植物單倍體技術(shù)在林木育種中的應(yīng)用研究

高孝華

（甘肅省子午嶺林業(yè)管理局華池分局，甘肅 慶陽 745600）

林業(yè)的發(fā)展對(duì)于我國國民經(jīng)濟(jì)發(fā)展、生態(tài)環(huán)境、森林以及其他林產(chǎn)品的保護(hù)非常重要，關(guān)乎我國自然生態(tài)的可持續(xù)發(fā)展。為了提高我國林業(yè)管理效益，提升林木育種工作質(zhì)量，必須不斷推進(jìn)林木選種和育種的科學(xué)性和高效性，加強(qiáng)植物的遺傳分析工作。植物單倍體育種能夠獲得理想的純合二倍體植物，是一種理想的育種方式，不僅能夠控制雜交后的性狀分離，還能縮短育種周期，具有很強(qiáng)的實(shí)用性。

1 單倍體技術(shù)及其在林木育種中應(yīng)用的意義

1.1 單倍體育種技術(shù)

林木育種是一種根據(jù)特定目的對(duì)供體植物的遺傳信息進(jìn)行改良，使其表達(dá)出滿足人們需要的穩(wěn)定性狀的技術(shù)。林木育種技術(shù)主要利用林木種群在自然以及人工誘導(dǎo)的條件下產(chǎn)生遺傳物質(zhì)變異和分化，然后人們可以根據(jù)需要從所有類型中挑選并分離出滿足預(yù)定目標(biāo)的個(gè)體或者群體，之后進(jìn)行批量繁殖。因此，林木育種的最終目的是為林業(yè)創(chuàng)造出更加優(yōu)質(zhì)、高產(chǎn)和性狀穩(wěn)定的林木品種以滿足人們生產(chǎn)和生活需要，且培育出的品種可適應(yīng)自然生長以及栽培的優(yōu)勢(shì)良種，這樣在實(shí)際應(yīng)用中才能發(fā)揮出林木的自然生長潛能、森林豐富的效益。

植物的花粉（即雄配子）通過傳粉作用能夠與卵細(xì)胞（即雌配子）之間通過受精作用結(jié)合在一起形成受精卵，受精卵進(jìn)一步發(fā)育成植物的種子。種子長成植株后，植株中的細(xì)胞包含來自精卵細(xì)胞的染色體，也就是父母雙方的兩套遺傳信息，遺傳學(xué)將其稱之為“二倍體”。雄配子（花粉）和雌配子（卵細(xì)胞）是植物的花粉母細(xì)胞和大孢子細(xì)胞通過減數(shù)分裂形成的，經(jīng)過減數(shù)分裂后，花粉和卵細(xì)胞各自擁有來自親代1/2 的染色體，因此被稱為單倍體。植物可以通過雌雄配子受精作用形成新的植株，也可以由雌配子或雄配子直接形成植物體。單倍體植物無法結(jié)出具有遺傳作用的果實(shí)，但是在某些特殊的自然條件以及人工處理手段的作用下也可以使單倍體加倍，形成穩(wěn)定性狀的純合子二倍體植物，這種方式產(chǎn)生的植物能夠正常結(jié)實(shí)且后代性狀不再發(fā)生分離。

利用人工作用誘導(dǎo)植物產(chǎn)生單倍體植株，再對(duì)其進(jìn)行加倍處理形成穩(wěn)定二倍體植物的技術(shù)就是單倍體育種技術(shù)，其能夠迅速培育出符合預(yù)期要求的穩(wěn)定優(yōu)良性狀的植物品種，而且相比自然雜交選育節(jié)省了更多的育種時(shí)間，提高了育種效率。單倍體育種技術(shù)已經(jīng)在農(nóng)作物育種以及林木育種中取得了不錯(cuò)的成果，對(duì)于改善人類生活品質(zhì)作出了巨大貢獻(xiàn)。

