不同毛色巴什拜羊皮膚組織中LEF1、YWHAZ及WNT2基因差異表達(dá)

洪文娟，侯晨曦，何宗龍，決肯·阿尼瓦什

(新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，烏魯木齊 830052)

0 引 言

【研究意義】在哺乳動(dòng)物生長(zhǎng)過(guò)程中，被毛作為毛囊發(fā)育的皮膚衍生物，生長(zhǎng)和穩(wěn)固被毛是毛囊最主要的生理功能。毛囊中的毛囊干細(xì)胞不僅能夠通過(guò)自分泌因子成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子18(fibroblast growth factor 18,FGF18)實(shí)現(xiàn)自我調(diào)節(jié)，還可以調(diào)節(jié)其周?chē)谏丶?xì)胞參與被毛顏色的形成過(guò)程，可以決定被毛的顏色[1]。【前人研究進(jìn)展】Wnt信號(hào)因Wnt配體結(jié)合膜受體的不同而將Wnt信號(hào)分為三類(lèi)[2]，其中最為經(jīng)典的一類(lèi)是Wnt/β-catenin信號(hào)通路[3]。被Wnt信號(hào)通路激活轉(zhuǎn)錄的靶基因是細(xì)胞特異性的。Wnt通路本身的調(diào)節(jié)也是多層次的，例如β-連環(huán)蛋白(β-catenin)、Frizzled(FZD)家族蛋白、肺耐藥蛋白(lung resistance protein，LRP)、淋巴增強(qiáng)因子-1(lymphatic enhancement factor，LEF1)/T細(xì)胞因子-3(T cell factor 3，TCF3)正向的調(diào)控因子，也存在如Dickkopf(DKK)家族基因等反向的調(diào)控因子[4]。真皮中的Wnt信號(hào)在表皮基板的形成過(guò)程中是必不可少的。抑制基因Dkk1的異位表達(dá)在Wnt/β-catenin信號(hào)通路中會(huì)導(dǎo)致真皮中β-catenin以及LEF1基因表達(dá)出現(xiàn)缺失從造成表皮基板的正常形成受到阻礙[5]。無(wú)義突變的小鼠在胚胎時(shí)期會(huì)出現(xiàn)皮膚中缺少LEF1陽(yáng)性表達(dá)的表皮基板，具有功能的Wnt蛋白的產(chǎn)生和分泌在基板的形成過(guò)程中是必不可少的[6]。LEF1基因敲除后小鼠的觸須毛囊全部消失，被皮毛囊停止生長(zhǎng)；當(dāng)LEF1基因過(guò)表達(dá)時(shí)也會(huì)影響到觸須和毛發(fā)的正常生長(zhǎng)[7,8]。Wnt/β-catenin信號(hào)通路能直接調(diào)控黑色素細(xì)胞特異表達(dá)基因如小眼畸形相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子(microphthalmia-associated transcription factor，MIFT)等轉(zhuǎn)錄過(guò)程。MIFT同LEF1直接作用，協(xié)同上調(diào)多巴色素異構(gòu)酶(dopachrome tautomerase，DCT)的表達(dá)。【本研究切入點(diǎn)】小鼠的LEF1基因被敲除之后雖然不產(chǎn)生黑素但是黑素細(xì)胞依然存在，LEF1基因涉及黑素細(xì)胞合成或者向鄰近毛發(fā)角蛋白細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)色素的能力[9]。Wnt/β-actenin信號(hào)在毛母質(zhì)細(xì)胞生長(zhǎng)期具有調(diào)控其增殖和分化的作用，毛母質(zhì)細(xì)胞內(nèi)的LEF1基因表達(dá)及核內(nèi)聚集的β-catenin,毛母質(zhì)細(xì)胞內(nèi)擁有活躍的Wnt/β-actenin信號(hào)。當(dāng)毛囊角蛋白細(xì)胞分化形成毛干，其基因表達(dá)過(guò)程中研究發(fā)現(xiàn)存在啟動(dòng)子區(qū)域含有多個(gè)Tcf/LEF結(jié)合位點(diǎn)。上述角蛋白基因被認(rèn)為是Wnt信號(hào)的靶基因[10]。WNT2基因是WNT家族的成員之一，在WNT2基因與腫瘤的形成和轉(zhuǎn)移之間的分子機(jī)制研究有較多的成果[11，12]，在細(xì)胞的生長(zhǎng)、增殖過(guò)程中WNT2基因發(fā)揮著重要的作用，揭示了在此過(guò)程中WNT信號(hào)作用的細(xì)胞類(lèi)型，在毛囊形成的不同階段WNT信號(hào)處在一個(gè)高度調(diào)節(jié)動(dòng)態(tài)。WNT2基因具有潛在的研究?jī)r(jià)值，作為綿羊毛囊發(fā)育的潛在關(guān)鍵基因[13]。毛囊干細(xì)胞不僅實(shí)現(xiàn)自我調(diào)節(jié)，會(huì)調(diào)控其周?chē)暮谏丶?xì)胞參與被毛顏色的形成[14]。酪氨酸3-單加氧酶/色氨酸5單加氧酶激活蛋白ζ(tyrosine3-monooxygenase/tryptophan5-monooxygenase activation protein zeta，YWHAZ)基因是14-3-3家族成員之一，YWHAZ表達(dá)的蛋白是一種中樞蛋白，有結(jié)合功能多樣的信號(hào)蛋白的能力，包括跨膜受體、激酶和磷酸酶，在調(diào)節(jié)多種信號(hào)傳導(dǎo)途徑例如在Wnt/β-actenin信號(hào)通路、抑制細(xì)胞凋亡等發(fā)揮重要作用[15]。巴什拜羊皮膚中LEF1、WNT2、YWHAZ的表達(dá)情況與毛色之間相關(guān)性分析，尚未見(jiàn)到研究報(bào)道。【擬解決的關(guān)鍵問(wèn)題】研究LEF1、WNT2、YWHAZ作為潛在的毛色候選基因在mRNA表達(dá)水平上與毛色之間的相關(guān)性，為研究Wnt/β-actenin 信號(hào)通路在毛囊黑色素干細(xì)胞中的分子運(yùn)行機(jī)制提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 試驗(yàn)動(dòng)物

