢的圖像通過(guò)儀器自帶軟件進(jìn)行分析：(1)角膜神經(jīng)纖維密度(corneal nerve fiber density，CNFD)，每平方毫米內(nèi)所有神經(jīng)主干纖維數(shù)目；(2)角膜神經(jīng)分支密度(corneal nerve branch density，CNBD)，每平方毫米內(nèi)主干神經(jīng)發(fā)出分支的數(shù)目。采用Image J軟件分析圖像角膜神經(jīng)纖維長(zhǎng)度(corneal nerve fiber length，CNFL)，每平方毫米所有神經(jīng)纖維長(zhǎng)度之和。整個(gè)過(guò)程大約需要5 min，過(guò)程中無(wú)受試者抱怨疼痛、不適或視覺(jué)障礙。

2 結(jié)果

IVCM檢查見NDR組和DR組的角膜神經(jīng)纖維的數(shù)量及分支較對(duì)照組減少，走行僵直。比較結(jié)果顯示，NDR組和DR組的CNFD、CNBD和CNFL水平均低于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。DR組的CNFD、CNBD和CNFL水平均低于NDR組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表2，圖1。

表2 三組CNFD、CNBD和CNFL比較

圖1 IVCM檢查角膜神經(jīng)纖維所見

3 討論

3.1目前糖尿病已成為社會(huì)公共衛(wèi)生問(wèn)題，其發(fā)病率逐年增長(zhǎng)。據(jù)國(guó)際糖尿病聯(lián)合會(huì)推測(cè)，2035年糖尿病患者人數(shù)將達(dá)到5.92億人[3]。糖尿病并發(fā)癥累及全身，輕則影響患者生活質(zhì)量，重則危害患者的生命安全。其中DR、糖尿病腎病和糖尿病周圍神經(jīng)病變是公認(rèn)的糖尿病微血管并發(fā)癥[4]，對(duì)患者生活質(zhì)量影響較大。早預(yù)防、早診斷可防止晚期并發(fā)癥的發(fā)生[5]。糖尿病周圍神經(jīng)病變的診斷方法包括神經(jīng)癥狀/神經(jīng)缺陷評(píng)分、定量感覺(jué)測(cè)定、神經(jīng)傳導(dǎo)速度測(cè)定、皮膚活檢檢測(cè)等[6-7]，其中神經(jīng)傳導(dǎo)速度檢查曾經(jīng)被認(rèn)為是診斷糖尿病周圍神經(jīng)病變的“金標(biāo)準(zhǔn)”。但是神經(jīng)傳導(dǎo)速度檢查對(duì)于早期改變較小的無(wú)髓鞘神經(jīng)纖維的檢測(cè)敏感性較差，難以對(duì)早期糖尿病周圍神經(jīng)病變作出診斷。皮膚活檢能夠檢測(cè)出糖尿病周圍神經(jīng)病變的早期損害，但其是一種有創(chuàng)性檢測(cè)手段，難以在臨床推廣[8]。由于檢測(cè)手段的局限，過(guò)去認(rèn)為DR是最早的糖尿病微血管病變。然而，隨著IVCM的問(wèn)世，學(xué)者們對(duì)早期糖尿病微血管病變又有了新的認(rèn)識(shí)，即糖尿病性角膜神經(jīng)病變?cè)缬贒R發(fā)生[9]。20世紀(jì)90年代，Cavanagh等[10]首次將IVCM技術(shù)應(yīng)用于貓、兔及人體的角膜檢測(cè)，開啟了IVCM在眼科疾病診治中的應(yīng)用時(shí)代。目前，IVCM技術(shù)已發(fā)展得較為成熟，在眼科疾病診斷中的應(yīng)用也越來(lái)越廣泛[11-14]，可以實(shí)現(xiàn)對(duì)活體組織超微結(jié)構(gòu)的無(wú)創(chuàng)性檢查，在角膜的生理、病理及疾病診斷方面都具備以往檢查方法、設(shè)備無(wú)可比擬的優(yōu)勢(shì)。

