白術(shù)提取工藝及抗氧化性能研究

宋晨，閆璐

（邯鄲睿川科技有限公司，河北 邯鄲 056000）

1 概況

白術(shù)為蒼術(shù)屬多年生植物，現(xiàn)代研究表明其根莖含有黃酮、多糖、揮發(fā)油和內(nèi)酯類等成分，具有抗菌、抗氧化等生物活性。舒暢等優(yōu)化了白術(shù)黃酮的提取溫度、液料比、提取時(shí)間，并測(cè)定出其抗氧化性能。武宇芳等通過(guò)超聲輔助提取白術(shù)黃酮,并采用DPPH 法測(cè)定了抗氧化活性。吳銘等利用超聲輔助提取了白術(shù)多糖，提取率為8.52 %，同時(shí)測(cè)定了白術(shù)多糖DPPH 自由基和超氧陰離子自由基清除率。黃小千等由水蒸氣蒸餾法提取了白術(shù)揮發(fā)油并研究其化學(xué)成分。王建成利用正交試驗(yàn)考察了乙醇體積分?jǐn)?shù)、溶劑用量、提取時(shí)間及提取次數(shù)對(duì)白術(shù)內(nèi)脂提取工藝的影響。現(xiàn)有研究多集中于單個(gè)成分提取及表征，但多成分連續(xù)提取更具有工業(yè)意義。探討水提法提取白術(shù)，同時(shí)收集揮發(fā)油，水提濾渣進(jìn)一步經(jīng)醇提得醇提物，優(yōu)化提取工藝并測(cè)定水提物、醇提物抗氧化性，以期為白術(shù)綜合利用提供參考。

2 實(shí)驗(yàn)部分

2.1 試劑及儀器

白術(shù)生品，河北安國(guó)藥材市場(chǎng)；蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品，中國(guó)食品藥品檢定研究所；DPPH，分析純，和光純業(yè)工業(yè)株式會(huì)社；過(guò)氧化氫、水楊酸、硫酸亞鐵、維C、葡萄糖、蒽酮等均為市售分析純。

微波萃取儀，XH-100，北京祥鵠科技有限公司；可見(jiàn)分光光度計(jì)，722S，上海儀電分析儀器有限公司。

2.2 試驗(yàn)方法

2.2.1 白術(shù)提取及工藝優(yōu)化

白術(shù)粉碎過(guò)40 目篩。稱取白術(shù)粉于三頸燒瓶中，以蒸餾水為溶劑，按一定液料比（mL/g），直接蒸餾規(guī)定時(shí)間，期間收集揮發(fā)油。結(jié)束后抽濾合并濾液濃縮得水提物，經(jīng)苯酚-硫酸法鑒定其主要為多糖。濾渣經(jīng)抽濾后，不經(jīng)烘干直接稱重，以一定液料比（mL/g） 加入95%乙醇，設(shè)定微波功率600 W，萃取一定時(shí)間，溫度設(shè)置為78 ℃，結(jié)束后趁熱過(guò)濾合并濾液濃縮，得醇提物，經(jīng)鹽酸-鎂粉法鑒定其主要為黃酮。

在預(yù)實(shí)驗(yàn)及單因素實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上，以白術(shù)與水用量比、水提時(shí)間、白術(shù)與醇用量比、微波時(shí)間四因素來(lái)設(shè)計(jì)正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)化黃酮提取工藝。正交實(shí)驗(yàn)因素與水平設(shè)計(jì)見(jiàn)表1。

表1 正交實(shí)驗(yàn)因素與水平設(shè)計(jì)Table 1 Orthogonal design factors and levels

2.2.2 提取物定量分析

2.2.2.1 多糖測(cè)定

五只試管分別加入不同濃度葡萄糖溶液2 mL，濃H2SO45.00 mL、5%苯酚1.00 mL，搖勻，100 ℃加熱0.5 h 后冷卻。以蒸餾水做參比，490 nm 波長(zhǎng)下測(cè)各溶液吸光度，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。移取提取后未濃縮水提液1.0 mL 稀釋到一定濃度測(cè)定吸光度，平行3 次，根據(jù)葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算被測(cè)液多糖濃度，白術(shù)多糖的得率計(jì)算式如下：