試驗(yàn)于2020年7月在新疆塔城地區(qū)裕民縣開(kāi)展，從新疆謝利蓋畜牧有限公司隨機(jī)挑選被毛為黑色和白色周歲健康的巴什拜羊各8只，每種毛色公和母各4只。在其肩胛部將被毛剃干凈后用取皮器取皮膚組織2塊，裝入事先準(zhǔn)備好的凍存管中，大小為1 cm2。迅速置于液氮罐中帶回實(shí)驗(yàn)室用于總RNA的提取。

1.1.2 試劑和儀器1.1.2.1 試劑

Trizol Reagent、瓊脂糖、無(wú)水乙醇、氯仿、異丙醇、超純水、GoldView、PCR MasterMix(天根生化科技有限公司，北京)RNase-free ddH2O、5×TBE緩沖液(Solarbio，北京)、D2000 DNA Maker(天根生化科技有限公司，北京)反轉(zhuǎn)錄試劑盒(RevertAid First Strand Cdna Synthesis Kit)、普通瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒(TIANgel Midi Purification Kit,天根生化科技有限公司，北京)、熒光定量試劑盒(Ribonuclease Inhibitor、SYBER Premix ExTaqTM天根生化科技有限公司，北京)。

1.1.2.2 儀 器

研缽；移液槍(Thermo)；超低溫電冰箱購(gòu)自海爾家電公司；高速冷凍離心機(jī)購(gòu)自Eppendorf公司；超凈工作臺(tái)購(gòu)自上海博訊實(shí)業(yè)有限公司；LDZX-75KBS型立式壓力蒸汽滅菌器購(gòu)自上海申安醫(yī)療器械廠(chǎng)；DYY-6C型電泳儀及瓊脂糖水平電泳槽均購(gòu)自北京市六一儀器廠(chǎng)；Infinite M200型酶標(biāo)儀購(gòu)自上海研域儀器設(shè)備公司；Gel Doc 2000型凝膠成像儀購(gòu)自Bio-Rad公司；Bio-Rad CFX96熒光定量PCR儀。

1.2 方 法

1.2.1 總RNA提取及cDNA合成

按照Trizol法提取巴什拜羊皮膚組織的總RNA，-80℃保存?zhèn)溆?。? μL總RNA用于RNA品質(zhì)的檢測(cè)，用1.0%瓊脂糖凝膠電泳，220V，15 min。再用分光光度計(jì)測(cè)定總RNA濃度，選出D260nm/D280nm值在1.8～2.0 RNA樣品。最后按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明合成cDNA。

