一種基于等溫擴增的便攜式核酸檢測系統(tǒng)*

譚智廣，徐 征，吳夢希，劉軍山

（大連理工大學遼寧省微納米技術及系統(tǒng)重點實驗室，遼寧 大連 116024）

0 引言

聚合酶鏈式反應（PCR）具有較高的特異性和靈敏度，基于PCR的核酸檢測已成為病原體檢測的金標準。PCR通常需要經(jīng)歷30～40次的擴增循環(huán)才能達到檢測所需的濃度，每次循環(huán)包含變性、退火和延伸3個反應步驟，分別需要在不同溫度下進行。因此，基于PCR的核酸檢測技術需要對反應溫度進行反復的升降溫控制，無法快速得到檢測結(jié)果。為此，研究人員開發(fā)了多種基于等溫擴增的核酸檢測技術，例如環(huán)介導等溫擴增、重組酶聚合酶擴增等?；诘葴財U增的核酸檢測過程不需要進行不同溫度之間的調(diào)整，對溫度控制系統(tǒng)的要求大大降低，并且不需要變溫調(diào)整時間。美國疾病控制中心的Calvert等[1]基于逆轉(zhuǎn)錄環(huán)介導等溫擴增技術開發(fā)了快速檢測尿液或血清中寨卡病毒的分析方法，能夠在20～35 min的時間內(nèi)獲得檢測結(jié)果。清華大學的Lin等[2]設計了基于微流控芯片的便攜式系統(tǒng)，利用逆轉(zhuǎn)錄環(huán)介導等溫擴增技術能夠在50 min內(nèi)同時檢測4種Ebola病毒。

現(xiàn)場即時檢測（Point-of-care testing，POCT）[3-4]是指利用便攜式分析設備，在患者附近即可進行的現(xiàn)場檢測，具有操作簡單、快速等特點，在疫情防控、海關及檢驗檢疫等領域具有廣泛應用前景。日本東北大學的Wakao等[5]搭建了微型裝置的便攜式熒光偏振免疫分析儀，尺寸為35 cm×15 cm×15 cm，能夠同時對96個獨立樣本中的真菌毒素進行熒光偏振免疫分析。德國杜伊斯堡-埃森大學的Tran等[6]設計了一種便攜式拉曼/SERSLFA讀寫器，采用定制的光纖探針實現(xiàn)了對妊娠激素人絨毛膜促性腺激素（hGG）以及兩種細胞因子IL6和IL8的檢測，能夠在數(shù)秒時間內(nèi)獲得檢測結(jié)果。基于核酸擴增的POCT技術還相對較少，這主要是由于大多數(shù)的核酸檢測系統(tǒng)體積龐大，操作復雜，無法滿足便攜化的要求。

為此，本文設計制作了一種基于等溫擴增的便攜式核酸檢測系統(tǒng)，通過輕量化設計等使其便于攜帶和操作，而且檢測快速，因此有望用于病原體核酸的現(xiàn)場即時檢測。

1 總體方案設計

本文設計的核酸檢測系統(tǒng)主要包括溫度控制模塊、熒光檢測模塊和樣品移動模塊，如圖1所示。其中，溫度控制模塊能夠提供核酸擴增過程所需的溫度，確保反應正常高效進行。熒光檢測模塊提供檢測所需的激發(fā)光，同時將核酸擴增產(chǎn)物的熒光信號采集后進行模數(shù)轉(zhuǎn)換以供后續(xù)處理。樣品移動模塊能夠移動溫度控制模塊對16個PCR管進行逐個掃描，使得檢測系統(tǒng)最多可實現(xiàn)16個樣品的同時檢測，提高了檢測通量。同時，該系統(tǒng)還配備了一臺高性能工控一體機，負責進行人機交互，方便操作人員進行檢測條件設置和實驗結(jié)果實時分析。如圖1所示，基于STM32單片機設計了帶有多路串口通信和步進電機控制脈沖發(fā)生器的主控板，系統(tǒng)的3個功能模塊通過下位主控板進行協(xié)調(diào)與控制。其中，溫度控制器、熒光檢測裝置以及上位工控機經(jīng)過RS-232串行接口總線進行指令和數(shù)據(jù)傳輸；樣品移動模塊通過步進電機驅(qū)動器由STM32單片機的定時器外設產(chǎn)生數(shù)字脈沖信號進行控制。此外，為了使檢測系統(tǒng)能夠?qū)崿F(xiàn)室外操作的便攜化，設計的3個功能模塊均可以利用24 V直流電池進行供電。

