伊犁馬PFKM基因表達(dá)及酶活性分析

王 潔，孟 軍,2，曾亞琦,2，王建文,2，吐?tīng)栠d江·吾木爾艾力，王川坤，袁鑫鑫，王彤亮，姚新奎,2

(1.新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院/新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)馬產(chǎn)業(yè)研究院，烏魯木齊 830052；2.新疆馬繁育與運(yùn)動(dòng)生理重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，烏魯木齊 830052；3.新疆伊犁哈薩克自治州畜牧總站，新疆伊寧 835000)

0 引 言

【研究意義】伊犁馬環(huán)境適應(yīng)性和抗病力極強(qiáng)，耐粗飼、耐寒，擁有力量與速度并存點(diǎn)，探究伊犁馬糖酵解具有深刻的研究意義[1-3]。在葡萄糖分子轉(zhuǎn)化利用的過(guò)程中，PFKM基因?qū)α姿峁羌っ傅挠兄匾绊?，而磷酸果糖激酶是糖酵解過(guò)程的起點(diǎn)[4]。糖酵解途徑中有3個(gè)重要的限速酶，即己糖激酶(HK，hexokinases)、磷酸果糖激酶-1(PFK1，phosphofructokinase1)以及丙酮酸激酶(PK，pyruvate kinase)。在其反應(yīng)中，磷酸果糖激酶(PFK)是主要的調(diào)節(jié)酶，是糖酵解途徑的起博器[5-6]。其中6-磷酸果糖激酶(6-PFK)是糖酵解過(guò)程中將ATP分解的關(guān)鍵酶[7-8]。而PFK1有3種同工酶：PFKM為肌肉型、PFKP為血小板型以及PFKL肝臟型，以四聚體或二聚體的形式參與不同組織部位的糖酵解?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】磷酸果糖激酶(PFKM)被證實(shí)可調(diào)節(jié)葡萄糖代謝及肌肉維持等多種生物過(guò)程，是糖酵解的一個(gè)關(guān)鍵限速酶，也是葡萄糖代謝中起決定作用的限速酶。這種酶催化Mg+、ATP依賴的果糖-6-磷酸磷酸化，并形成ADP和果糖-1，6-二磷酸以及刺激6-磷酸果糖激酶的活性來(lái)控制機(jī)體的糖酵解代謝[9]。研究證實(shí)PFKM基因的相對(duì)表達(dá)量直接影響糖酵解的反應(yīng)速率，在家畜家禽和豬中已證明PFKM基因表達(dá)變化與肉質(zhì)有直接的關(guān)聯(lián)性[10-12]?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】目前，在國(guó)內(nèi)外未見(jiàn)關(guān)于伊犁馬組織內(nèi)PFKM基因表達(dá)及酶活方面的有關(guān)研究。需研究測(cè)定PFKM基因在伊犁馬不同組織部位中的差異表達(dá)?！緮M解決的關(guān)鍵問(wèn)題】以伊犁馬為試驗(yàn)動(dòng)物，利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)結(jié)合酶聯(lián)免疫吸附(Elisa)檢測(cè)手段，分析心臟、肝臟、夾肌、斜方肌、背闊肌、臀中肌、半腱肌以及腹外斜肌8種組織中PFKM基因mRNA的表達(dá)水平差異及不同組織中6-PFK的酶活規(guī)律，研究糖酵解途徑中PFKM基因以及相關(guān)酶在伊犁馬生命活動(dòng)中的變化規(guī)律，為其糖酵解過(guò)程中提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 試驗(yàn)動(dòng)物

挑選年齡、體況相近的8匹伊犁馬作為試驗(yàn)對(duì)象，屠宰后1 h內(nèi)分別采集心臟、肝臟、夾肌、斜方肌、背闊肌、臀中肌、半腱肌以及腹外斜肌8種組織樣品，用自封袋包裝置于液氮罐-196℃保存。

