高效液相色譜技術(shù)在藥品檢驗(yàn)中的應(yīng)用研究

駱海春 陳高健 朱飛如 張雪梅

通常，為了解化學(xué)藥物成分、評(píng)估其治療價(jià)值，需要對(duì)藥物進(jìn)行檢測(cè)，以保障臨床用藥合理性。傳統(tǒng)化學(xué)藥物檢測(cè)多采用薄層色譜法，其盡管能夠?qū)瘜W(xué)藥物成分分析起到一定的作用，但也存在分離困難的問(wèn)題，未能在臨床推廣。近年來(lái)，高效液相色譜法（HPLC）以其測(cè)量速度快、靈敏度高等優(yōu)越性在藥品檢驗(yàn)中得以應(yīng)用，且隨著該技術(shù)在實(shí)踐中的不斷改進(jìn)，其分離分析操作逐漸完善，成為藥品檢驗(yàn)的關(guān)鍵技術(shù)[1]。現(xiàn)介紹HPLC技術(shù)的發(fā)展及特點(diǎn)，分析HPLC技術(shù)在藥品檢驗(yàn)中的應(yīng)用現(xiàn)狀以及HPLC技術(shù)在藥品檢驗(yàn)中的發(fā)展趨勢(shì)。

1 HPLC技術(shù)發(fā)展及特點(diǎn)

HPLC技術(shù)最早誕生于20世紀(jì)60～70年代，其作為一種新型分離分析技術(shù)，經(jīng)過(guò)不斷改進(jìn)與優(yōu)化，成為分析化學(xué)分離方法中極為重要的手段。該技術(shù)基礎(chǔ)為經(jīng)典液相色譜，并融入氣相色譜理論，利用高壓液泵、高效固定相及高靈敏度檢測(cè)器等所具有的較高選擇性、分離效能以及靈敏度，實(shí)現(xiàn)了自動(dòng)化操作[2]。HPLC技術(shù)流動(dòng)相為液體，利用各輸液系統(tǒng)傳輸需要檢驗(yàn)液體物質(zhì)到相應(yīng)區(qū)域反應(yīng)，能夠產(chǎn)生固定顏色物質(zhì)，其原理與傳統(tǒng)液相色譜基本相同，但引入了更為先進(jìn)的設(shè)備，優(yōu)化了操作過(guò)程，進(jìn)而提升了物質(zhì)管理效率及反應(yīng)速率。HPLC技術(shù)在具體應(yīng)用過(guò)程中加入液體藥物后，各類(lèi)物質(zhì)會(huì)被儀器有效分離，物質(zhì)特性不同其在色譜中分離位置也呈現(xiàn)出明顯的差異性，然后將其輸送到相應(yīng)位置處理機(jī)器，對(duì)物質(zhì)檢驗(yàn)有著較高的精確度。不僅如此，其還能夠?qū)⑽镔|(zhì)中的雜質(zhì)進(jìn)行分離，篩選出無(wú)用物質(zhì)，在藥物質(zhì)量改進(jìn)中有著較高的應(yīng)用價(jià)值[3]。

以往有學(xué)者提出HPLC技術(shù)較傳統(tǒng)液相色譜法有著更高的速率、靈敏度與自動(dòng)化[4]。1）從分析速度上看，經(jīng)典液相色譜法采用重力加料的方式，減慢了流出速度，HPLC則采用的是高壓輸液設(shè)備，流速能夠達(dá)到10 ml/min，是經(jīng)典液相色譜法的數(shù)百倍。以苯的羥基化合物分離為例，分離7個(gè)組分1 min內(nèi)便能夠完成。2）經(jīng)典液相色譜法僅能夠?qū)怏w或沸點(diǎn)較低化合物進(jìn)行分析，HPLC技術(shù)則能夠?qū)崿F(xiàn)對(duì)80%以上有機(jī)物的分離與分析。3）氣相色譜以惰性氣體為流動(dòng)相，與組分僅具有運(yùn)載作用，無(wú)親和力與作用力。而HPLC技術(shù)將不同極性液體作為流動(dòng)相，擁有較大的選擇余地，與組分會(huì)產(chǎn)生相互作用，可見(jiàn)流動(dòng)相在分離中能發(fā)揮重要作用[5]。

