CCNB2在腎透明細胞癌中的表達意義與功能網(wǎng)絡關(guān)系分析

吳林玲，楊 潮,2

CCNB2在腎透明細胞癌中的表達意義與功能網(wǎng)絡關(guān)系分析

吳林玲1，*楊 潮1,2

（1.江西中醫(yī)藥大學中西醫(yī)結(jié)合癌癥研究中心，江西，南昌 330000；2. 贛南師范大學生命科學學院，江西，贛州 341000）

分析細胞周期蛋白B2（CCNB2）在腎透明細胞癌中的表達及與臨床預后的關(guān)系，建立CCNB2共表達網(wǎng)絡并探討其潛在的作用機制。采用GEPIA和UALCAN數(shù)據(jù)庫分析CCNB2在腎透明細胞癌臨床樣本中的表達情況，獲得CCNB2與腎透明細胞癌的病理分期及預后的關(guān)系，同時檢測腎透明細胞癌及癌旁臨床組織中目的mRNA的表達；通過cBioportal和String數(shù)據(jù)庫分析CCNB2在腎透明細胞癌的功能作用，建立CCNB2共表達網(wǎng)絡；DVIAD和KEGG數(shù)據(jù)庫在線分析共表達網(wǎng)絡功能及富集的信號通路。結(jié)果表明：CCNB2在腎透明細胞癌組織中高表達，并且與腎透明細胞癌的病理分期及預后呈現(xiàn)正相關(guān)性。從cBioportal數(shù)據(jù)庫獲得腎透明細胞癌患者數(shù)據(jù)，挖掘得到CCNB2表達關(guān)系密切的83個基因，建立CCNB2功能網(wǎng)絡。進一步采用DVIAD和KEGG數(shù)據(jù)庫在線分析發(fā)現(xiàn)富集的基因主要參與細胞周期、卵母細胞減數(shù)分裂和卵細胞成熟通路等信號通路，共表達基因功能顯示為微管結(jié)合、微管運動活性和微管蛋白結(jié)合等。因此，CCNB2在腎透明細胞癌組織中顯著高表達，并與患者預后、臨床病理分期呈正相關(guān)，這些預示著CCNB2不僅能夠作為腎透明細胞癌診斷、病理分期和預后的重要分子標志物，還是腎透明細胞癌潛在的治療靶標。

腎透明細胞癌；細胞周期蛋白B2；共表達網(wǎng)絡

腎癌約占全世界所有癌癥診斷和癌癥死亡的2%，在發(fā)達國家發(fā)病率普遍較高。腎癌發(fā)生率≥5%的亞型主要有3種，分別是腎透明細胞癌（Kidney renal clear cell carcinoma，KIRC）、腎乳頭狀細胞癌（Kidney renal papillary cell carcinoma，KIRP）和腎嫌色細胞癌（Kidney Chromophobe，KICH）[1]。腎透明細胞癌是一種異質(zhì)性腫瘤，起源于腎小管上皮細胞，是世界上最常見的10種癌癥之一，也是最常見的腎癌類型[2]。腎透明細胞癌在腎腫瘤亞型中預后最差[3]，約有三分之一被診斷為KIRC患者經(jīng)歷了轉(zhuǎn)移，轉(zhuǎn)移性KIRC五年生存率不超過10%，中位生存期只有13個月[4]。研究發(fā)現(xiàn)導致轉(zhuǎn)移性KIRC患者預后極差的主要原因是缺乏有效地早期診斷技術(shù)和放化療耐藥差[5]。同時，由于KIRC表現(xiàn)出異質(zhì)性，靶向治療的療效在不同患者之間呈現(xiàn)出很大差異，因此，個體化治療藥物的選擇在臨床實踐中是一個巨大的挑戰(zhàn)，為KIRC診斷尋找新的生物標記物和預測模型是當務之急。對KIRC基因特征進行系統(tǒng)分析不僅有利于KIRC的診斷技術(shù)開發(fā)，還為今后治療KIRC提供了新的藥物靶點[6]。