圖1 核酸檢測系統(tǒng)總體框圖

2 功能模塊設計與搭建

2.1 溫度控制模塊

半導體制冷片是一種基于帕爾貼效應，通過調(diào)節(jié)電流的方向能夠?qū)ν饨邕M行加熱或制冷的熱電器件。它具有體積小、熱慣性小、無噪聲、可快速變溫等優(yōu)點，被廣泛用于核酸擴增儀器的溫度控制[7-10]。本文以半導體制冷片為核心設計了溫度控制模塊，如圖2所示。半導體制冷片的非工作面采用定制的全銅針式散熱器進行散熱，通過在散熱器外表面涂敷碳納米管以及安裝風扇加速空氣流動增強其與空氣換熱。半導體制冷片的工作面直接與可同時放置16個PCR管的 加熱 臺 接觸，實現(xiàn)對PCR管的均勻傳熱。為了提高升降溫速率，對加熱臺的體積進行了優(yōu)化，使其熱容量盡量減小，從而降低變溫過程所需的能量。為了保證各PCR管之間溫度分布的均勻性，材料選用了導熱性能優(yōu)良的無氧銅。此外，為了減小外界環(huán)境對加熱臺溫度的影響，同時減少非必要的熱量散失，利用尼龍外殼對加熱臺進行了包裹，并在其內(nèi)部填充了納米氣凝膠隔熱氈。

圖2 溫度控制模塊實物

選用雙通道數(shù)字溫度控制器對半導體制冷片進行控制，采用了開關模式電源技術，能夠高效地控制電流。控制器的工作電壓為24 V，輸出經(jīng)濾波后電流紋波小，可以減小對半導體制冷片的電流沖擊，延長其使用壽命。利用熱電阻進行溫度反饋，通過調(diào)節(jié)控制器的PID參數(shù)，溫度控制模塊的平均升溫速率為2.5℃/s，升溫速率較快可以減小前期預熱時間。該溫度控制器的溫度控制精度為±0.1℃，可以滿足等溫擴增所需的溫度控制要求。

2.2 熒光檢測模塊

熒光檢測模塊主要由具有475 nm激發(fā)波長和525 nm探測波長的高精度微型熒光探測器和恒流源組成。該模塊采用了正交式光路，可以避免背景噪聲對熒光值測量結(jié)果的干擾。采用LED和硅光電二極管作為激發(fā)光源和光探測器，有效減小了系統(tǒng)的尺寸和功率。光探測器和信號處理電路安裝在同一電路板上，經(jīng)模數(shù)轉(zhuǎn)換后通過串口輸出。相比于模擬信號，數(shù)字信號輸出具有更加優(yōu)秀的抗干擾能力，同時這種模數(shù)轉(zhuǎn)換的就近設計能夠減小噪聲干擾，確保光學檢測的可靠性。此外，檢測的光斑直徑為6.5 mm，比PCR管的管口直徑略大，確保了足夠大的采光面積，能夠有效收集熒光信號。

2.3 樣品移動模塊

樣品移動模塊的主要作用是通過移動溫度控制模塊，使得熒光檢測模塊能夠?qū)?6個PCR管進行并行檢測。

同步帶傳動方式具有平穩(wěn)、靜音等優(yōu)點，非常適合輕便、輕載的應用場合，因此本文參考CoreXY平面運動結(jié)構[11-12]，設計了基于同步帶傳動的樣品移動模塊，如圖3所示。該模塊具有X軸和Y軸兩個直線運動自由度，均采用步進電機進行驅(qū)動。模塊的傳動機構由2條同步帶和7個同步帶帶輪組成，其中2個帶輪連接步進電機的輸出軸作為驅(qū)動輪。2個電機固定在機架上，移動平臺的運動依賴于2個電機的協(xié)調(diào)動作，這種設計顯著減小了移動模塊的運動慣性，使其運動狀態(tài)切換更加靈活。規(guī)定電機順時鐘轉(zhuǎn)速為正，得到移動平臺的運動速度為：