1.1.2 主要試劑

Elisa試劑盒(6-磷酸果糖激酶)；C2H5OH(分析醇)國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司、Trizol、氯仿北京化工廠；6×Loading Buffer北京索萊寶科技有限公司；RNase-free H2O北京天根生化科技有限公司；HyperScript III RT SuperMix for qPCR with gDNA Remover、2x S6 Universal SYBR qPCR Mix等均購(gòu)自新貝(上海)生物科技有限公司。

1.2 方 法

1.2.1 引物設(shè)計(jì)與合成

根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)已發(fā)表的PFKM基因序列，利用prime 5軟件設(shè)計(jì)PFKM熒光定量PCR引物，其中GAPDH為其內(nèi)參基因。引物由新疆康普森有限公司合成。引物使用去離子水稀釋，存于-20℃冰箱內(nèi)保存。表1

表1 引物信息

1.2.2 RNA提取和cDNA合成

運(yùn)用Trizol法得到伊犁馬不同組織部位中RNA，采用1%的瓊脂糖凝膠電泳驗(yàn)證RNA的完整程度。根據(jù)反轉(zhuǎn)錄試劑盒(HyperScript III RT SuperMix for qPCR with gDNA Remover)的操作步驟反轉(zhuǎn)錄合成cDNA；反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系：RNA Template100ng-2 μg，5×RT SuperMix 4 mL，RNase-free ddH2O補(bǔ)充至20 mL ，DTT(0.1mol /L)2 mL；反應(yīng)條件：37℃ 15 min，85℃ 5s；接下來(lái)進(jìn)行離心，利用超微量紫外分光光度計(jì)檢測(cè)cDNA濃度，然后用無(wú)酶水稀5倍，-20℃保存于冰箱備用。

1.2.3 目的基因?qū)崟r(shí)熒光定量檢測(cè)

利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)測(cè)試不同部位樣本中PFKM基因mRNA表達(dá)量；反應(yīng)體系：S6 UniversaL SYBR qPCR Mix 5mL，Primer-F(10 mM)0.2 mL，Primer-R(10 mM)0.2 mL，將cDNA模板(500 ng/mL)1 mL，以及RNase-free ddH2O添加至10 mL；反應(yīng)條件：在95℃時(shí)預(yù)變性30s，95℃時(shí)變性10s，60℃時(shí)退火30s，72℃延伸至45s，總共40個(gè)循環(huán)。

1.3 數(shù)據(jù)處理

熒光定量PCR的數(shù)據(jù)用2-△△Ct法檢測(cè)PFKM基因在伊犁馬不同部位中差異表達(dá)量。第一步計(jì)算伊犁馬不同組織部位目的基因和內(nèi)參基因的Ct差值即目的基因與內(nèi)參基因的差值，接下來(lái)利用Excel計(jì)算不同部位的△Ct平均值，肝臟部位為對(duì)照組，其他部位△Ct減去肝臟的△Ct，即△△Ct也為目的基因減去內(nèi)參基因的差值，再用試驗(yàn)組-△△Ct(目的基因與內(nèi)參基因的差值)對(duì)照組[13]；PFKM基因mRNA相對(duì)表達(dá)量數(shù)據(jù)用SPSS Statistics26.0軟件ANOVA方差分析，并且在Excel中對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 伊犁馬不同組織部位提取RNA完整性檢測(cè)條帶

研究表明，伊犁馬不同組織部位中提取的RNA利用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，條帶十分清晰且整齊，亮度明顯，無(wú)特別明顯的擴(kuò)散現(xiàn)象，結(jié)果質(zhì)量好。圖1

2.2 實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR產(chǎn)物的特異性

研究表明，擴(kuò)增效率較高，斜率較高，分別為95.5%和96.4%，因其斜率較高，拐點(diǎn)鮮明，均呈“S”型，線條平緩，兩者溶解曲線顯示引物特異性和重復(fù)性較好，無(wú)引物二聚體出現(xiàn)及非特異性擴(kuò)增產(chǎn)物產(chǎn)生，擴(kuò)增曲線為人類明顯的單峰，無(wú)明顯擴(kuò)增雜峰，所設(shè)計(jì)引物特異性良好，符合試驗(yàn)的質(zhì)量要求。圖2、圖3