1.2.2 引物設(shè)計(jì)與合成

比較GenBank中其它哺乳動(dòng)物L(fēng)EF1基因cDNA編碼序列的同源性，借助Primer5.0plus軟件，設(shè)計(jì)出1對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物為108 bp引物，由上海生工生物工程股份有限公司合成。同理設(shè)計(jì)出YWHAZ，WNT2基因的引物。

1.2.3 巴什拜羊LEF1、YWHAZ、WNT2基因的特異性

取適量的反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為模板，以特異性的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系25 μL：cDNA模板1 μL，2×TaqPCR Mix11μL，上、下游引物各0.5 μL，RNase-free aaH2O 7 μL。PCR反應(yīng)循環(huán)數(shù)的設(shè)置：95℃預(yù)變性5 min；95℃變性30 s，60℃退火30s，72℃延伸10s，37個(gè)循環(huán)；72℃延伸5 min，4℃保存。PCR產(chǎn)物用1.5%瓊脂糖凝膠檢測(cè)。PCR產(chǎn)物純化后送生工生物工程股份有限公司進(jìn)行測(cè)序。

1.2.4 巴什拜羊LEF1、YWHAZ、WNT2基因定量

qRT-PCR反應(yīng)體系20 μL：cDNA模板2 μL，2×SYBR Premix ExTaq10 μL，上、下游引物各0.5 μL，RNase-free aaH2O 7 μL。PCR反應(yīng)程序：95℃預(yù)變性5 min；95℃變形30s，60℃退火30s，37個(gè)循環(huán)；95℃變性10s，65 ℃退火30s(65～95℃升溫為0.50℃/s)。用Bio-Rad CFX96熒光定量PCR儀完成。

1.3 數(shù)據(jù)處理

PCR和qRT-PCR反應(yīng)結(jié)束后，以溶解曲線(xiàn)來(lái)判定qPR-PCR反應(yīng)的特異性，根據(jù)CT值來(lái)計(jì)算定量結(jié)果。內(nèi)參基因β-actin與目的基因LEF1，YWHAZ，WNT2，在同一條件下不同PCR管中進(jìn)行擴(kuò)增，每個(gè)樣本設(shè)3個(gè)重復(fù)。

qRT-PCR數(shù)據(jù)用Microsoft Excel 統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果均用“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(Mean±SD)”表示。2-△△CT法計(jì)算LEF1，YWHAZ，WNT2在黑色與白色巴什拜羊皮膚中基因的相對(duì)表達(dá)量，△CT目的基因=CT目的基因-CT內(nèi)參基因，△△CT=△CT白色組-△CT黑色組，目的基因在不同毛色綿羊皮膚中mRNA差異表達(dá)倍數(shù)以2-△△CT表示。采用單因素方差分析和顯著性檢驗(yàn)的方法，利用SPSS21.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，運(yùn)用GraphPad Prism 8 軟件繪制柱形圖。P<0.01 表示差異極顯著，P<0.05表示差異顯著，P>0.05表示差異不顯著。利用轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果相互驗(yàn)證qRT-PCR結(jié)果，轉(zhuǎn)錄組織數(shù)據(jù)來(lái)源于對(duì)課題組前期研究，轉(zhuǎn)錄組的部分?jǐn)?shù)據(jù)通過(guò)采用 (Fragments Per Kilobase of transcript per Million fragments mapped，F(xiàn)PKM)片段法來(lái)計(jì)算轉(zhuǎn)錄水平。

2 結(jié)果與分析

2.1 總RNA提取及鑒定

研究表明，部分試驗(yàn)樣品可以明顯看到28S，18S，2條帶亮度好，清晰度高，5S條帶不明顯，說(shuō)明試驗(yàn)提取的總RNA完整性好。用核酸蛋白測(cè)定儀，RNA樣品的OD260nm與OD280nm比較均值為1.8～2.0。RNA符合試驗(yàn)要求。圖1

圖1 總RNA質(zhì)量檢測(cè)

2.2 引物設(shè)計(jì)與合成

引物信息見(jiàn)表1。

2.3 巴什拜羊LEF1、YWHAZ、WNT2基因的特異性

研究表明，三條目的條帶大小分別為108 bp，166 bp，131 bp左右，且條帶清晰，無(wú)二聚體或非特異性條帶,于預(yù)期片段大小一致。LEF1、YWHAZ、WNT2可在綿羊體內(nèi)正常表達(dá)。LEF1通過(guò)測(cè)序獲得的序列信息：CTCTATCCAGGCTGGTCTGCAAGAGACAATTATGGT-AAGAAAAAG AAGAGGAAGAGAGAGAAGCTACAGGAGTCCACA TCAGGTACAGGTCCAAGAATGACAGCTGCC。圖2

