多重耐藥UPEC細(xì)菌毒力基因分布特征及進(jìn)化分型分析

劉 斌，余子琦，閆 萌，戴彩華，張 瑋，葉紫辰，傅 強(qiáng),2

多重耐藥UPEC細(xì)菌毒力基因分布特征及進(jìn)化分型分析

劉 斌1，余子琦1，閆 萌1，戴彩華1，張 瑋1，葉紫辰1，*傅 強(qiáng)1,2

（1.井岡山大學(xué)醫(yī)學(xué)部，江西，吉安 343009；2.井岡山大學(xué)脊柱疾病研究所，江西，吉安 343009）

本研究對(duì)臨床尿路感染病例病原菌耐藥情況、毒力基因分布及其進(jìn)化分型特征，以期為耐藥性尿路感染病原防控提供參考。通過(guò)對(duì)收集的尿樣進(jìn)行細(xì)菌分離培養(yǎng)，結(jié)合革蘭氏染色鏡檢、16S rDNA對(duì)細(xì)菌進(jìn)行鑒定，利用K-B紙片擴(kuò)散法對(duì)細(xì)菌進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，并通過(guò)PCR擴(kuò)增進(jìn)行毒力基因及系統(tǒng)發(fā)育和進(jìn)化分型分析。本研究成功檢測(cè)出20株尿路致病性大腸桿菌（Uropathogenic, UPEC），藥敏試驗(yàn)顯示多數(shù)菌株具有多重耐藥特征，該批UPEC對(duì)青霉素、紅霉素、萬(wàn)古霉素耐藥率達(dá)100%；對(duì)羧芐西林、氨芐西林、阿奇霉素耐藥率達(dá)90%以上；對(duì)四環(huán)素、諾氟沙星、鏈霉素、耐藥率達(dá)80%以上；對(duì)環(huán)丙沙星、慶大霉素、卡那霉素、氟氧沙星、頭孢曲松耐藥率達(dá)70%以上；對(duì)頭孢噻肟、呋喃妥因、氯霉素耐藥率在35%以上；對(duì)阿莫西林與多粘菌素B耐藥率低，分別僅為10%與5%。六個(gè)毒力基因（）檢出率分別為85%、95%、85%、75%、25%、10%。其系統(tǒng)發(fā)育分型中，歸屬B2群的細(xì)菌最多，占比40%（n=8）；D群次之，占比35%(n=7);其次為A群,占比25%（n=5）；未檢測(cè)到B1群菌株。通過(guò)MLST分型分析，20株大腸桿菌涉及10個(gè)ST型，其中ST131、ST648、ST744、ST1193型別較多。CRISPR序列擴(kuò)增結(jié)果顯示其中6株細(xì)菌含有CRISPR序列，提示不同菌株的進(jìn)化差異。本研究通過(guò)對(duì)臨床多重耐藥UPEC進(jìn)行毒力和分型特征分析，為臨床有效防控耐藥菌導(dǎo)致的尿路感染提供重要依據(jù)。

UPEC；多重耐藥，毒力因子；分布特征；進(jìn)化分型

大腸桿菌（，）屬革蘭氏陰性短桿菌，是構(gòu)成腸道正常菌群的主要細(xì)菌。通常在腸道棲居條件下不致病，但當(dāng)其侵入人體臟器時(shí)則會(huì)引起腸道外感染，其中以尿路感染為主[1-2]。尿路感染（Urinary Tract Infection，UTI）是由于尿路上皮細(xì)胞被大量病原菌入侵、繁殖而引發(fā)的炎癥反應(yīng)，是一種常見(jiàn)的細(xì)菌感染性疾病。95%以上的尿路感染是由單一細(xì)菌引起的，而大腸桿菌是引發(fā)UTI的主要致病菌，其占比超過(guò)80%，稱(chēng)為尿路致病性大腸桿菌（Uropathogenic, UPEC）[3]。根據(jù)UTI發(fā)病部位差異，可導(dǎo)致上尿路及下尿路感染，前者多為膀胱炎，后者則為腎盂腎炎，嚴(yán)重尿路感染患者甚至可能會(huì)因此引發(fā)菌血癥、敗血癥，從而危及患者生命，而慢性腎盂腎炎最終可致發(fā)展為尿毒癥[4-5]。