2 HPLC技術(shù)在藥品檢驗(yàn)中的應(yīng)用

HPLC技術(shù)最初在化學(xué)藥物成分分析中的應(yīng)用僅作為分離手段，其通過(guò)對(duì)混合物各類(lèi)成分流動(dòng)相以及固定相分配系數(shù)的分析，以色譜圖的形式將化學(xué)藥物成分呈現(xiàn)出來(lái)，在化學(xué)藥物分離及藥物成分分析中有著較高的應(yīng)用價(jià)值。

2.1 藥品含量檢驗(yàn)

HPLC技術(shù)分辨率高、分析速度快且能夠?qū)崿F(xiàn)重復(fù)分析，在進(jìn)行藥品檢驗(yàn)時(shí)所需樣品少，在藥品含量測(cè)定中有著較高的適用性。學(xué)者陳立柱等[6]認(rèn)為藥品質(zhì)量合理性不僅與藥品中各類(lèi)物質(zhì)治療效用有關(guān)，而且與藥物成分含量有關(guān)，因此需要明確藥品是否具有足夠的效果或是否由于藥品含量不當(dāng)對(duì)人體造成損害。利用HPLC技術(shù)能夠?qū)λ幤分兴幬锍煞钟枰苑蛛x，獲得相應(yīng)成分傳輸?shù)綑z驗(yàn)機(jī)，實(shí)現(xiàn)對(duì)樣本成分的精準(zhǔn)測(cè)量，確保藥品中有關(guān)成分能夠滿(mǎn)足臨床治療需求。目前，藥品含量測(cè)定方法主要包括吸附色譜法、離子交換色譜法，其中反相色譜應(yīng)用最為普遍。如在檢測(cè)馬來(lái)酸曲美布丁原料雜質(zhì)及制劑含量時(shí)，其中含有ATMB、TMBM及A800，采用HPLC技術(shù)進(jìn)行檢驗(yàn)不僅操作簡(jiǎn)單、準(zhǔn)確率高，而且能夠?qū)崿F(xiàn)對(duì)各制劑中組分含量的檢驗(yàn)。學(xué)者呂瓊芳等[7]在研究中檢驗(yàn)吡羅昔康藥品含量，該藥物屬于非甾體抗炎藥物，主要功效為解熱、鎮(zhèn)痛、抗炎，通常按照《中華人民共和國(guó)藥典》標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行含量檢測(cè)。但該藥物在水溶液中化學(xué)性質(zhì)極不穩(wěn)定，氧化水解會(huì)生成2-氨基吡啶，吡羅昔康無(wú)法生成溶液，而采用HPLC檢驗(yàn)，容積選擇鹽酸甲醇溶液，劑量為0.01 mol/L，不僅能夠促進(jìn)藥物溶解性增加，而且能夠提高吡羅昔康溶液穩(wěn)定性，有利于實(shí)現(xiàn)對(duì)吡羅昔康藥品含量的準(zhǔn)確檢測(cè)。學(xué)者余曉霞等[8]在研究中采用HPLC對(duì)復(fù)方萘甲唑林滴眼液中鹽酸萘甲唑林和馬來(lái)酸氯苯那敏含量予以檢測(cè)，將0.05 mol/L磷酸二氫鉀作為流動(dòng)相，設(shè)置流速及進(jìn)樣量分別為0.8 ml/min、5 μl，柱溫以40 ℃為宜，結(jié)果顯示，鹽酸萘甲唑啉流出時(shí)間為4.758 min，馬來(lái)酸氯苯那敏為7.364 min，且回收率均在97%以上，最終得出結(jié)論：HPLC操作簡(jiǎn)單、準(zhǔn)確率高，能夠?qū)崿F(xiàn)對(duì)藥品含量的準(zhǔn)確檢測(cè)。美國(guó)藥典首次將HPLC作為法定分析方法僅有6個(gè)項(xiàng)目，隨著不斷改進(jìn)及升級(jí)，逐漸增加至418項(xiàng)，截至23版美國(guó)藥典已經(jīng)收載項(xiàng)目達(dá)到2 000項(xiàng)以上[9]。我國(guó)藥典中關(guān)于HPLC的收集品種也在不斷增加，HPLC在檢驗(yàn)抗生素及激素類(lèi)化學(xué)藥品中的應(yīng)用范圍不斷擴(kuò)大。HPLC指標(biāo)已經(jīng)成為反映世界藥典水平的先進(jìn)指標(biāo)。