1.2 單倍體技術(shù)用于林木育種的意義

傳統(tǒng)的植物育種方式主要是利用優(yōu)良品種自交選育以及優(yōu)勢(shì)雜交育種這兩種方式來篩選性狀優(yōu)良的穩(wěn)定植株。然而以上兩種方式對(duì)于育種者的要求非常嚴(yán)格，需要育種者具備豐富的育種經(jīng)驗(yàn)，且育種周期非常漫長。

雜交育種的方式會(huì)使植物的后代出現(xiàn)性狀分離，要從中獲取穩(wěn)定性狀，就需要5～6 代甚至更多代不斷進(jìn)行雜交選擇；即使最終能夠得到復(fù)合預(yù)期目標(biāo)的新品種，但是花費(fèi)的時(shí)間以及投入的人力、物力等非常巨大，不滿足經(jīng)濟(jì)、高效的要求，不利于商業(yè)化育種。假設(shè)能夠利用植物花粉或卵細(xì)胞直接培育單倍體植物，再利用人工對(duì)其進(jìn)行加倍，就能很快得到類型豐富且不再進(jìn)行性狀分離的純合二倍體植物，將這些植株進(jìn)行繁殖后從中篩選良種進(jìn)行培育，就能得到復(fù)合預(yù)期目標(biāo)的優(yōu)良植物品種，加快了育種速度，提高了育種效率。

為了得到滿足預(yù)期目標(biāo)的穩(wěn)定二倍體良種，雜交育種技術(shù)需要花費(fèi)若干年的時(shí)間不斷進(jìn)行良種自交，手續(xù)繁雜且耗時(shí)良久；利用單倍體誘導(dǎo)技術(shù)對(duì)植物進(jìn)行染色體加倍，僅僅需要一年時(shí)間就能獲得標(biāo)準(zhǔn)自交系。人工誘導(dǎo)單倍體育種是獲得新品種的有效方式，對(duì)于林木育種來說，想要獲得穩(wěn)定、優(yōu)良的品種需要很長時(shí)間，但借助單倍體誘導(dǎo)，當(dāng)代就能獲得性狀變異的植株，在選中優(yōu)良的單倍體突變植株后立即進(jìn)行染色體加倍處理就能得到完整的純合二倍體，因此是一種快速獲得良種林木的方式。

遠(yuǎn)緣雜種的父母親代之間的遺傳物質(zhì)不能融合，因此難以產(chǎn)生后代。但是遠(yuǎn)緣雜種的植物花粉中有少數(shù)具備生活力，因此將這些具有生活力的花粉培育成單倍體植株后再對(duì)其進(jìn)行染色體加倍，就能得到遠(yuǎn)緣雜交的優(yōu)良品種。由于林木不似一年生農(nóng)作物品種能夠快速結(jié)實(shí)，林木生長周期十分漫長，因此一直以來人類難以解決林木育種中的遺傳學(xué)問題。單倍體育種技術(shù)的發(fā)展，為研究林木的遺傳變異規(guī)律提供了極大的便利和可能性，這對(duì)于林木遺傳學(xué)的發(fā)展和進(jìn)步起到了推動(dòng)作用[1]。

2 林木單倍體育種方式

誘導(dǎo)單倍體植物產(chǎn)生的方式主要有兩種，第一種是利用植物的雌配子進(jìn)行誘導(dǎo)，被稱為孤雌生殖；第二種是利用植物的雄配子進(jìn)行誘導(dǎo)，被稱為孤雄生殖。目前人們利用單倍體誘導(dǎo)的方式已經(jīng)培育出了多種農(nóng)作物，在林木育種中有了很多成果，如榆樹、楊樹、油松以及樟子松等林木都實(shí)現(xiàn)了單倍體育種。