注：1:夾??；2:斜方肌；3:背闊?。?:臀中?。?:半腱??；6:肝臟；7:心臟；8:腹外斜肌

圖2 PFKM基因qRT-PCR 溶解曲線和擴(kuò)增曲線

圖3 GAPDH基因qRT-PCR溶解曲線和擴(kuò)增曲線

2.3 PFKM基因mRNA在不同組織的相對(duì)表達(dá)

研究表明，伊犁馬PFKM基因mRNA在心臟組織中的相對(duì)表達(dá)量最高為22.88，極顯著高于其他組織(P<0.01)；夾肌組織、斜方肌組織、背闊肌組織、臀中肌組織、半腱肌組織及腹外斜肌組織中PFKM的表達(dá)量極顯著高于肝臟組織(P<0.01)；心臟組織的表達(dá)量最高，其次是半腱肌、背闊肌、腹外斜肌、臀中肌、夾肌、斜方??；在肝臟組織中最低。圖4

圖4 伊犁馬PFKM基因mRNA在不同組織中的相對(duì)表達(dá)量

2.4 6-磷酸果糖激酶在不同組織的含量

研究表明，伊犁馬不同組織中6-PFK在心臟組織中含量為1.049 mg/L極顯著高于背闊肌、肝臟、臀中肌、半腱肌、腹外斜肌、斜方肌、夾肌(P<0.01)；而背闊肌中的含量也極顯著高于肝臟、臀中肌、腹外斜肌、半腱肌、斜方肌、夾肌(P<0.01)；臀中肌中的含量極顯著高于腹外斜肌(P<0.01)；其中臀中肌中的6-PFK顯著高于夾肌、斜方肌和肝臟(P<0.05)；半腱肌中的含量顯著高于腹外斜肌(P<0.05)；其他各組織之間含量無(wú)差異。表2

表2 6-PFK在不同組織的含量

3 討 論

在糖酵解過(guò)程中，肌肉型磷酸果糖激酶(PFKM，phosphofructokinase-muscle)已被確認(rèn)是其中之一的主要調(diào)控酶，將6-磷酸果糖激酶(6-PFK)轉(zhuǎn)化為1,6-雙磷酸果糖，此過(guò)程是不可逆的。6-磷酸果糖激酶(6-PFK)主要通過(guò)PFKM基因影響糖酵解的速率，并且PFKM基因的相對(duì)表達(dá)量直接影響糖酵解的反應(yīng)速率[10]。研究結(jié)果顯示，在伊犁馬的不同組織部位中，PFKM基因在心臟組織中高度表達(dá)，且6-磷酸果糖激酶的活性也最高，在伊犁馬的糖酵解代謝過(guò)程中，6-磷酸果糖激酶(6-PFK)的含量可能是PFKM基因的標(biāo)志代謝物。PFKM基因在伊犁馬的糖酵解過(guò)程中造成的生理及生化的具體規(guī)律尚未明晰。對(duì)PFKM基因利用熒光定量qRT-PCR檢測(cè)，開(kāi)展相應(yīng)的研究，證實(shí)PFKM基因?qū)?-磷酸果糖具有相對(duì)較高的親和力[14]。試驗(yàn)研究與以上相關(guān)實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致，通過(guò)熒光定量qRT-PCR對(duì)伊犁馬的PFKM基因的表達(dá)與6-磷酸果糖激酶(6-PFK)進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)PFKM基因和6-PFK的含量極顯著高于其他組織。在生命活動(dòng)中，PFKM基因的異常表達(dá)，也造成了葡萄糖的代謝過(guò)程的改變，尤其是增加了組織細(xì)胞的糖酵解速率，在一定水平上可以利用降低PFKM基因的表達(dá)及相關(guān)的酶活性的方法可以影響不同組織的發(fā)育水平，進(jìn)而降低細(xì)胞的生長(zhǎng)速度[15-17]。因此在PFKM基因和6-PFK在心臟組織中高度表達(dá)，其心臟在生命體能量代謝以及糖酵解途徑中，通過(guò)酶活性調(diào)節(jié)代謝的方式為機(jī)體提供能量，而磷酸果糖激酶活性的調(diào)控代謝可能在協(xié)同PFKM基因調(diào)控糖酵解代謝[18]。