2.2 有關(guān)物質(zhì)檢驗(yàn)

近年來(lái)，臨床對(duì)藥品質(zhì)量以及相關(guān)物質(zhì)檢驗(yàn)有著越來(lái)越高的要求。通常，藥物應(yīng)用經(jīng)過(guò)了原料合成、制劑制備、貯備、運(yùn)輸以及臨床應(yīng)用等多個(gè)環(huán)節(jié)，是一個(gè)漫長(zhǎng)的、復(fù)雜的過(guò)程，任何一個(gè)環(huán)節(jié)都可能產(chǎn)生相關(guān)的物質(zhì)。藥品生產(chǎn)過(guò)程中會(huì)導(dǎo)致原料、試劑以及副產(chǎn)物等的帶入。藥品貯備及運(yùn)輸期間會(huì)產(chǎn)生聚合物、降解產(chǎn)物，因此，藥品的生產(chǎn)及應(yīng)用不僅要考慮其安全性，而且要結(jié)合生產(chǎn)實(shí)際。臨床在藥物安全方面有一定的要求，允許有一定的無(wú)害有關(guān)物質(zhì)或低毒性物質(zhì)。但藥品毒性必須控制在一定的范圍內(nèi)，對(duì)于危害人體健康或影響藥物穩(wěn)定性的物質(zhì)要加以嚴(yán)格控制。由于藥品相關(guān)物質(zhì)含量微小，因此選擇一種科學(xué)、精準(zhǔn)、敏感性高的檢驗(yàn)方法尤為重要。

國(guó)外學(xué)者根據(jù)性質(zhì)及來(lái)源的不同，將藥品中化學(xué)雜質(zhì)分為有機(jī)雜質(zhì)、無(wú)機(jī)雜質(zhì)以及殘留溶液，檢查項(xiàng)目多包括原料、副產(chǎn)物、異構(gòu)體以及降解產(chǎn)物等[10]。以卡托普利片及甲硝唑片藥品檢驗(yàn)為例，除對(duì)相關(guān)物質(zhì)進(jìn)行檢驗(yàn)外，還存在部分未知雜質(zhì)，難以確定其性質(zhì)，可采用HPLC檢驗(yàn)，其不僅能夠避免高含量雜質(zhì)的影響，而且能夠避免紫外線吸收問(wèn)題，檢測(cè)準(zhǔn)確性高。何天碧[11]在研究中采用反相HPLC測(cè)定甲硝唑口腔粘貼片的有關(guān)物質(zhì)，選擇流動(dòng)相為甲醇-水（20∶80），流速設(shè)置為1.0 ml/min，檢測(cè)波長(zhǎng)為325 nm，結(jié)果顯示甲硝唑原料及甲硝唑口腔粘貼片雜質(zhì)含量均為0.018%，提示制劑過(guò)程中未發(fā)生明顯的變化，符合藥品質(zhì)量要求。在2002年《中華人民共和國(guó)藥典》中，采用薄層色譜法（TLC）檢測(cè)鹽酸雷尼丁不僅操作復(fù)雜，而且重復(fù)性差。國(guó)外學(xué)者在研究中采用HPLC檢測(cè)鹽酸雷尼丁，選擇C18柱作為色譜柱，將0.05 mol/L乙腈以及檸檬酸溶液作為流動(dòng)相，設(shè)置檢測(cè)波長(zhǎng)為315 nm，結(jié)果顯示該藥物在82～320 mg/L范圍內(nèi)線性關(guān)系較好，該檢測(cè)方法避免了傳統(tǒng)薄層色譜檢驗(yàn)的不足[12]。

2.3 中藥成分檢驗(yàn)