2.1 雌配子體誘導(dǎo)產(chǎn)生單倍體

孤雌生殖就是將植物未受精的子房和胚珠單獨(dú)進(jìn)行離體培養(yǎng)，誘導(dǎo)雌配子體通過單性發(fā)育長成再生植株。1976 年San Noeum 利用孤雌生殖的方式成功獲取了植物單倍體植株，后來人們陸續(xù)用孤雌生殖的方式培育了單倍體楊樹、橡膠以及刺槐等。目前生物遺傳學(xué)對(duì)于卵細(xì)胞的分離和培養(yǎng)仍然比較困難，培養(yǎng)具有8個(gè)卵細(xì)胞核的胚囊是誘導(dǎo)植物雌配子發(fā)育的方法。子房中的卵細(xì)胞、助細(xì)胞以及反足細(xì)胞都可以同時(shí)被誘導(dǎo)發(fā)育成為單倍體胚胎，但是只有卵細(xì)胞發(fā)育出的單倍體胚胎才是最終所需要的目標(biāo)單倍體。在植物的花朵中，一個(gè)胚珠中僅有1 枚卵細(xì)胞，從數(shù)量上來講遠(yuǎn)遠(yuǎn)少于單個(gè)花藥中所含有的小孢子及花粉，這也是雌配子體誘導(dǎo)成功效率低于雄配子的原因之一。自然界中有一些植物天然具有孤雄生殖障礙或是缺少花粉，還有一些通過雄配子誘導(dǎo)后產(chǎn)生了白化苗，以上這些植物只能依靠孤雌生殖才能獲得單倍體，因?yàn)榇坪伺囵B(yǎng)的植株產(chǎn)生的單倍體遺傳性狀更加穩(wěn)定，也不易出現(xiàn)白化苗。

實(shí)踐證實(shí)，誘導(dǎo)雌配子體發(fā)育具有內(nèi)在的穩(wěn)定性，這是因?yàn)榕吣野l(fā)育不會(huì)因?yàn)殡x體條件的改變而限制胚珠發(fā)育出單倍體，而且實(shí)踐中雌配子體誘導(dǎo)的手段更多，誘導(dǎo)原理是讓雌花接受不能使雌配子受孕的花粉，這樣雖然沒有受精作用，但是雌配子體細(xì)胞受到刺激也會(huì)不斷分裂并生長成為完整的胚胎。

目前人工利用一些化學(xué)或物理方式也可誘導(dǎo)植物產(chǎn)生單倍體植株。上述方式屬于我國苗木培育中常用的方式，美國多選擇遠(yuǎn)緣種間雜交的方式開展單倍體誘導(dǎo)。比如美國利用灰楊、銀白楊以及美洲黑楊中不能使雌配子受精的花粉作為誘導(dǎo)雌配子產(chǎn)生單倍體的父本，根據(jù)比例將其混合后為楊樹授粉，即可獲得楊樹的單倍體植株。

2.2 雄配子體誘導(dǎo)產(chǎn)生單倍體

誘導(dǎo)雄配子產(chǎn)生單倍體主要是將植物花粉與花藥，即雄配子進(jìn)行離體培養(yǎng)，誘導(dǎo)其發(fā)育出單倍體植株。目前花藥離體培養(yǎng)和花粉離體培養(yǎng)是人工干預(yù)使植物通過孤雄生殖方式發(fā)育出單倍體的兩個(gè)主要途徑?；ǚ垭x體培養(yǎng)屬于對(duì)生殖細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，所有植物的再生植株都是經(jīng)過雄配子發(fā)育而來的單倍體?；ǚ叟囵B(yǎng)的難度較大，成功率低，不適宜商業(yè)化使用?；ㄋ庪x體培養(yǎng)是目前應(yīng)用較為廣泛的單倍體培養(yǎng)方式，屬于器官培養(yǎng)，得到的單倍體植物植株有可能來自于花粉，也有可能來自花藥內(nèi)體細(xì)胞。優(yōu)點(diǎn)是操作簡單、成功率高，因此目前應(yīng)用的范圍比較廣泛。在花藥離體培養(yǎng)的過程中，花藥和花粉通過細(xì)胞分裂與增殖，會(huì)形成愈傷組織，愈傷組織不斷發(fā)育最終長成完整的單倍體植株，花粉在此過程中可以直接生成胚體，形成單倍體植株。下面介紹花藥離體培養(yǎng)的步驟。