目前，臨床上普遍采用抗生素療法治療UTI，但由于抗生素的濫用，以及耐藥基因在菌群中的水平轉(zhuǎn)移，導(dǎo)致許多病原菌逐漸出現(xiàn)多重耐藥特征（Multi-drug-resistant, MDR）[6-7]。多重耐藥是指對(duì)細(xì)菌對(duì)3類(lèi)或3類(lèi)以上臨床使用的抗菌藥物同時(shí)耐藥。病原菌株多重耐藥性的逐年增加，不僅導(dǎo)致尿路感染具有易再感染，易復(fù)發(fā)、難治療的特點(diǎn)，給臨床治療帶來(lái)了極大挑戰(zhàn)[8-9]。而且會(huì)迫使抗生素使用量加大，增加藥物不良反應(yīng)，提高二重感染風(fēng)險(xiǎn)，給公共衛(wèi)生安全帶來(lái)巨大隱患。UPEC攜帶有多種毒力基因，如毒素因子、黏附因子和致病島。黏附因子包含P型菌毛、 I型菌毛、FIC菌毛及Dr菌毛。研究表明，這類(lèi)毒力因子與UPEC 的高致病性密切相關(guān)[10]。不同毒力因子彼此間相互作用，借助細(xì)菌突破宿主的防御系統(tǒng)，定植于泌尿道或入侵上皮細(xì)胞，引發(fā)對(duì)宿主有害的炎癥[11]。因此，分析UPEC菌株毒力因子的分布情況，對(duì)研究其多重耐藥性及致病性具有重要意義。

多位點(diǎn)序列分型（Multilocus Sequence Typing，MLST）技術(shù)通過(guò)擴(kuò)增多個(gè)管家基因并進(jìn)行測(cè)序，將每一組的不同等位基因排列組合成為一個(gè)基因型，根據(jù)被發(fā)現(xiàn)的時(shí)間順序給每個(gè)位點(diǎn)的基因序列等位基因編號(hào)，細(xì)菌的等位基因編號(hào)按規(guī)定的順序排列后可以得到等位基因譜，稱(chēng)為該菌的序列型(Sequence Type，ST)，通過(guò)比較菌株的ST可判定不同樣本的相關(guān)性以及多樣性。該方法只需擴(kuò)增細(xì)菌的管家基因后，將數(shù)據(jù)提交至MLST網(wǎng)站，即可比較不同菌株信息，具有較好的重復(fù)性和較高的分辨率，且操作方法簡(jiǎn)單快捷、數(shù)據(jù)準(zhǔn)確。同時(shí)，在古細(xì)菌和細(xì)菌中廣泛存在的CRISPR-Cas適應(yīng)性免疫系統(tǒng)，即成簇的規(guī)律間隔的短回文重復(fù)序列（Clustered regularly interspaced short palindromic repeats, CRISPRs）也被廣泛應(yīng)用于多種致病微生物的進(jìn)化分型研究[12-13]。CRISPR序列包括重復(fù)序列（Direct Repeat，DR）以及插入到重復(fù)序列中的間隔序列（Spacer）。Spacer在親緣關(guān)系很近的細(xì)菌中也可以快速進(jìn)化、高度可變，其在不同種屬細(xì)菌，同一種屬不同菌株間或不同血清型間具有明顯差異。此外，間隔序列的不同間隔序列數(shù)量和排列方式以及多態(tài)性通常與CRISPR位點(diǎn)的活躍水平密切相關(guān)。因此，可以利用多態(tài)性極高的CRISPR位點(diǎn)對(duì)大腸桿菌進(jìn)行分型[14-16]。CRISPR分型方法在分析數(shù)據(jù)方面優(yōu)于其他分型方法，作為細(xì)菌分型方法之一被廣泛應(yīng)用。

UPEC作為尿路感染最常見(jiàn)的病原體，其不斷出現(xiàn)的MDR特征嚴(yán)重危害人類(lèi)健康。由于其自身攜帶的毒力基因及其所屬的系統(tǒng)進(jìn)化群、ST型與菌株的致病性有著密不可分的關(guān)系，本研究擬進(jìn)行UPEC分離株的系統(tǒng)進(jìn)化群、MLST、CRISPR分型和毒力基因的分布，以揭示細(xì)菌毒力與基因型的關(guān)系，為進(jìn)一步研究多重耐藥UPEC的致病機(jī)理和防治提供一定的科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 菌株

本研究中分離的細(xì)菌均來(lái)源于吉安市某醫(yī)院尿路感染病例的尿液標(biāo)本，根據(jù)編號(hào)依次命名為U5002，U4909，U4863，U4789，U4647，U5433， U4528，U4469，U4275，U4228，U4196，U4059，U3945，U3626，U3520，U3519，U129，U612，U616，U4469，經(jīng)LB平板劃線培養(yǎng)分離，由本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2 實(shí)驗(yàn)儀器