細胞周期是細胞增殖所必須經(jīng)歷的過程，細胞周期蛋白家族蛋白(Cyclins)正是通過對細胞周期的調(diào)節(jié)，參與多種惡性腫瘤的發(fā)生和發(fā)展過程[7]。細胞周期蛋白家族成員可以調(diào)節(jié)細胞周期蛋白依賴性激酶(CDKs)的活性，不同的細胞周期蛋白在細胞周期的特定階段的時間和空間上發(fā)揮作用[8-9]。細胞周期蛋白B2 (CCNB2)隸屬于細胞周期蛋白家族，通過激活CDK1激酶在G2/M期轉(zhuǎn)變的進程中起關(guān)鍵作用[10]。CCNB2在前列腺癌[11]、乳腺癌[12]和胃癌[13]中的表達增加，其高表達導致細胞周期中紡錘體檢查點的缺失，這也是大多數(shù)腫瘤的共同特征：染色體不穩(wěn)定(CIN)[14]。有研究者發(fā)現(xiàn)，CCNB2對橫紋肌肉瘤的大小有一定的影響，但對CCNB2蛋白在腎透明細胞癌中的表達意義和作用機制的研究較少[15]。本研究擬利用生物信息學手段分析和探討CCNB2在腎透明細胞癌中的表達情況及臨床病理分期、預后的相關(guān)性，為臨床診療腎透明細胞癌提供新的研究思路和生物標記，也為腎癌的發(fā)病機制和治療策略提供了新的視角。

1 材料和方法

1.1 GEPIA數(shù)據(jù)庫

GEPIA(http://gepia.cancer-pku.cn/)是由北京大學開發(fā)的在線數(shù)據(jù)庫，擁有大量的臨床腫瘤樣本和正常組織樣本的序列表達數(shù)據(jù)，同時結(jié)合了TCGA和GTEx數(shù)據(jù)庫分析基因在不同腫瘤中的表達情況。本研究使用GEPIA數(shù)據(jù)庫剖析CCNB2 mRNA在腎癌三個亞型中的表達情況，并進一步分析CCNB2 mRNA在腎透明細胞癌組織和正常腎組織中的表達差異、CCNB2基因表達與腎透明細胞癌患者無病生存期和總生存期的關(guān)系。

1.2 UALCAN數(shù)據(jù)庫

UALCAN(http://ualcan.path.uab.edu/index.html)數(shù)據(jù)庫是一個綜合的、用戶友好的、交互式的web資源，用于分析癌癥組學數(shù)據(jù)，它不僅提供了TCGA的基因轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，同時允許用戶識別生物標記物，評估基因在不同分子亞型中的表達，評估啟動子甲基化對基因表達的表觀遺傳調(diào)控等。UALCAN可以幫助我們識別新的診斷和治療靶點，研究任何特定癌癥的基因表達及其疾病相關(guān)性。本研究利用UALCAN數(shù)據(jù)庫對正常腎組織和腎透明細胞癌以及其兩種亞型（ccA、ccB）中CCNB2的表達情況進行分析。

1.3 String數(shù)據(jù)庫

String數(shù)據(jù)庫（https://string-db.org）旨在收集、評分和整合所有公開的蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用(PPI)數(shù)據(jù)來源，并用潛在功能的計算預測補充這些數(shù)據(jù)，與其他分析蛋白相互作用的數(shù)據(jù)庫相比擁有強大的可視化和自定義功能。該數(shù)據(jù)庫在本研究中用于CCNB2的共表達網(wǎng)絡建立和相關(guān)分析。

1.4 cBioPortal數(shù)據(jù)庫

我們使用的cBioPortal（https://www.cbioportal.org）數(shù)據(jù)庫[16-17]是一個全面的網(wǎng)絡資源，可對TCGA、ICGC、GEO等數(shù)據(jù)庫來源的基因組數(shù)據(jù)可視化和多維分析，主要用于解決大型癌癥基因組計劃所帶來的獨特數(shù)據(jù)集成問題，使其原始數(shù)據(jù)更容易、更直接地供整個癌癥研究社區(qū)使用。本研究利用cBioPortal數(shù)據(jù)庫中Kidney Renal Clear Cell Carcinoma (TCGA, Firehose Legacy) 的數(shù)據(jù)集對腎透明細胞癌標本進行分析。