1）制備培養(yǎng)基。花藥離體培養(yǎng)選用的是LB 培養(yǎng)基，在培養(yǎng)基中加入2，4-D 等合適的生長素，再添加一些細(xì)胞分裂素促進(jìn)細(xì)胞分裂繁殖，調(diào)節(jié)培養(yǎng)基pH值為6 的弱酸性環(huán)境，添加1%瓊脂并置于熱壓環(huán)境下滅菌15 min。培育期間，在誘導(dǎo)植物花藥發(fā)育出愈傷組織后，再補(bǔ)充培養(yǎng)基內(nèi)的生長素、細(xì)胞分裂素進(jìn)一步促進(jìn)細(xì)胞分裂分化。觀察到愈傷組織分化出根和芽后，再次補(bǔ)充少量細(xì)胞生長素[2]。

2）接種花藥使之發(fā)育出愈傷組織。在花粉由四分孢子期至單核靠邊期，將花芽置于漂白粉溶液中消毒10 min，再無菌漂洗幾次。接著剝開花芽的芽鱗，將花藥接種到花芽中，置于適宜生長環(huán)境下培養(yǎng)，等待植物長出愈傷組織。

3）誘導(dǎo)愈傷組織，促進(jìn)花芽分化出根和芽?；ㄋ幖盎ㄑ堪l(fā)育出愈傷組織后，待愈傷組織長成黃豆粒大小時(shí)，可以手動(dòng)將愈傷組織轉(zhuǎn)移到第一步培養(yǎng)基中進(jìn)一步培育。日間溫度在25～30 ℃，夜間溫度在15～20 ℃，每日保持充足的光照時(shí)間，時(shí)間約為10 h。期間必須保障培養(yǎng)基內(nèi)營養(yǎng)物質(zhì)充足，及時(shí)補(bǔ)充營養(yǎng)成分和細(xì)胞分裂素，保障愈傷組織能夠正常分裂分化。待愈傷組織分裂出完整的根和芽，且生長情況良好，可將其移出置于花盆中繼續(xù)培養(yǎng)。

4）染色體檢查。愈傷組織發(fā)育出根和芽即代表單倍體植株發(fā)育成功，但是愈傷組織幼苗并非源于同一品種林木，因此在培育時(shí)必須要對(duì)染色體進(jìn)行檢查，觀察其染色體數(shù)目，分辨出可能的林木種類。在檢查的過程中，從愈傷組織生長態(tài)勢(shì)較好的區(qū)域邊緣處取下一小部分作為檢查樣本，將樣本置于1%醋酸洋紅溶液中進(jìn)行染色，制片，在電子顯微鏡下觀察幼苗的根尖，分辨染色體數(shù)目。

2.3 單倍體植株染色體加倍

培育出符合預(yù)期目標(biāo)的單倍體植株后，需要對(duì)單倍體進(jìn)行加倍，使其成為性狀穩(wěn)定的二倍體。在生物學(xué)上，選用秋水仙素溶液對(duì)單倍體植物進(jìn)行浸泡，或在植物生長點(diǎn)上涂抹含有秋水仙堿的羊毛脂，在這兩種方式中秋水仙素和秋水仙堿的濃度一般為0.1%～0.4%，均可以促進(jìn)單倍體植物的染色體加倍。單倍體植株或愈傷組織在細(xì)胞分裂素培養(yǎng)基生長的過程中，有時(shí)也會(huì)出現(xiàn)染色體自然加倍的現(xiàn)象。在進(jìn)行染色體加倍操作后，單倍體植株會(huì)形成純合的二倍體植物，后代不再發(fā)生性狀分離。待植物生長穩(wěn)定后，可以根據(jù)預(yù)期目標(biāo)選取滿足需求的植物，進(jìn)行直接栽培或是進(jìn)一步雜交來確保其擁有良好的品質(zhì)[3]。