恒溫培養(yǎng)振蕩器ZWYR-240購(gòu)置于上海智城分析儀器制造有限公司，實(shí)驗(yàn)室專(zhuān)用超純水機(jī)WP-UP-YJ-20購(gòu)置于四川沃特水處理設(shè)備有限公司，電泳儀EPS300購(gòu)置于上海天能科技有限公司，基因擴(kuò)增儀ETC811-384型購(gòu)置于蘇州東勝興業(yè)科學(xué)儀器有限公司，凝膠成像分析系統(tǒng)ZF-28型購(gòu)置于上海嘉鵬科技有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)試劑

瓊脂粉（Agar）、氯化鈉（NaCl）、酵母提取物（Yeast Extract）、胰蛋白胨（Tryptone）購(gòu)置于生工生物工程（上海）股份有限公司，DM2000 DNA Marker、2*Taq PCR Master Mix（Dye）購(gòu)置于康為世紀(jì)，引物由上海擎科生物科技有限公司合成，藥敏紙片購(gòu)置于北京天壇藥物生物技術(shù)開(kāi)發(fā)公司。液體LB培養(yǎng)基按照配方：NaCl 10.0 g，Yeast Extract 5.0 g，Tryptone 10.0 g，加超純水SW定容至1.0 L，調(diào)節(jié)pH至7.4，121℃，20 min高壓蒸汽法滅菌（配置固體培養(yǎng)基需在調(diào)節(jié)pH后加入15 g瓊脂粉；半固體培養(yǎng)基加入7.5 g瓊脂粉）。

1.4 細(xì)菌鑒定

1.4.1 形態(tài)學(xué)鑒定

用接種環(huán)沾取少量菌液均勻涂布至清潔的玻片中央，固定標(biāo)本后，結(jié)晶紫染色1.0 min，隨后用細(xì)水流緩慢沖洗干凈；盧戈氏碘液媒染1.0 min，沖洗干凈；然后95%酒精脫色30 s，沖洗；番紅溶液復(fù)染30 s，隨后用細(xì)水流緩慢沖洗干凈；最后用吸水紙吸凈玻片上的水分，待標(biāo)本干燥后置于油鏡下觀察。

1.4.2 16S rDNA鑒定

采用煮沸法提取細(xì)菌DNA，吸取1.5 mL的菌液于1.5 mL Eppendorf 離心管中，于7000 rpm 離心10 min，倒掉上清液，瞬時(shí)離心后吸去殘余上清液；用500 μL超純水洗滌一次，于7000 rpm離心10 min，同法去上清液；再加入100 μL超純水，懸浮于水浴鍋中煮沸10 min，后于7000 rpm離心10 min，吸取上清液保存至-20 ℃中。選用16S rDNA通用引物357F和1115R（見(jiàn)表1.A），PCR體系（25 μL）為2*Taq PCR Master Mix，12.5 μL；模板，2.0 μL；357F，1.0 μL；1115R，1.0 μL；超純水，8.5 μL。將該體系置于PCR儀中進(jìn)行基因擴(kuò)增，調(diào)節(jié)PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?4 ℃ 5 min，94 ℃40 s，56 ℃40 s，72 ℃45 s，30個(gè)循環(huán)，72 ℃5 min。配制1%的瓊脂糖凝膠，凝膠放入電泳儀中，將Marker D2000、PCR產(chǎn)物加入1%的瓊脂糖凝膠孔內(nèi)，調(diào)節(jié)電泳儀電壓100 V，電流100 A，電泳40 min后取出凝膠。在紫外光分析儀下可見(jiàn)有800 bp左右位置的亮條帶，將該亮條帶切下，進(jìn)行膠回收。最后將回收產(chǎn)物送于上海擎科生物科技有限公司測(cè)序，并將序列結(jié)果上傳至NCBI BLAST網(wǎng)站（https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）進(jìn)行16S rDNA同源性比對(duì)，并保存比對(duì)結(jié)果。

表1 PCR擴(kuò)增相關(guān)引物

1.5 藥敏試驗(yàn)

對(duì)1.4中鑒定為大腸桿菌的細(xì)菌用Kirby-Bauer（K-B）紙片瓊脂擴(kuò)散法進(jìn)行藥物敏感試驗(yàn)。將19種常用抗生素藥敏紙片貼在已經(jīng)接種好測(cè)試菌的平板上，置于恒溫箱12 h后，測(cè)量其抑菌直徑大小。根據(jù)臨床實(shí)驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)化委員會(huì)（CLSI）2016版文件標(biāo)準(zhǔn)（如表2），判定菌株為耐藥(Resistance，R) 、中介(Intermediary，I) 或敏感(Sensibility，S)。

表2 細(xì)菌藥物敏感性判斷標(biāo)準(zhǔn)

1.6 毒力基因的檢測(cè)