實(shí)時(shí)熒光定量目的基因和內(nèi)參基因引物序列：基因LEF1、YWHAZ、WNT2、β-actin，引物序列(5′→3′)分別為5′-CTCTATCCAGGCTGGTCTGC-3′ 5′-GGCAGCTGTCATTCTTGGAC-3′、5′-AACGAGCTGGTACAGAAGGC-3′ 5′-AAGATGACCTACGGGCTCCT-3′、5′-AACGCCTGTCTCGTTGGAAT-3′ 5′-GGCACGTTGTCACACATCAC-3′、5′-CTTCCAGCCTTCCTTCCTGG-3′ 5′-GCCAGGGCAGTGTATCTCTTT-3′，退火溫度分別為55℃、58℃、57℃、57℃，GenBank序列號(hào)分別為NC_040257.1、NC_040260.1、NC_040255.1、NC_040275.1，PCR產(chǎn)物分別為108、166、131、97 bp。

WNT2通過(guò)測(cè)序獲得的序列信息：AACGCCTGTCTCGTTGGAATCTGGCTCTGGCT-CCCTCTAC TTTACCTGG-CTCAGCCCTGAGGTCAGCTCTTCA TGGTGGTACATGAGAGC-TACGAGTGGCTCCTCCAGGGTGATGTGTGACAACGTGCC。

YWHAZ通過(guò)測(cè)序獲得的序列信息：AACGAGCTGGTACAGAAGGCCAAACTGGCCG-AGC AGGCTGAGCGATATGATGACATGGCAGCCTGCAT GAAGTCTGTAACTGAGCAA-GGAGCTGAATTA TCAGGAATCTTCTCTCAGTTGCTTATAAAAATGTT GTAGGAGCCC-GTAGGTCATCTT。圖2

注:M:DL2000 DNA Marker;1～3:β-actin基因；4～8:YWHAZ基因；9～11:WNT2基因；12～14:LEF1基因

2.4 巴什拜羊LEF1、YWHAZ、WNT2基因的mRNA表達(dá)量

研究表明，綿羊皮膚組織中LEF1、YWHAZ、WNT2基因和β-actin基因qRT-PCR擴(kuò)增曲線(xiàn)拐點(diǎn)清楚，平行性良好，符合“S”型標(biāo)準(zhǔn)；溶解曲線(xiàn)有且只有一個(gè)峰，并且Tm值都在80～90 ℃，qRT-PCR反應(yīng)中收集的信號(hào)都來(lái)自引物的特異性擴(kuò)增。圖3

2.5 LEF1基因在黑色和白色巴什拜羊皮膚中的qRT-PCR

研究表明，LEF1基因在黑色和白色巴什拜羊皮膚中均能表達(dá)。并且在皮膚中表達(dá)差異極顯著(P<0.01)，黑色的表達(dá)量明顯高于白色的表達(dá)量。表1

圖3 3個(gè)目的基因與內(nèi)參基因的溶解曲線(xiàn)圖及擴(kuò)增曲線(xiàn)

表1 LEF1基因在黑色和白色巴什拜羊皮膚中的qRT-PCR結(jié)果

WNT2基因在黑色和白色巴什拜羊皮膚中均能表達(dá)。并且在皮膚中表達(dá)差異極顯著(P<0.01)，在黑色被毛的巴什拜羊皮膚中的表達(dá)量明顯高于白色被毛的巴什拜羊的表達(dá)量。表2

YWHAZ基因在黑色和白色巴什拜羊皮膚中均能表達(dá)。并且在皮膚中表達(dá)差異極顯著(P<0.01)。在黑色被毛的巴什拜羊皮膚中的表達(dá)量明顯高于白色被毛的巴什拜羊的表達(dá)量。表3