1.5 CancerSEA數(shù)據(jù)庫

CancerSEA(http://biocc.hrbmu.edu.cn/CancerSEA/)是包含了來自25種癌癥的41900個癌細胞的單細胞測序數(shù)據(jù)庫，可以分析腫瘤單細胞的功能狀態(tài)。該數(shù)據(jù)庫將蛋白質(zhì)編碼基因和LncRNAs與這些單細胞水平的功能狀態(tài)相關(guān)聯(lián)，促進對癌細胞功能差異的機理理解。本研究中輸入基因CCNB2，腫瘤類型選擇Renal Cell Cancer進行腎透明細胞癌單細胞功能狀態(tài)分析。

1.6 腎透明細胞癌組織芯片熒光定量PCR實驗

實驗中使用腎透明細胞癌組織cDNA芯片MecDNA-HKidE030CS01購自上海芯超生物科技有限公司。實驗試劑：反轉(zhuǎn)錄OligodT OligodT（15）(CD106)引物購自天根生化科技（北京）有限公司； dNTP mixture (4019)和熒光定量PCR試劑盒SYBR? Premix Ex Taq? II (Tli RNaseH Plus)（RR820Q）購自寶生物工程（大連）有限公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒SuperScript IV Reverse Transcriptase（18090010）購自賽默飛世爾科技（中國）有限公司。熒光定量PCR實驗過程嚴格按照相應試劑盒的說明書進行操作，檢測目的基因CCNB2和內(nèi)參基因β-actin的表達。

熒光定量PCR引物序列為：

HumanCCNB2-F:5'-TTG GCT GGT ACA AGT CCA CTC-3'

Human CCNB2-R: 5'-TGG GAA CTG GTA TAA GCA TTG TC-3'

Human β-actin-F1: 5'-GAA GAG CTA CGA GCT GCC TGA-3'

Human β-actin-R1: 5'- CAG ACA GCA CTG TGT TGG CG-3'

每組樣本設置3個重復，使用SPSS軟件分析以平均值±標準偏差展示實驗結(jié)果，雙尾T檢驗法被用來顯示組間數(shù)據(jù)的差異性。

1.7 統(tǒng)計學分析

采用SPSS軟件對獲得的數(shù)據(jù)進行分析，P值小于0.05具有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 CCNB2 基因在腎癌中的表達

利用GEPIA數(shù)據(jù)庫分析CCNB2基因與三種腎癌亞型的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)與正常組織相比，CCNB2 mRNA在腎嫌色細胞癌（癌組織66例）、腎細胞透明癌（癌組織523例）和乳頭狀腎細胞癌（癌組織286例）中都呈現(xiàn)出一定水平的高表達。但只在腎透明細胞癌組織及其對應的正常腎組織中，CCNB2mRNA的表達水平呈現(xiàn)出了顯著性差異，且具有統(tǒng)計學意義（< 0.05)（如圖1）。

圖1 CCNB2基因在三種不同亞型腎癌中的表達情況

2.2 CCNB2與腎透明細胞癌臨床病理的相關(guān)性

A：CCNB2在腎透明細胞癌A型和B型中的表達水平；B和C：UALCAN和GEPIA數(shù)據(jù)庫分析CCNB2在腎透明細胞癌不同臨床病理分期中的表達情況

為進一步明確CCNB2與腎透明細胞癌的關(guān)系，UALCAN數(shù)據(jù)庫的結(jié)果顯示在腎透明細胞癌兩種亞型透明細胞A型（ccA）和透明細胞B型（ccB）患者組織中，CCNB2基因轉(zhuǎn)錄水平明顯比正常腎組織（72例）高（< 0.05），同時CCNB2在ccB（175例）中的mRNA表達量明顯比ccA（205例）高（P=1.557629E-05）。腎透明細胞癌患者臨床分期與CCNB2基因表達的關(guān)系如圖2 B和C所示，在Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ期腎透明細胞癌患者中，CCNB2的表達水平隨著臨床病理分期緩慢上升，在Ⅳ期表達水平較Ⅲ期升高明顯，這也與GEPIA數(shù)據(jù)庫分析結(jié)果相一致（F value=17.5，Pr(>F)=7.79e?11）。這預示著CCNB2表達水平可作為判斷Ⅳ期腎透明細胞癌患者的生物學標志物。