以1.4.2中提取的DNA作為模板，通過(guò)PCR擴(kuò)增對(duì)大腸桿菌毒力因子進(jìn)行檢測(cè)，毒力因子引物見(jiàn)表1B。反應(yīng)體系為20 μL（2*Taq PCR Master Mix液10 μL，上下游引物各1.0 μL，模板1.0 μL，補(bǔ)足SW至20 μL）；反應(yīng)條件與1.4.2中相同。將PCR產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定。

1.7 大腸桿菌系統(tǒng)發(fā)育分型

通過(guò)多重PCR對(duì)分離的細(xì)菌進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分型鑒定，涉及的三對(duì)引物見(jiàn)（表1C）。反應(yīng)體系為25 μL（其中2*Taq PCR Master Mix液12.5 μL，三對(duì)引物上下游各1.0 μL，模板1.0 μL，補(bǔ)足SW至25 μL），將PCR產(chǎn)物進(jìn)行電泳分析，根據(jù)圖1判定分群結(jié)果。

圖1 大腸桿菌系統(tǒng)發(fā)育分型鑒定圖示

1.8 細(xì)菌的MLST分型

MLST分型參照MLST數(shù)據(jù)庫(kù)提供的 7 對(duì)管家基因序列進(jìn)行(https://www.shigatox.net/ecmlst/cgi-bin/scheme)[17]。引物見(jiàn)表1D，擴(kuò)增反應(yīng)體系與反應(yīng)條件與1.4.2中相同。取10 μL 產(chǎn)物進(jìn)行電泳，并將擴(kuò)增條帶大小相符的膠回收產(chǎn)物送測(cè)序。測(cè)序結(jié)果上傳至(https://pubmlst.org/bigsdb?db=pubmlst_escherichia_seqdef)網(wǎng)站中進(jìn)行比對(duì)，獲得各菌株等位基因值，并將7組等位基因值對(duì)比，從而得出該菌株ST型。

1.9 基于CRISPR序列的分型

實(shí)驗(yàn)中使用CRISPR引物（表1E）與1.4.1中模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增反應(yīng)體系以及反應(yīng)條件同上。取10 μL PCR產(chǎn)物進(jìn)行電泳，將擴(kuò)增合格的產(chǎn)物送至上海擎科測(cè)序。測(cè)序結(jié)果上傳(https://crispr:i2bc.paris-saclay.fr/Server/)網(wǎng)站進(jìn)行序列分析。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)菌的形態(tài)學(xué)觀察與16S rDNA鑒定

分離菌株在LB平板上的菌落形態(tài)皆呈現(xiàn)為圓形凸起、半透明、光滑、濕潤(rùn)、灰白色，符合大腸桿菌菌落形態(tài)特征；分離株革蘭氏染色形態(tài)呈紅色，短桿狀，兩端圓形，單個(gè)或多個(gè)排列，提示為革蘭氏陰性菌。選用16S rDNA通用引物57F，1115R 進(jìn)行PCR鑒定，產(chǎn)物測(cè)序結(jié)果與NCBI中已報(bào)道的序列進(jìn)行BLAST比對(duì)，同源性均達(dá)到97%以上，進(jìn)一步證實(shí)為大腸桿菌。

2.2 藥敏實(shí)驗(yàn)結(jié)果

藥敏試驗(yàn)結(jié)果顯示（如表3），20株大腸桿菌對(duì)青霉素、紅霉素、萬(wàn)古霉素耐藥率達(dá)100%；對(duì)羧芐西林、氨芐西林、阿奇霉素耐藥率達(dá)90%以上；對(duì)四環(huán)素、諾氟沙星、 鏈霉素、耐藥率達(dá)80%以上；對(duì)環(huán)丙沙星、 慶大霉素 、卡那霉素、氟氧沙星、頭孢曲松耐藥率達(dá)70%以上；對(duì)頭孢噻肟、呋喃妥因、氯霉素耐藥率在35%以上；對(duì)阿莫西林及多粘菌素B耐藥率低，僅為10%和5%。

表3 尿路感染病例分離株的耐藥性分析

2.3 毒力基因分布情況

毒力因子PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)凝膠電泳鑒定，結(jié)果顯示毒力因子的檢出率均較高，分別為85%、95%、85%、75%；與的檢出率較低，為25%和10%（圖2），各分離株所攜帶毒力因子情況見(jiàn)表4。