3 花藥培養(yǎng)在林木育種中的應(yīng)用

3.1 林木育種中花藥培養(yǎng)的現(xiàn)狀

單倍體技術(shù)在林木培育中的應(yīng)用最早是1964 年印度科學(xué)家利用曼陀羅花粉實(shí)現(xiàn)的。1974 年，日本科學(xué)家利用花藥離體培養(yǎng)技術(shù)成功對(duì)楊樹進(jìn)行了離體培養(yǎng)，但是并沒有發(fā)現(xiàn)單倍體。王敬駒（1975）利用花藥離體培養(yǎng)獲得了穩(wěn)定的黑楊單倍體植株。此后，花藥離體培養(yǎng)技術(shù)在林木育種中得到了廣泛的應(yīng)用，橡膠、樟子松等林木均可以通過此方式獲得單倍體植株。在實(shí)際應(yīng)用中，林木不同于農(nóng)作物，其生長周期較長，且植物的生理狀態(tài)與生長環(huán)境（如溫度、降水量以及光照）等都有很大的關(guān)系，這些外界的環(huán)境會(huì)影響花藥離體培養(yǎng)的最終結(jié)果，進(jìn)而導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)難以重復(fù)，阻礙了花藥培養(yǎng)在林木育種中的大范圍應(yīng)用。目前，人類利用花藥離體培養(yǎng)的方式成功獲得的單倍體植物有楊柳科的黑楊，遼楊、山茶科的茶樹，蕃蔽科的蘋果、大戟科的橡膠等，種類豐富，優(yōu)良品種和成果較多。尤其是其中的三葉橡膠、楊樹，因?yàn)樵缧┠耆祟悓?duì)其研究開展的種類較多且時(shí)間久，目前研究已經(jīng)達(dá)到一定深度，后續(xù)也將加大研究力度。

3.2 當(dāng)前林木育苗中花藥培養(yǎng)的缺陷

花藥離體培養(yǎng)技術(shù)已經(jīng)是目前能夠獲得純合基因型的最有效和經(jīng)濟(jì)的方式，然而花藥離體培養(yǎng)仍然存在一些缺陷。

首先，供體植物本身的類型和基因型對(duì)于配子離體培養(yǎng)的成功率和效率起到了直接的影響，尤其是雄配子誘導(dǎo)具有強(qiáng)烈的物種依賴性，不同的物種之間對(duì)于花藥和小孢子的應(yīng)答有所差別?；ㄋ庪x體培養(yǎng)具有很強(qiáng)烈的基因型依賴性，所以物種之間的基因差異是導(dǎo)致花藥離體培養(yǎng)結(jié)局的主要原因。同時(shí)，由于花藥離體培養(yǎng)并不能打破不良基因連鎖，導(dǎo)致基因之間的重組概率減少，很多的豆科植物和林木都會(huì)被視為頑拗基因型，只有很少一部分花藥能夠成功培育出單倍體植株。林木本身的生長狀態(tài)對(duì)于單倍體培養(yǎng)結(jié)果也會(huì)造成很大的影響，由于花藥中的小孢子數(shù)量、活力以及營養(yǎng)狀況等都具有差異，這些都會(huì)影響雄配子的生長和發(fā)育，最終影響單倍體植株的誘導(dǎo)成功率。一般而言，植物在自然界中生長比其在溫室中培養(yǎng)更加容易存活，自然環(huán)境下的植物雄配子誘導(dǎo)效率更高，可以說自然環(huán)境是最天然高效的花藥發(fā)育環(huán)境，而且林木的生長周期較長，體積大，很難完成溫室種植，因此自然環(huán)境更有利于林木花藥的繁育。但林木植株難以通過人工來改善環(huán)境溫度和光照促其生長，難以控制植物的生理狀態(tài)，而且在自然環(huán)境中花藥的取材耗時(shí)長，受到環(huán)境的影響較大，質(zhì)量參差不齊，這些問題會(huì)導(dǎo)致花藥離體培養(yǎng)的周期不斷加大。