2.3 CCNB2與腎透明細胞癌患者預后的關(guān)系

采用GEPIA數(shù)據(jù)庫分析CCNB2與腎透明細胞癌患者預后關(guān)系（如圖3），將TCGA數(shù)據(jù)庫來源的腎透明細胞癌患者分為CCNB2高表達組（258例）與低表達組（257例），繪制總體生存期(OS)和無病生存期（DFS）生存曲線。結(jié)果顯示腎透明細胞癌CCNB2低表達組的患者OS明顯高于高表達患者(logrankP = 0.0026)，其中風險比為HR(high)=1.6，P(HR)=0.0028；腎透明細胞癌CCNB低表達組的患者DFS明顯高于高表達患者(logrankP= 0.018)，其中風險比為HR(high)=1.5，P(HR)=0.019。

A:CCNB2高表達（紅線）與低表達患者（藍線）的總生存曲線；B:CCNB2高表達（紅線）與低表達患者（藍線）的無病生存曲線

2.4 腎透明細胞癌中CCNB2與癌細胞功能狀態(tài)的相關(guān)性

為了進一步了解CCNB2基因與腎透明細胞癌細胞功能狀態(tài)的關(guān)系，我們采用CancerSEA在線軟件進行功能相關(guān)分析，發(fā)現(xiàn)在單個腎透明細胞癌細胞中，CCNB2與細胞靜默呈負相關(guān)（如圖4），Kim KT[18]等研究數(shù)據(jù)顯示CCNB2的基因表達與DNA損傷具有正相關(guān)性且< 0.05。

圖4 腎透明細胞癌中CCNB2基因表達與癌細胞功能狀態(tài)的相關(guān)性

2.5 腎透明細胞癌中CCNB2的共表達網(wǎng)絡

圖5 腎透明細胞癌中CCNB2的共表達網(wǎng)絡

利用來源于TCGA數(shù)據(jù)庫的538例腎透明細胞癌數(shù)據(jù)在cBioportal網(wǎng)站在線篩選出與CCNB2共表達的基因，選取Spearman分數(shù)大于0.7的83個基因，在String網(wǎng)站上建立CCNB2共表達網(wǎng)絡（如圖5）。結(jié)果顯示CCNB2（淺藍色標注）處于整個調(diào)控網(wǎng)絡中心較近的位置，與TPX2CCNB1PRC1BUB1B和TOF2A等基因表達聯(lián)系緊密。

2.6 CCNB2共表達網(wǎng)絡基因的GO和KEGG分析

為了進一步探究CCNB2在腎透明細胞癌中共表達基因的功能及其發(fā)揮功能的通路，通過KEGG數(shù)據(jù)庫和DVID數(shù)據(jù)庫進行分析，所得結(jié)果如圖6。我們分析結(jié)果顯示這些基因所涉及的信號通路主要富集在細胞周期、卵母細胞減數(shù)分裂、卵細胞成熟通路、細胞衰老和P53信號通路等信號通路中（FDR < 0.001），結(jié)果見表1。

圖6 CCNB2共表達網(wǎng)絡基因的GO和KEGG分析

表1 CCNB2共表達的信號通路

我們實驗中將CCNB2在腎透明細胞癌中共表達的基因在DVID數(shù)據(jù)庫進行分析，發(fā)現(xiàn)這些基因主要具有以下分子功能：微管結(jié)合、微管運動活性、微管蛋白結(jié)合、運動活性和ATP酶活性等分子功能（FDR < 0.001），結(jié)果見表2。

表2 CCNB2共表達網(wǎng)絡的功能

2.7 CCNB2表達水平與臨床腎透明細胞癌的關(guān)聯(lián)性

為了驗證公共數(shù)據(jù)庫中CCNB2數(shù)據(jù)分析的可靠性，對購買的15例腎透明細胞癌及其對應的癌旁組織cDNA芯片進行熒光定量PCR實驗，檢測內(nèi)參基因β-actin和CCNB2基因的相對表達量，來比較癌和癌旁樣本之間目的基因的差異，進一步研究CCNB2的表達與樣本臨床信息的相關(guān)性。實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)與癌旁組織相比，CCNB2在大多數(shù)腎透明細胞癌組織中顯著高表達（如圖7A），且反映CCNB2基因在癌和癌旁中的表達量的差異倍數(shù)的2^(-ΔΔCt)值大都超過1（D194406-C樣本除外），若2^(-ΔΔCt)<1，表明癌中表達量低，若2^(-ΔΔCt)>1，表明癌中表達量高。這種顯著在癌和對應的癌旁組織中的表達差異具有統(tǒng)計學意義（如圖7B，P= 6.1e?04），這些都預示著CCNB2是腎透明細胞癌潛在的診斷標志物。