圖2 分離株毒力基因檢出率

表4 分離株毒力因子分布情況

2.4 系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化分群

系統(tǒng)發(fā)育分析表明，根據(jù)攜帶標(biāo)記基因不同，大腸桿菌可分為4個(gè)主要的群別（A、B1、B2和D），其中A和B1群常存在于共生群，少見(jiàn)致病性，而B(niǎo)2和D群為攜帶毒力相關(guān)基因的腸外病原菌，屬于高致病群[18]。20株大腸桿菌中，B2群較多，有8株，占比40%； D群次之，有7株，占比35%；其次為A群有5株，占比25%；無(wú)B1群（圖3）；即所分離的20株菌株中有15株屬于高致病群，提示臨床分離株高致病性流行特征。

圖3 部分菌株系統(tǒng)發(fā)育分群基因擴(kuò)增結(jié)果（A）；系統(tǒng)發(fā)育分群比例（B）

2.5 多位點(diǎn)序列分型結(jié)果

PCR擴(kuò)增7對(duì)MLST分型基因（如圖4），電泳鑒定后進(jìn)行膠回收，送測(cè)序。測(cè)序結(jié)果在MLST數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行比對(duì)，得到各菌株的ST型。結(jié)果顯示（如表5），分離株歸屬10種ST型，其中ST131較多，有7株；其次為ST648、ST744、ST1193，分別有3株、2株、2株；ST569、ST450、ST88、ST73、ST44、ST10均有1株。ST744與ST10、ST44與ST10均只有一對(duì)等位基因的差異，分別為和。

1-7泳道依次為adk、fumc、gyrB、icd、mdh、purA、recA基因

表5 UPEC菌株MLST分型特征

2.6 CRISPR分型結(jié)果

CRISPR序列擴(kuò)增結(jié)果顯示，分離株中有6株細(xì)菌含有CRISPR1序列，分別為U3520、U3626、U4275、U4533、U4789和U4863。所獲得的CRISPR序列經(jīng)CRISPRtionary（fr/CRISPRcompar/Dict/Dict.php）比對(duì)分析后發(fā)現(xiàn)，CRISPR重復(fù)序列DR主要為“CGGTTTATCCCCGC TGGCGCGGGGAACAC”和“CGGTTTATCCCCG CTGGCGCGGGGAACTC”兩種，不同菌株攜帶54種不同的間隔序列Spacer（如圖5），提示菌株的進(jìn)化差異。其中U4789和U4863菌株的不同Spacer的順序排列提示兩者進(jìn)化過(guò)程中的相似特征，在細(xì)菌分型上具有參考意義。

圖5 分離株CRISPR序列特征圖譜

3 討論

UPEC廣泛存在于自然界中，是最為常見(jiàn)的革蘭氏陰性致病菌。近年來(lái)，隨著抗生素濫用，耐藥病原菌株不斷產(chǎn)生，給尿路感染治療帶來(lái)了極大挑戰(zhàn)，對(duì)于UPEC的耐藥性分析及其進(jìn)化特征的研究分析將有助于臨床尿路感染的有效防控。藥敏實(shí)驗(yàn)顯示，本研究中所分離的20株臨床UPEC菌株對(duì)青霉素、紅霉素、萬(wàn)古霉素耐藥率達(dá)100%；對(duì)羧芐西林、氨芐西林、阿奇霉素耐藥率達(dá)90%以上；對(duì)四環(huán)素、諾氟沙星、鏈霉素、耐藥率達(dá)80%以上；對(duì)環(huán)丙沙星、慶大霉素、卡那霉素、氟氧沙星、頭孢曲松耐藥率達(dá)70%以上；對(duì)頭孢噻肟、呋喃妥因、氯霉素耐藥率在35%以上；對(duì)阿莫西林和多粘菌素B耐藥率較低，分別僅為10%和5%，提示該類(lèi)抗生素適用于臨床UPEC的感染治療。