式中：C0為最終稀釋的多糖的質(zhì)量濃度，mg/mL；N 為多糖稀釋倍數(shù)；V 為多糖溶液的體積，mL；m為白術(shù)質(zhì)量，g。

2.2.2.2 黃酮測(cè)定

配置：0.2 g/L 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)液、100 g/L 的Al(NO)3溶液、40 g/L 的NaOH 溶液和50 g/L 的NaNO2溶液。以蘆丁為標(biāo)準(zhǔn)，按參考文獻(xiàn)程序顯色，檢測(cè)波長(zhǎng)為510 nm，95%乙醇做參比繪制蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線。移取提取后未濃縮醇提液1.00 mL 稀釋到一定濃度測(cè)定吸光度，平行3 次，根據(jù)蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算被測(cè)液黃酮濃度。參考白術(shù)多糖得率計(jì)算方程，計(jì)算白術(shù)黃酮得率。

2.2.3 抗氧化能力的測(cè)定

2.2.3.1 對(duì)羥基自由基的清除作用

以維C 作對(duì)照，測(cè)定白術(shù)水提物和醇提物對(duì)OH 的清除能力。配置5、17、27、33、39、50 μg/mL 維C、白術(shù)水提物和醇提物溶液。取FeSO4溶液1.0 mL 于試管中，分別加1.0 mL 水楊酸-乙醇溶液、1.0 mL 的H2O2溶液、1.0 mL 蒸餾水，在37℃條件下反應(yīng)30 min，以蒸餾水作參比測(cè)510 nm波長(zhǎng)處吸光度A0；以不同濃度的維C 溶液代替蒸餾水，其余同上測(cè)吸光度Ax；以蒸餾水代替H2O2作試劑空白測(cè)吸光度Ax0。白術(shù)水提物和醇提物測(cè)定同維C。

2.2.3.2 對(duì)DPPH·的清除作用

以維C 為對(duì)照，測(cè)定白術(shù)水提物和醇提物對(duì)DPPH·清除率。取五只試管分別加入2.0 mL 濃度分別8、16、24、32、40 μg/mL 的維C 溶液，加入2.0 mL 濃度為0.05 mg/mL 的DPPH 溶液，搖勻、室溫于暗處反應(yīng)25 min，測(cè)520 nm 處的吸光度Ai；平行測(cè)定2.0 mL DPPH 溶液和2.0 mL 95%乙醇混合液的吸光度A0，試劑空白的吸光度A1。

DPPH 自由基清除率（%） =（1-（Ai—A1） /A0） ×100，白術(shù)水提物和醇提物測(cè)定同維C。

3 結(jié)果與分析

3.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線

葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線線性回歸方程為：Y=-0.058 1+57.55 X，R=0.993 42；蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線線性回歸方程為：Y=9.133 04X，R=0.999 04。

3.2 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果

依正交表1進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，通過(guò)葡萄糖、蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線法計(jì)算多糖得率、黃酮得率，及兩者之和。結(jié)果如表2所示。本提取工藝中，揮發(fā)油為水提副產(chǎn)物，且揮發(fā)油含量較低，暫未列為實(shí)驗(yàn)指標(biāo)。白術(shù)水提步驟不受黃酮提取步驟影響，因此多糖得率亦不作為優(yōu)化指標(biāo)，同理多糖、黃酮二者之和亦不作為優(yōu)化指標(biāo)。但實(shí)驗(yàn)可見(jiàn)，蒸餾時(shí)間對(duì)多糖得率影響較大，物料比影響較小。延長(zhǎng)時(shí)間可提高多糖得率。黃酮得率受所有因素影響，因此以黃酮得率為正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)化指標(biāo)，正交條件下多糖和黃酮得率及兩者之和見(jiàn)表2。

表2 正交條件下多糖和黃酮得率及兩者之和Table 2 Flavone,polysaccharide,and total yield under orthogonal condition

黃酮得率正交實(shí)驗(yàn)分析見(jiàn)表3。

表3 黃酮得率正交實(shí)驗(yàn)分析Table 3 Flavone yield orthogonal test analysis

由表3可見(jiàn)，實(shí)驗(yàn)9（A3B3C2D1） 黃酮得率為0.42%，為設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)中最高得率；分析各因素各水平平均得率，最優(yōu)工藝應(yīng)為A3B3C3D1。由極差分析可得，影響黃酮得率的因素由大到小為：料液（水） 比＞蒸餾時(shí)間＞料液（醇） 比＞微波時(shí)間。