A:腎透明細胞癌組織中CCNB2的表達水平；B:在臨床腎透明細胞癌及對應的癌旁組織中CCNB2的表達水平

3 討論

腎癌是泌尿系統(tǒng)常見的一種惡性腫瘤，有較高的發(fā)病率和病死率[19-20]。據(jù)世界衛(wèi)生組織2019年的研究數(shù)據(jù)表明，男性的新發(fā)病例排名第六，女性的新發(fā)病例排名第九[21]。目前，腎癌的診斷主要依靠是影像學和活檢等手段，常見且最有效的治療方法是手術(shù)治療[22]。但患者術(shù)后生存質(zhì)量較差，且有較高的復發(fā)率和轉(zhuǎn)移率，5年生存率低，預后差[23]?；?、射頻消融是轉(zhuǎn)移性腎癌患者的常見治療方法[24,25]，但是治療效果較差。近年來，免疫治療在腎癌的治療中顯示出良好的臨床效果，已成為該領域的研究熱點。然而，由于缺乏敏感和特異的生物標記物，免疫治療的治愈率很低[26]。因此為了提高患者的生存率和生存質(zhì)量，應該著力于探索腎癌早期診斷、預后生物標志物和治療靶點。

細胞周期及其調(diào)控在細胞的生命中起著至關(guān)重要的作用，一直以來都是腫瘤研究的熱點[27]。CCNB2被發(fā)現(xiàn)在多種臨床癌癥組織中過表達，是多種癌癥預后不利的生物標記物[28]。Li R[29]等報道CCNB2可能是一個關(guān)鍵的致癌靶點，參與肝癌、乳腺癌[4,30]等腫瘤的發(fā)生發(fā)展，且和預后有關(guān)。蘭燕等[31]發(fā)現(xiàn)CCNB2過表達與結(jié)直腸癌的浸潤程度和腫瘤大小密切相關(guān)，可能通過加速細胞周期來促進腫瘤細胞的生長。CCNB2可能成為該腫瘤的潛在靶點，其基因高表達可能是腫瘤發(fā)生的關(guān)鍵指標。本研究通過分析來自GEPIA和UALCAN數(shù)據(jù)庫的腎癌患者數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)在腎透明細胞癌組織中，CCNB2呈現(xiàn)顯著的高表達，這一結(jié)果同時也得到了臨床樣本熒光定量PCR的驗證。同時，CCNB2的表達水平隨著腎透明細胞癌臨床病理分期緩慢上升，在Ⅳ期表達水平較Ⅲ期升高明顯，預示著CCNB2可作為腎透明細胞癌臨床診斷和病理分期的重要標志物。在DFS和OS的患者生存曲線中，CCNB2高表達的腎透明細胞癌患者生存期較短，CCNB2低表達的患者生存期較長，表明CCNB2高表達與腎透明細胞癌患者的不良預后顯著相關(guān)，CCNB2的表達是腎透明細胞癌潛在的預后指標。從cBioportal數(shù)據(jù)庫獲得腎透明細胞癌患者數(shù)據(jù)，挖掘得到CCNB2表達關(guān)系密切的83個基因，建立CCNB2功能網(wǎng)絡,發(fā)現(xiàn)與TPX2CCNB1PRC1BUB1B和TOF2A等基因表達聯(lián)系緊密，同時我們通過GEPIA數(shù)據(jù)庫對與CCNB2緊密聯(lián)系的基因進行分析，發(fā)現(xiàn)TPX2CCNB1PRC1和BUB1B在多種腫瘤中包括腎透明細胞癌呈較癌旁組織明顯的高表達，這證實了CCNB2可作為腎透明細胞癌臨床診斷的生物標志物。DVIAD和KEGG數(shù)據(jù)庫在線分析發(fā)現(xiàn)CCNB2共表達基因主要參與了細胞周期、卵母細胞減數(shù)分裂、卵細胞成熟通路、細胞衰老和P53信號通路等信號通路的傳遞，共表達基因主要與微管結(jié)合、微管運動活性、微管蛋白結(jié)合、運動活性和ATP酶活性等功能相關(guān)。