相關(guān)研究表明大腸桿菌的致病性主要與其毒力因子相關(guān)，如莢膜、鐵攝取系統(tǒng)、脂多糖、毒素、I型菌毛、P菌毛等[19]。其致病性依賴(lài)于細(xì)菌的局部黏附定植，進(jìn)而侵入機(jī)體產(chǎn)生毒素，毒力的強(qiáng)弱與其攜帶的毒力因子聯(lián)系密切。本研究通過(guò)對(duì)分離菌株進(jìn)行等6種毒力基因檢測(cè)，結(jié)果顯示分離株中均攜帶較多的毒力因子，其中、的檢出率均在70%以上，這可能是造成其臨床感染發(fā)病的主要原因。其中，的基因表達(dá)產(chǎn)物為黏附素的I型菌毛，黏附素具有黏附作用，是使病原菌可以在感染部位黏附而不被清除的重要原因，同時(shí)基因?qū)?xì)菌在感染部位能否產(chǎn)生趨化運(yùn)動(dòng)起關(guān)鍵作用[20-21]?；蚓幋a的產(chǎn)物是溶血素，能夠在紅細(xì)胞膜表面形成穿孔能力，并使得紅細(xì)胞溶解，溶血素對(duì)多種細(xì)胞比如紅細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、粒細(xì)胞、單核細(xì)胞等均有細(xì)胞毒性[22]。與屬于鐵攝取系統(tǒng)毒力因子，可為大腸桿菌在低鐵環(huán)境下攝取游離鐵，為細(xì)菌在缺鐵環(huán)境中增殖提供保障，前者與氣桿菌素有關(guān)，后者則是耶爾森菌強(qiáng)毒力島的標(biāo)志基因之一[23-24]。通過(guò)對(duì)分離菌株的系統(tǒng)發(fā)育分型分析，結(jié)果顯示分離株中歸屬B2群的菌株較多，占比41.18%；其次為D群與A群，占比29.41%。據(jù)報(bào)道，致病性大腸桿菌多為B2 群或D 群，A 和 B1 群致病性較低[25]，本研究中有15株UPEC歸屬于B2或D群，進(jìn)一步證實(shí)了其高致病特征，在免疫力低下的機(jī)體容易引發(fā)腸道外感染。

然而，隨著研究深入，傳統(tǒng)的分型方法已經(jīng)不能滿足研究者對(duì)病原微生物的分型、鑒定，以及菌株的溯源需求，MLST以其較好的重復(fù)性和較高的分辨率，被廣泛應(yīng)用于多種致病微生物的進(jìn)化研究中，且操作方法簡(jiǎn)單快捷、數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)、實(shí)驗(yàn)結(jié)果具有較高可比性。本研究中分離的UPEC菌株共檢測(cè)到10種ST型， ST131有7株，ST648有3株，是主要流行型。同為ST1193和同為ST744的菌株分別具有相同的毒力基因，但同為ST648和ST131的菌株的毒力基因檢測(cè)結(jié)果并不相同，說(shuō)明ST型相同的菌株其毒力仍存在差異，可能與其他因素相關(guān)。

CRISPR系統(tǒng)通過(guò)適應(yīng)性免疫功能從而使細(xì)菌可以逃避外源噬菌體的侵襲，并促進(jìn)噬菌體與細(xì)菌的共進(jìn)化。CRISPR序列中的間隔序列即使在親緣關(guān)系很近的菌株中也可以迅速進(jìn)化，是進(jìn)化最快的基因組元件，其間隔序列的多樣性為細(xì)菌的分型提供了具有高靈敏度和強(qiáng)分辨率的可靠方法。本實(shí)驗(yàn)檢測(cè)到6株細(xì)菌含有CRISPR1序列，其重復(fù)序列包括兩種，兩種堿基序列僅有一個(gè)堿基差異。間隔序列差異性較大，數(shù)量與堿基序列均不相同。CRISPR 系統(tǒng)會(huì)因?yàn)橥庠词删w以及質(zhì)粒的侵襲而改變，不同的菌株間的親緣關(guān)系可以從其CRISPR間隔序列反映出來(lái)，親緣關(guān)系越近的菌株，其間隔序列越相似，反之，親緣關(guān)系較遠(yuǎn)的菌株之間間隔序列的差異性較大[14,26]。有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)，除間隔序列外，CRISPR的重復(fù)序列也參與細(xì)菌的進(jìn)化過(guò)程，在大腸桿菌中CRISPR的重復(fù)序列會(huì)引起與細(xì)菌耐熱性相關(guān)的基因的染色體變化，其染色體區(qū)域的復(fù)制，會(huì)使大腸桿菌的耐熱性有所升高[27]。而本研究中分離株CRISPR序列檢出率較其他類(lèi)型大腸桿菌低[14]，且僅具有單一的CRISPR位點(diǎn)，這可能與該類(lèi)細(xì)菌經(jīng)歷的水平基因轉(zhuǎn)移或可移動(dòng)遺傳元件的侵襲程度不同有關(guān)。

總之，本研究發(fā)現(xiàn)臨床分離的UPEC菌株具有多重耐藥特征，建議臨床治療使用多粘菌素B或阿莫西林等敏感抗菌藥物。UPEC菌株毒力基因的檢出率較高，與其高致病性存在密切聯(lián)系。MLST分型發(fā)現(xiàn)分離株具有10種ST型，其中ST131、ST648、ST744、ST1193型菌株較為流行。本研究針對(duì)臨床多重耐藥UPEC進(jìn)行了毒力和分型特征分析，為臨床有效防控耐藥菌導(dǎo)致的尿路感染提供重要依據(jù)。

[1] 戴彩華,張瑋,劉斌,等.一株尿路致病性大腸桿菌噬菌體的分離鑒定及生物學(xué)特性分析[J].井岡山大學(xué)學(xué)報(bào):自然科學(xué)版,2021,42(3):52-58.