圖3 安裝控溫樣品臺的樣品移動模塊局部俯視圖

式中：vx和vy分別為移動平臺沿X軸和Y軸方向的運動速度；ω1和ω2分別為左右電機的轉(zhuǎn)速；d為電機輸出同步帶輪的直徑。

為了保證步進電機的開環(huán)控制精度，選用了五相步進電機，其基本步距角為0.36°，可進行15級細分，有利于在移動平臺運動過程中減弱或消除步進電機的低頻振動，同時也能夠提高電機的角度定位精度。采用光電開關實現(xiàn)移動平臺的位置歸零，使用S型加減速算法確保步進電機在啟動和停止過程中速度和加速度的連續(xù)性，減小沖擊，進一步提高運動平穩(wěn)性。

2.4 系統(tǒng)控制軟件

本文采用7 inch的工業(yè)平板電腦作為核酸檢測系統(tǒng)的上位機，主要實現(xiàn)人機交互功能，其他功能模塊的控制均由下位單片機實現(xiàn)。上位機通過RS-232總線將反應參數(shù)和指令傳遞給下位單片機，并從下位機讀取溫度和熒光數(shù)據(jù)。采用Python編程語言，基于PyQt5圖形界面框架，設計開發(fā)了系統(tǒng)的圖形化控制軟件。該控制軟件可以顯示檢測系統(tǒng)的運行進度和狀態(tài)，以數(shù)值方式實時顯示加熱臺的溫度值，以及繪制熒光強度曲線。操作人員只需手動將樣品放置到加熱臺上，點擊“開始”按鈕，即可開始自動化的核酸檢測。待檢測結(jié)束后，控制軟件會自動將溫度和熒光強度數(shù)據(jù)保存至電腦，用于后續(xù)的分析處理。

3 系統(tǒng)的應用驗證

本文使用濃度為4.4×109copies/μL的黃瓜綠斑駁花葉病毒質(zhì)粒作為測試樣品，基于環(huán)介導等溫擴增技術對其進行核酸檢測。在加熱臺上隨機選擇了4個位置安放4個PCR管，其中1號、2號和3號PCR管內(nèi)裝有病毒質(zhì)粒和擴增反應試劑，4號PCR管內(nèi)只有反應試劑作為實驗的陰性對照。溫度控制參數(shù)為：63℃，15 s；63℃，45 s，35次溫度循環(huán)。整個檢測過程只需45 min，獲得的核酸擴增曲線如圖4所示。從圖中可以看出，隨著循環(huán)次數(shù)的增加，從1、2、3號PCR管中檢測到的熒光信號強度逐漸增加，最后趨于平衡；由于4號PCR管內(nèi)沒有病毒質(zhì)粒，因此從該管中檢測到的熒光信號強度很弱，且不隨循環(huán)次數(shù)的增加而發(fā)生變化。該實驗證明了本文研制的系統(tǒng)可以很好地用于基于等溫擴增的核酸檢測。

圖4 環(huán)介導等溫擴增曲線

4 結(jié)束語

本文設計制造了一種基于等溫擴增的便攜式核酸檢測系統(tǒng)?；诎雽w制冷片構建的溫度控制模塊的控溫精度可以達到±0.1℃；采用LED和硅光電二極管作為激發(fā)光源和光探測器有效減小了熒光檢測模塊的尺寸和功率，高度集成的采集電路提高了光學檢測的抗干擾能力；參考CoreXY平面運動結(jié)構設計的樣品移動模塊，具有運動平穩(wěn)、噪聲低等特點，而且顯著減輕了系統(tǒng)的重量。操作人員通過上位工控機的控制軟件進行檢測參數(shù)設置，發(fā)送給下位單片機控制上述模塊完成檢測。檢測系統(tǒng)可以采用24 V直流電池進行供電，有利于室外操作的便攜化。利用該系統(tǒng)，基于環(huán)介導等溫擴增技術對黃瓜綠斑駁花葉病毒質(zhì)粒進行了核酸檢測，在45 min內(nèi)獲得了檢測結(jié)果。