本研究利用生物信息學數(shù)據(jù)庫考察了CCNB2在腎透明細胞癌患者中的表達差異以及與其預后的相關(guān)性，同時為了驗證公共數(shù)據(jù)庫中CCNB2數(shù)據(jù)分析的可靠性，我們利用熒光定量PCR實驗驗證了CCNB2在大多數(shù)腎透明細胞癌組織中較癌旁組織顯著高表達，這進一步肯定了CCNB2可作為腎透明細胞癌的診斷標志物。此外，我們還分析了CCNB2共表達基因網(wǎng)絡的分子功能和細胞通路，明確了CCNB2可作為腎透明細胞癌預后不良潛在的分子標志和治療靶點，但相關(guān)的結(jié)論還需要進一步的實驗數(shù)據(jù)進行驗證和支撐。雖然CCNB2在腎透明細胞癌中的作用機制還未完全明確，但這些發(fā)現(xiàn)將為臨床對腎透明細胞癌的診斷及預后提供新的指標，也為我們接下來探索腎透明細胞癌的發(fā)生機制和治療靶點提供了新的思路。

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ANALYSIS OF THE EXPRESSION SIGNIFICANCE AND FUNCTIONAL NETWORK RELATIONSHIP OF CYCLINB2 IN KIDNEY RENAL CLEAR CELL CARCINOMA

WU Lin-ling1,*YANG Chao1,2

(1Integrated Chinese & Western Medicine Oncology Research Center, Jiangxi University of Traditional Chinese Medicine, Nanchang, Jiangxi 330000, China; 2. College of Life Science, Gannan Normal University, Ganzhou, Jiangxi 341000, China)

The expression of CyclinB2 (CCNB2) in Kidney renal clear cell carcinoma (KIRC) and its relationship with clinical prognosis were analyzed, CCNB2 co-expression network was established and its potential mechanism was explored. GEPIA and UALCAN databases were used to analyze whether CCNB2 was associated with pathological stage and prognosis. The target mRNA expression in clinical KIRC and adjacent tissues were compared by realtime-PCR. In order to establish CCNB2 functional network, cBioportal and string databases were used to analyze the function of CCNB2 in KIRC. The co-expression network and enriched signal pathways were analyzed by On-line analysis of DVIAD and KEGG databases. The results showed that CCNB2 was expressed highly in KIRC, which was positively correlated with the pathological stage and prognosis. cBioportal database was used to collect and analyze the data of KIRC patients. The results showed that 83 genes had osculate relationship with CCNB2. Furthermore, it was found that these enriched genes involved in several signal pathways, mainly including cell cycle, oocyte meiosis, progesterone-mediated oocyte maturation and so on. The function of these co-expressed genes were related to microtubule binding, microtubule motor activity, tubulin binding. Therefore, CCNB2 is highly expressed in KIRC and positively correlated with the prognosis and clinicopathologic stage of the patients. These results indicate that CCNB2 is not only an important molecular marker for the diagnosis, pathologic staging and prognosis of KIRC, but also a potential therapeutic target for KIRC.

kidney renal clear cell carcinoma; CCNB2; co-expression network

Q253

A

10.3969/j.issn.1674-8085.2022.06.009

1674-8085（2022）06-0056-08

2021-12-21；

2022-02-06

國家自然科學基金項目(81860492)；江西中醫(yī)藥大學博士科研啟動基金項目(2020BSZR001)

吳林玲(1992-)，女，重慶涪陵人，碩士生，主要從事癌癥病因?qū)W研究(E-mail:617688778@qq.com)；

*楊 潮(1984-)，男，安徽巢湖人，副教授，博士，碩士生導師，主要從事癌癥病因?qū)W研究(E-mail:20201003@jxutcm.edu.cn).