[2] Lagha R, Ben Abdallah F, Al-Sarhan B O, et al. Antibacterial and biofilm inhibitory activity of medicinal plant Essential oils against escherichia coli isolated from UTI patients [J]. Molecules, 2019, 24(6):1161.

[3] Flores-Mireles A L, Walker J N, Caparon M, et al. Urinary tract infections: epidemiology, mechanisms of infection and treatment options [J]. Nat Rev Microbiol, 2015, 13: 269-284.

[4] Czajkowski K, Bros-Konopielko M, Teliga-Czajkowska J. Urinary tract infection in women [J]. Prz Menopauzalny, 2021, 20: 40-47.

[5] 周宏偉.腸桿菌科細(xì)菌耐藥機(jī)制以及UPEC對(duì)HeLa細(xì)胞的致病性研究[D].杭州:浙江大學(xué),2009.

[6] Ballesteros-Monrreal M G, Arenas-Hernandez M M, Enciso-Martinez Y, et al. Virulence and resistance determinants of uropathogenic escherichia coli strains isolated from pregnant and non-pregnant women from two states in mexico [J]. Infect Drug Resist, 2020, 13: 295-310.

[7] Madrazo M, Esparcia A, Lopez-Cruz I, et al. Clinical impact of multidrug-resistant bacteria in older hospitalized patients with community-acquired urinary tract infection [J]. BMC Infect Dis, 2021, 21: 1232.

[8] Mazzariol A, Bazaj A, Cornaglia G. Multi-drug-resistant Gram-negative bacteria causing urinary tract infections: a review [J]. J Chemother, 2017, 29: 2-9.

[9] 常國(guó)偉,周航,胡文,等. 2013 ～ 2017年醫(yī)院尿路感染住院患者抗菌藥物應(yīng)用分析[J]. 井岡山大學(xué)學(xué)報(bào):自然科學(xué)版,2019,40(4):103-106.

[10] Ribic R, Mestrovic T, Neuberg M, et al. Effective anti-adhesives of uropathogenic Escherichia coli [J]. Acta Pharm,2018, 68: 1-18.

[11] Pakbin B, Bruck W M, Rossen J W A. Virulence factors of enteric pathogenic escherichia coli: A review [J]. Int J Mol Sci, 2021, 22.

[12] 黃濤,山珊,黃艷梅,等.大腸埃希氏菌的分型方法及其研究進(jìn)展[J]. 微生物學(xué)通報(bào),2020,47(3):892-902.

[13] Kubelova M, Kolackova I, Gelbicova T, et al. Virulence properties of mcr-1-positive escherichia coli isolated from retail poultry meat [J]. Microorganisms, 2021, 9(2):308.

[14] Fu Q, Su Z, Cheng Y, et al. Clustered, regularly interspaced short palindromic repeat (CRISPR) diversity and virulence factor distribution in avian escherichia coli [J]. Res Microbiol, 2017, 168: 147-156.

[15] Dong H, Cui Y, Zhang D. CRISPR/Cas technologies and their applications in escherichia coli [J]. Front Bioeng Biotechnol, 2021, 9: 762676.

[16] 王建,邱少富,宋宏彬,等. CRISPR在細(xì)菌分型和進(jìn)化中的研究進(jìn)展[J]. 生物技術(shù)通訊,2013,24(3):414-417.

[17] 張立偉,石玉祥,張永英,等. 雞源大腸桿菌毒力基因檢測(cè)及分子流行特征[J].微生物學(xué)報(bào),2020,60(11):2498- 2510

[18] Clermont O, Bonacorsi S, Bingen E. Rapid and simple determination of the escherichia coli phylogenetic group [J]. Appl Environ Microbiol, 2000, 66: 4555-4558.

[19] Johnson J R, Van Der Schee C, Kuskowski M A, et al. Phylogenetic background and virulence profiles of fluoroquinolone-resistant clinical escherichia coli isolates from the netherlands [J]. J Infect Dis, 2002, 186: 1852-1856.

[20] Hung C S, Bouckaert J, Hung D, et al. Structural basis of tropism of Escherichia coli to the bladder during urinary tract infection [J]. Mol Microbiol, 2002, 44: 903-915.

[21] Sokurenko E V, Feldgarden M, Trintchina E, et al. Selection footprint in the FimH adhesin shows pathoadaptive niche differentiation in Escherichia coli [J]. Mol Biol Evol,2004,21:1373-1383.