表2 WNT2基因在黑色和白色巴什拜羊皮膚中的qRT-PCR結(jié)果

表3 YWHAZ基因在黑色和白色巴什拜羊皮膚中的qRT-PCR結(jié)果

2.5 LEF1、WNT2、YWHAZ基因的轉(zhuǎn)錄組信息和熒光定量對(duì)比

研究表明，LEF1基因mRNA在黑色綿羊皮膚中表達(dá)量是白色綿羊皮膚的10倍，WNT2基因mRNA在黑色綿羊皮膚中的表達(dá)量是白色綿羊皮膚的20倍，YWHAZ基因mRNA在黑色綿羊皮膚中表達(dá)量是白色綿羊皮膚的11倍。圖5

LEF1、WNT2、YWHAZ基因在黑色巴什拜羊皮膚中的表達(dá)量均高于白色巴什拜羊皮膚中表達(dá)量。圖6

注：**肩標(biāo)表示差異極顯著(P<0.01)

圖6 轉(zhuǎn)錄組中LEF1、WNT2、YWHAZ基因的FPKM值

3 討 論

哺乳動(dòng)物的毛囊(Hair Follicle，HF)存在幾類(lèi)干細(xì)胞群，作為功能性的器官，HF的再生依賴(lài)于不同干細(xì)胞相互之間及時(shí)且有組織的協(xié)調(diào)作用。HF的突起和次級(jí)毛基質(zhì)細(xì)胞中不僅有上皮干細(xì)胞(epithelial stem cells，EpSCs)，還有與毛發(fā)顏色相關(guān)的黑色素干細(xì)胞(melanocyte stem cells，McSCs)。在HF生長(zhǎng)的早期(agagen，生長(zhǎng)期)，分化的McSCs通過(guò)將自身產(chǎn)生的黑色素轉(zhuǎn)移給鄰近的上皮細(xì)胞，在HF生長(zhǎng)的晚期(telogen，休止期)，分化的色素細(xì)胞會(huì)隨著小部分的HF的退化而凋亡[16]。研究表明，Wnt/β-actenin是調(diào)節(jié)McSCs分化和色素沉著的重要信號(hào)通路。McSCs自身不能產(chǎn)生Wnt的配體，但是研究發(fā)現(xiàn)表達(dá)角蛋白(keratin，Ks)的上皮細(xì)胞可以產(chǎn)生能夠激活Wnt信號(hào)的配體。通過(guò)芯片分析技術(shù)和qRT-PCR找到了Wnt的直接作用位點(diǎn)是內(nèi)皮素1(Endothelin1，EDN1)，在Wnt激活的上皮細(xì)胞中，伴隨著EDN1的表達(dá)量的升高，表現(xiàn)為McSCs的增殖的升高。Wnt信號(hào)是偶聯(lián)McSCs與EpSCs的關(guān)鍵信號(hào)通路，這兩種干細(xì)胞群在毛囊生長(zhǎng)期協(xié)同激活Wnt信號(hào)，黑色素干細(xì)胞中Wnt信號(hào)的激活促使其分化為產(chǎn)生黑色素的細(xì)胞，而上皮干細(xì)胞中Wnt信號(hào)不僅促使毛囊的形成而且在毛發(fā)再生過(guò)程中調(diào)節(jié)黑色素干細(xì)胞的增殖[6]。有研究表明局部應(yīng)用十四烷酰佛波醇-乙酯(TPA)可以激活Wnt/β-actenin信號(hào)，刺激黑色素干細(xì)胞的增殖和分化，促進(jìn)頭發(fā)基質(zhì)色素的沉著[17]。WNT2基因在毛囊的形態(tài)形成方面有重要作用，主要體現(xiàn)在調(diào)節(jié)毛發(fā)長(zhǎng)度[6]。試驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)WNT2基因在黑色和白色被毛的綿羊皮膚中均有表達(dá)，且在黑色被毛皮膚中表達(dá)極顯著高于白色(P<0.01)，WNT2在Wnt/β-actenin信號(hào)通路中作用的分子機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