采用熒光定量的方法分析PFKM基因在長(zhǎng)白豬、梅山豬等豬肌肉部位中分布，PFKM基因在豬的心肌以及骨骼肌中具有較高的相對(duì)表達(dá)量，在卵巢、子宮、脂肪組織和腎臟表達(dá)程度中等，但在其肝臟、睪丸、脾臟和肺中表達(dá)量相對(duì)較低，在小腸和胃中沒(méi)有發(fā)現(xiàn)PFKM基因的表達(dá)。Wang Jun等[19]運(yùn)用熒光定量PCR技術(shù)得出PFKM基因在豬不同部位的表達(dá)，尤其在心肌中，PFKM基因的表達(dá)量相對(duì)較高。與以上結(jié)果相似，PFKM基因在伊犁馬的心臟組織中表達(dá)顯著高于肝臟等其它組織。并且在伊犁馬的肝臟組織中PFKM基因的表達(dá)要顯著低于臀中肌、腹外斜肌、半腱肌、斜方肌、背闊肌、夾肌等組織。PFKM基因可能在伊犁馬的糖酵解過(guò)程中，通過(guò)心臟組織參與PFKM基因的重要調(diào)控機(jī)制。孫慧等[20]通過(guò)生物信息學(xué)網(wǎng)站，針對(duì)綜合質(zhì)量評(píng)分最高的微小RNA進(jìn)行進(jìn)一步的檢測(cè)以及驗(yàn)證，預(yù)測(cè)可能調(diào)控PFKM基因的微小RNA，并在PFKM基因的3’-UTR區(qū)域，推測(cè)出miR-141-3p可能是影響PFKM基因在不同組織中的的表達(dá)量進(jìn)而改變生命細(xì)胞糖酵解的過(guò)程，控制其不同組織的發(fā)育水平。在轉(zhuǎn)基因小鼠的骨骼肌中發(fā)現(xiàn)PFKM基因在低表達(dá)時(shí)檢測(cè)到ATP能量水平很低、糖原含量高，致使小鼠的大部分組織的肌肉纖維改變甚至壞死，并且致使PFKM基因相關(guān)酶活性降低了大概50%左右，使紅細(xì)胞滲透脆性增大，結(jié)果表明6-磷酸葡萄糖在肌肉中的積累，與人類GSDVⅡ的肌病和代償性溶血特征具有相似性[21]。試驗(yàn)中伊犁馬的PFKM基因在心臟組織中高表達(dá)，可能是伊犁馬具有強(qiáng)大的心肌纖維活力，在6-磷酸果糖激酶的作用下，調(diào)控PFKM基因的正常表達(dá)，更好的分解、利用ATP，為其生命活動(dòng)提供能量。Gibb等[22]利用大鼠原代的心肌細(xì)胞作為試驗(yàn)對(duì)象，并用雙CMV啟動(dòng)子的磷酸酶缺陷型的病毒分別感染心肌，根據(jù)同位素示蹤法得到，在PFKM活性較高的細(xì)胞中可以間接的限制線粒體分解以及細(xì)胞呼吸作用來(lái)增強(qiáng)糖酵解活動(dòng)。在糖酵解過(guò)程中，PFKM的表達(dá)與動(dòng)物的心肌細(xì)胞反應(yīng)密切相關(guān)，該基因可能對(duì)心肌細(xì)胞進(jìn)行糖酵解有重要的影響。

4 結(jié) 論

PFKM基因在伊犁馬的不同組織中均有表達(dá)，且存在一定的差異性，其中心臟表達(dá)高達(dá)22.88。6-PFK的含量在伊犁馬不同組織的含量也存在顯著差異性，在心臟組織中的含量約為1.049 mg/L也顯著高于其他組織。PFKM基因和6-PFK可能在糖酵解過(guò)程中起著重要作用，PFKM基因可能通過(guò)影響6-PFK的酶活，對(duì)心臟組織進(jìn)行糖酵解有重要影響，PFKM基因和6-PFK在馬匹的糖酵解過(guò)程中有重要的作用。

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