[22] 李丹.遼寧部分地區(qū)雞源大腸埃希氏菌分離株毒力基因檢測(cè)與耐藥性分析[D].沈陽(yáng):沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué),2020.

[23] 劉紅玉,王君瑋,王娟,等. 禽大腸桿菌毒力因子的研究進(jìn)展[J]. 中國(guó)動(dòng)物檢疫, 2013,30(10):25-29.

[24] Forsyth V S, Himpsl S D, Smith S N, et al. Optimization of an experimental vaccine to prevent escherichia coli urinary tract infection [J]. mBio, 2020, 11(2):e00555-20.

[25] Tan C, Tang X, Zhang X, et al. Serotypes and virulence genes of extraintestinal pathogenic Escherichia coli isolates from diseased pigs in China [J]. Vet J, 2012, 192: 483-488.

[26] 白芷燁,汪雯,吉小風(fēng),等. CRISPR在食源性致病菌進(jìn)化分析、檢測(cè)分型及毒力耐藥調(diào)控中的應(yīng)用進(jìn)展[J]. 生物工程學(xué)報(bào),2021,37(7):2414-2424.

[27] Touchon M, Charpentier S, Clermont O, et al. CRISPR distribution within the escherichia coli species is not suggestive of immunity-associated diversifying selection [J]. J Bacteriol, 2011, 193: 2460-2467.

DISTRIBUTION CHARACTERISTICS OF VIRULENCE GENES AND EVOLUTIONARY TYPING OF MULTIDRUG-RESISTANT UPEC ISOLATES

LIU Bin1, YU Zi-qi1, YAN Meng1, DAI Cai-hua1, ZHANG Wei1, YE Zi-chen1,*FU Qiang1,2

（1. Health Science Center, Jinggangshan University, Ji’an, Jiangxi 343009, China; 2. Institute of Spinal Diseases, Jinggangshan University, Ji’an, Jiangxi 343009, China）

This studyinvestigated the drug resistance, virulence gene distribution and evolutionary typing characteristics of pathogens in clinical cases of urinary tract infection, so as to provide reference for the prevention and control of drug-resistant urinary tract infection pathogens. The collected urine samples were isolated and cultured, and the bacteria were identified by Gram staining and 16S rDNA. The bacteria were tested for drug sensitivity by K-B disk diffusion method, and the virulence genes and phylogenetic and evolutionary typing were analyzed by PCR amplification. In the study, 20 strains of uropathogenic(UPEC) were successfully isolated. The drug sensitivity test showed that most strains had the characteristics of multiple drug resistance. The drug resistance rates of this batch of UPEC to penicillin, erythromycin and vancomycin reached 100%, more than 90% to carbenicillin, ampicillin and azithromycin, more than 80% to tetracycline, norfloxacin, streptomycin and streptomycin, more than 70% to ciprofloxacin, gentamicin, kanamycin, floxacin and ceftriaxone, more than 35% to cefotaxime, nitrofurantoin and chloramphenicol; The resistance rates to amoxicillin and polymyxin B were low, only 10% and 5% respectively. The detection rates of six virulence genes (,,,,,) were 85%, 95%, 85%, 75%, 25% and 10% respectively. In its phylogenetic typing, the bacteria belonging to group B2 are the most, accounting for 40% (n=8), group D takes the second place, accounting for 35% (n=7), the third is group A, accounting for 25% (n=5); Group B1 strains weren’t detected. Through MLST typing analysis, 20 strains ofinvolved 10 ST types, including ST131, ST648, ST744, ST1193. CRISPR sequence amplification results showed that 6 strains of bacteria contained CRISPR sequence, suggesting the evolutionary differences of different strains. This study analyzed the virulence and typing characteristics of clinical multidrug-resistant UPEC, which provided a significant basis for clinical effective prevention and control of urinary tract infection caused by drug-resistant bacteria.

UPEC; multi-drug resistance; virulence factor; distribution characteristics; evolutionary typing

Q936

A

10.3969/j.issn.1674-8085.2022.06.007

1674-8085（2022）06-0040-10

2022-07-06；

2022-10-15

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31860711, 52163015)；國(guó)家級(jí)大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計(jì)劃項(xiàng)目(202210419006)；吉安市指導(dǎo)性科技計(jì)劃項(xiàng)目[吉市科計(jì)字(2022)6號(hào)6]

劉 斌(1979-），男，江西吉安人，副教授，博士，主要從事病原微生物與免疫方面的研究(E-mail: 1902282875@qq.com)；

*傅 強(qiáng)(1988-），男，江西吉安人，講師，博士，主要從事原微生物與免疫方面的研究(E-mail: fqiang9@126.com).