LEF1和TCF3分別作為T(mén)CF和LEF家族中在毛囊發(fā)育方面發(fā)揮著重要作用的轉(zhuǎn)錄因子，LEF1主要在毛乳頭(dermal papilla，DP)細(xì)胞、內(nèi)根鞘(inner root sheath，IRS)、外根鞘(outer root sheath，ORS)和毛母質(zhì)細(xì)胞(hair follicle matrix cell)中表達(dá)，而這些細(xì)胞可以定向分化成間充質(zhì)細(xì)胞和前皮質(zhì)細(xì)胞形成毛發(fā)[18]。當(dāng)LEF1過(guò)表達(dá)時(shí)，導(dǎo)致β-actenin信號(hào)通路阻斷，導(dǎo)致毛囊形態(tài)異常，促進(jìn)毛囊干細(xì)胞分化成為皮脂腺和上皮細(xì)胞[19]。試驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)LEF1基因在綿羊的黑色和白色被毛皮膚中均有表達(dá)，且在黑色被毛中的表達(dá)極顯著高于白色(P<0.01)。研究結(jié)果與楊磊等[20]在棕色和白色羊駝皮膚中LEF1基因差異表達(dá)趨勢(shì)一致。β-actenin可以作為MITF基因特異性的靶啟動(dòng)子來(lái)激活轉(zhuǎn)錄[21]。MITF與LEF1的功能合作導(dǎo)致DCT基因啟動(dòng)子的協(xié)同轉(zhuǎn)激活，DCT是一種早期黑色素細(xì)胞標(biāo)記物，MITF/TFE3家族是一類(lèi)新的LEF1核調(diào)節(jié)劑，保證Wnt信號(hào)在多種類(lèi)型的細(xì)胞中有效傳播[22]。DCT是酪氨酸酶合成家族的成員之一，作為黑色素合成的關(guān)鍵酶基因，產(chǎn)生的蛋白在黑色素合成過(guò)程中起主要的促進(jìn)作用[23]。韓吉龍等[24]研究表明MITF基因的mRNA表達(dá)量在黑色被毛的藏羊皮膚組織顯著高于棕黑色和白色被毛的藏羊。LEF1的變化趨勢(shì)與MIFT和DCT一致，符合LEF1先前研究的調(diào)控機(jī)制。這一結(jié)果表明，LEF1很有可能參與了綿羊毛色形成的過(guò)程。

皮膚黑色素瘤產(chǎn)生于皮膚黑色素細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)化，因腫瘤基因或者腫瘤抑制基因的突變積累到一定程度迫使黑色素細(xì)胞的異常增殖并擴(kuò)散到身體的其它器官。黑色素瘤中細(xì)胞凋亡的“關(guān)閉”，導(dǎo)致其具有強(qiáng)大的生存能力[25]。代杰等[26]的研究結(jié)果顯示對(duì)YWHAZ基因進(jìn)行敲除后，皮膚中的黑色素細(xì)胞瘤細(xì)胞增殖出現(xiàn)減慢、細(xì)胞凋亡加快、細(xì)胞的遷移及侵襲能力減弱，并且研究顯示黑色素瘤組織中YWHAZ的平均相對(duì)表達(dá)量明顯高于良性痣中YWHAZ的平均相對(duì)表達(dá)量(P<0.01)。Konstantakou等[27]對(duì)WM-266-4轉(zhuǎn)移性黑色素瘤的細(xì)胞株采用納米液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(nLC-MS/MS)蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)分析發(fā)現(xiàn)：YWHAZ對(duì)B型迅速加速性纖維肉瘤(B-type rapidly accelerated fibrosarcoma，BRAF)基因和MITF基因產(chǎn)生特異性相互作用，并且BRAF和MITF共同受YWHAZ的調(diào)控。BRAF作為皮膚黑色素瘤的靶點(diǎn)是最重要的小分子抑制劑。試驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)YWHAZ基因在黑色和白色被毛的綿羊皮膚中均有表達(dá)，且在黑色被毛皮膚中表達(dá)量極顯著高于白色(P<0.01)，表達(dá)量為(4.15±0.230 0)是在正常范圍內(nèi)。YWHAZ通過(guò)調(diào)控MITF影響黑色素細(xì)胞的增殖和分化，以及通過(guò)這種相互作用影響黑色素細(xì)胞瘤的發(fā)生的分子機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

4 結(jié) 論

LEF1、WNT2及YWHAZ基因在不同毛色的巴什拜羊皮膚組織中均有表達(dá)。且LEF1、WNT2及YWHAZ基因在黑色綿羊皮膚中的表達(dá)量極顯著高于白色綿羊皮膚(P<0.01)，LEF1、WNT2及YWHAZ參與毛色的形成過(guò)程，可作為綿羊毛色潛在基因研究與毛色之間的相關(guān)性。黑色被毛的巴什拜羊LEF1、WNT2、YWHAZ基因的表達(dá)量極顯著高于白色被毛色的巴什拜羊(P<0.01)，LEF1、WNT2、YWHAZ基因與綿羊毛色的形成具有一定的相關(guān)性。

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