3.2人角膜包含源自三叉神經(jīng)的感覺(jué)神經(jīng)纖維和源自頸上神經(jīng)節(jié)的交感神經(jīng)軸突?；|(zhì)神經(jīng)束在其周圍進(jìn)入角膜組成上皮下神經(jīng)叢，角膜神經(jīng)在維持眼表功能和形態(tài)完整性方面具有關(guān)鍵作用，并起到保護(hù)和營(yíng)養(yǎng)作用。在裂隙燈下，糖尿病患者的角膜看起來(lái)光滑且透明，但是在角膜內(nèi)也可能存在亞臨床變化。IVCM是一種快速、無(wú)創(chuàng)的眼科成像技術(shù)，具有800倍的放大倍數(shù)及1 μm的分辨率，可對(duì)角膜的細(xì)胞水平進(jìn)行定量分析。在IVCM操作過(guò)程中，角膜接觸帽需接觸被檢者的角膜，操作者在檢查前需先進(jìn)行充分的表面麻醉，并且做好安撫工作，讓被檢者能夠更好地配合檢查。檢查時(shí)操作者動(dòng)作需輕柔，不能擠壓角膜，角膜變形會(huì)影像圖像質(zhì)量，采集圖像時(shí)動(dòng)作要迅速，盡量減少操作時(shí)間。操作結(jié)束后予抗菌眼藥水滴眼預(yù)防感染。

3.3本研究結(jié)果顯示，NDR組的CNFD、CNBD和CNFL水平均較對(duì)照組降低，與國(guó)內(nèi)外相關(guān)研究[15-16]結(jié)果相似。提示在尚未發(fā)生DR之前，糖尿病患者的角膜神經(jīng)纖維形態(tài)已有所改變，IVCM檢查可提供良好的證據(jù)。本研究結(jié)果還顯示，DR組的CNFD、CNBD和CNFL水平均顯著低于NDR組，說(shuō)明隨著糖尿病病程的進(jìn)展，角膜的神經(jīng)纖維形態(tài)進(jìn)一步受到損害。在健康和糖尿病性角膜中，IVCM對(duì)基底層下神經(jīng)叢的評(píng)估顯示出良好的可重復(fù)性[17]。

3.4目前認(rèn)為高血糖介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激是糖尿病性角膜神經(jīng)病變的發(fā)生機(jī)制。晚期糖基化終末產(chǎn)物(advanced glycation end products，AGEs)是糖分子的非酶糖基化產(chǎn)生的反應(yīng)性代謝產(chǎn)物，其是由高血糖癥引起的[18]。研究表明，AGEs的積累可導(dǎo)致糖尿病性角膜神經(jīng)病變[19]。AGEs及其受體引起氧自由基的形成和促炎性細(xì)胞因子的釋放[20]。在這種狀態(tài)下，神經(jīng)生長(zhǎng)因子(nerve growth factor,NGF)和鞘脂的產(chǎn)生受到阻礙。角膜神經(jīng)纖維受損后患者的角膜敏感性降低，瞬目減少，進(jìn)而使角膜上皮干燥，容易出現(xiàn)上皮點(diǎn)狀缺失、上皮持續(xù)糜爛等，導(dǎo)致異物感、畏光、流淚、視物模糊等眼部癥狀的發(fā)生。當(dāng)然，高血糖不僅損傷角膜神經(jīng)纖維，還對(duì)角膜其余各層組織造成損害，如角膜上皮細(xì)胞密度降低、內(nèi)皮細(xì)胞密度的降低和形態(tài)改變等[9]，引發(fā)一系列癥狀。

綜上所述，IVCM檢測(cè)對(duì)評(píng)估2型糖尿病角膜神經(jīng)纖維亞臨床病理方面具有巨大潛力，在出現(xiàn)DR前就能夠快速、無(wú)創(chuàng)、精準(zhǔn)地檢測(cè)出糖尿病角膜神經(jīng)纖維的改變，為臨床診斷與治療提供依據(jù)。