最佳工藝驗(yàn)證，A3B3C3D1即料液（水） 比為1∶20（mL/g），蒸餾時(shí)間5 h，料液（醇） 比1∶20（mL/g），微波時(shí)間4 min。黃酮得率0.44%，多糖得率30.42%，兩者之和為30.86 %，水、醇總提取物得率35.21%。同時(shí)收集揮發(fā)油為副產(chǎn)物。

3.3 白術(shù)水提物和醇提物的抗氧化活性

3.3.1 提取物對(duì)·OH 的清除作用

提取物對(duì)·OH 的清除作用如圖1所示。

由圖1可知，提取物對(duì)·OH 的清除作用，在實(shí)驗(yàn)濃度范圍內(nèi)，50 μg/mL 白術(shù)水提物對(duì)·OH 清除率達(dá)21.96%，此時(shí)醇提物清除率為18.89%，白術(shù)水提物比醇提物略高，低濃度時(shí)，兩者差異明顯，隨質(zhì)量濃度逐漸升高，兩者清除率越來(lái)越接近。低濃度時(shí)二者清除性能與維C 差距不大，隨濃度升高二者性能較維C 差距變大，總體二者均沒(méi)有維C 的清除性能強(qiáng)。

圖1 提取物對(duì)·OH的清除作用Fig.1 OH free radical scavenging effect of different extracts

3.3.2 提取物對(duì)DPPH·的清除作用

提取物對(duì)DPPH·的清除作用如圖2所示。

圖2 提取物對(duì)DPPH·的清除作用Fig.2 DPPH free radical scavenging effect of different extracts

由圖2可知，提取物對(duì)DPPH·的清除作用，實(shí)驗(yàn)濃度范圍內(nèi)，對(duì)DPPH·清除率白術(shù)水提物比醇提物高且差異較明顯。在8～24 μg/mL 水提物和醇提物對(duì)DPPH·清除率差別逐漸增大，＞24 μg/mL 后兩者的差別逐漸減小。但整體二者較維C清除能力差，且差距較大。對(duì)比圖1、圖2發(fā)現(xiàn)，白術(shù)水提物和醇提物對(duì)DPPH·的清除能力稍弱于對(duì)·OH 的清除能力。

4 結(jié)語(yǔ)

對(duì)白術(shù)進(jìn)行綜合提取，首先以蒸餾水為溶劑，采用直接蒸餾，收集揮發(fā)油及主要成分為多糖的白術(shù)水提物。濾渣經(jīng)抽濾后，不經(jīng)烘干直接加入95%乙醇，進(jìn)行醇提得白術(shù)醇提物，其主要成分為黃酮。以黃酮得率為考察指標(biāo)，由正交實(shí)驗(yàn)法確定了最優(yōu)工藝參數(shù)，即料液（水)比為1 ∶20（mL/g），蒸餾時(shí)間5 h，料液（醇） 比1 ∶20（mL/g），微波時(shí)間4min。此條件下，黃酮得率0.44%，多糖得率30.42%，兩者之和30.86%，水、醇總提取物得率35.21%。全工藝以黃酮為控制組分，影響黃酮得率的因素由大到小為：料液（水）比＞蒸餾時(shí)間＞料液（醇） 比＞微波時(shí)間。該工藝前期水提不影響后期醇提產(chǎn)物及總提取物得率，提高了藥材利用率。

該工藝所得提取物抗自由基作用明顯，其中，50μg/mL 白術(shù)水提物對(duì)·OH 清除率達(dá)21.96%，此時(shí)醇提物清除率為18.89%；40μg/mL 白術(shù)水提物對(duì)DPPH·清除率達(dá)17.62%，此時(shí)醇提物清除率為12.85%。白術(shù)水提物與醇提物低濃度時(shí)對(duì)·OH 清除性能與維C 差距不大；二者對(duì)DPPH·的清除能力稍弱于其對(duì)·OH 的清除能力。