其次，花藥發(fā)育出愈傷組織后，對(duì)其進(jìn)行人工誘導(dǎo)使其繼續(xù)分裂分化的難度大，即使分裂分化出根和芽，得到的后代植株混亂、染色體倍數(shù)不清晰是當(dāng)前花藥離體培養(yǎng)面臨的難題?；ㄋ庪x體培養(yǎng)是器官培養(yǎng)類型。植物的花藥中除了小孢子之外，還有花藥壁、花絲等體細(xì)胞，這些體細(xì)胞的生長和分裂會(huì)干預(yù)小孢子的分裂，最終得到的愈傷組織也有極大可能是由體細(xì)胞發(fā)育而來。體細(xì)胞愈傷組織分化得到的單倍體植株的生活力弱、增殖比較慢，無法與二倍體細(xì)胞競爭導(dǎo)致后續(xù)被二倍體愈傷組織取代，使單倍體培育失敗。

再次，愈傷組織在培養(yǎng)中有可能自然形成染色體加倍，產(chǎn)生多倍體的胚胎，這種自然加倍的情況會(huì)干擾花藥離體培養(yǎng)的結(jié)局，降低成功概率。

4 林木單倍體育種前景與展望

首先，通過改良植物基因提高林木的培養(yǎng)效率?；ㄋ庪x體培養(yǎng)的工作重點(diǎn)是選取性狀表現(xiàn)優(yōu)良、再生頻率高的基因型，而不是將重點(diǎn)研究放在改善頑拗基因型培養(yǎng)條件上。開展花藥離體培養(yǎng)時(shí)，反應(yīng)較差的基因型可以通過雜交育種來促進(jìn)雄配子發(fā)育，例如科學(xué)家通過對(duì)柑橘的雜種花藥培養(yǎng)得到了三倍體的柑橘純合子愈傷組織。因此，在培育林木時(shí)，應(yīng)該開拓思維方式，將多種培育方式有機(jī)結(jié)合，優(yōu)化培養(yǎng)方式增加成功率，將雜交方式和單倍體誘導(dǎo)方式結(jié)合使用是單倍體育種值得借鑒的方式。

其次，優(yōu)化林木的花藥離體培養(yǎng)方式，減少體細(xì)胞的干擾。在花藥培養(yǎng)中，小孢子發(fā)育時(shí)容易受到體細(xì)胞分裂分化的影響。為了減少這種不良影響，可以對(duì)花藥使用固液雙層培養(yǎng)來進(jìn)行培育。這樣處理后，花藥正常開裂并且不會(huì)產(chǎn)生愈傷組織，成功避開體細(xì)胞影響，不會(huì)對(duì)小孢子細(xì)胞造成傷害。

再次，應(yīng)強(qiáng)化對(duì)于林木花藥培養(yǎng)機(jī)理的研究。當(dāng)前在花藥離體培養(yǎng)的過程中，再生出的植物植株染色體倍數(shù)混亂，因此需要加強(qiáng)對(duì)于林木花藥培養(yǎng)的理論研究，借助現(xiàn)代分子生物技術(shù)手段，拓展單倍體花藥的獲取方式，對(duì)各種林木適宜的培養(yǎng)環(huán)境有系統(tǒng)性認(rèn)識(shí)，促進(jìn)林木育種工作更進(jìn)一步發(fā)展。