HPLC應(yīng)用于中藥成分檢驗(yàn)主要是通過(guò)化學(xué)手段對(duì)復(fù)雜成方制劑化學(xué)結(jié)構(gòu)及化學(xué)成分進(jìn)行分析的過(guò)程。作為一個(gè)多成分復(fù)雜體系，中藥呈現(xiàn)出多效性與平衡調(diào)節(jié)性。有學(xué)者認(rèn)為中藥采用多種化學(xué)成分進(jìn)行配伍，能夠?qū)崿F(xiàn)藥物療效的最大化，可用于對(duì)疑難雜癥的治療[13]。但中藥成分的復(fù)雜性與多樣性也增加了其檢驗(yàn)及成分分析的復(fù)雜性與難度。隨著中醫(yī)藥的發(fā)展，HPLC在中藥成分檢驗(yàn)中得以應(yīng)用，其不僅能夠有效測(cè)定出中藥材及中成藥中的有效成分，而且推動(dòng)了中藥的發(fā)展，提升了中藥質(zhì)量規(guī)范化。目前，HPLC已經(jīng)逐漸取代了傳統(tǒng)薄層色譜法，在中藥成分檢驗(yàn)中應(yīng)用廣泛。許曉嘉等[14]在研究中采用HPLC對(duì)中藥菟絲子中黃酮類(lèi)成分含量進(jìn)行檢驗(yàn)，選擇C18色譜柱，將甲醇-0.4%磷酸作為流動(dòng)相，設(shè)置檢測(cè)波長(zhǎng)為360 nm，結(jié)果顯示菟絲子中藥中5種化學(xué)成分在對(duì)應(yīng)濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，加樣回收率達(dá)到98%以上，體現(xiàn)了HPLC檢驗(yàn)方法較好的重現(xiàn)性、準(zhǔn)確性，該方法能夠廣泛應(yīng)用于中藥質(zhì)量評(píng)價(jià)中。

2.4 抗生素類(lèi)藥品檢驗(yàn)

隨著抗生素在臨床上應(yīng)用的增多，抗生素藥品的安全檢驗(yàn)工作也受到了醫(yī)學(xué)界的高度重視?？股仡?lèi)藥物所引起的不良反應(yīng)很大程度上是由于原料中間體、聚合產(chǎn)物、降解產(chǎn)物引起的，因此必須加強(qiáng)對(duì)抗生素類(lèi)藥品的雜質(zhì)檢測(cè)與控制。學(xué)者王啟光[15]在研究中采用HPLC對(duì)注射用鹽酸頭孢吡肟中精氨酸含量予以檢測(cè)，設(shè)置磷酸二氫鈉-甲醇（96∶4）作為流動(dòng)相，流速設(shè)置為1.0 ml，波長(zhǎng)為206 nm，結(jié)果顯示精氨酸在0.3～1.4 μg范圍內(nèi)呈現(xiàn)出良好的線性關(guān)系，回收率達(dá)99.17%，體現(xiàn)了該檢驗(yàn)方法的準(zhǔn)確性與良好的可重復(fù)性。

3 HPLC技術(shù)在藥品檢驗(yàn)中的應(yīng)用進(jìn)展

隨著現(xiàn)代醫(yī)療衛(wèi)生技術(shù)的進(jìn)步，HPLC技術(shù)不斷優(yōu)化、提升，尤其是有關(guān)先進(jìn)檢測(cè)儀器的應(yīng)用，更是擴(kuò)大了HPLC的適用范圍，其與質(zhì)譜技術(shù)、柱切換技術(shù)等聯(lián)合應(yīng)用；在現(xiàn)代分子藥理學(xué)、生物學(xué)的支持下，應(yīng)用范圍越來(lái)越廣，未來(lái)HPLC技術(shù)將會(huì)在藥品質(zhì)量管理中發(fā)揮巨大的作用。不僅如此，超高效液相色譜將會(huì)成為HPLC的重要發(fā)展方向，融入快速檢測(cè)技術(shù)及其他先進(jìn)技術(shù)，HPLC靈敏度以及分析通量會(huì)得到顯著提升。

綜上所述，HPLC技術(shù)在藥品檢驗(yàn)領(lǐng)域中的應(yīng)用已經(jīng)成為不可阻擋的趨勢(shì)，在藥品含量檢測(cè)、有關(guān)物質(zhì)檢驗(yàn)中將發(fā)揮極為重要的作用，并促進(jìn)藥品質(zhì)量的提升。隨著現(xiàn)代醫(yī)療技術(shù)的發(fā)展，HPLC在藥品檢驗(yàn)中應(yīng)用前景廣闊，應(yīng)加強(qiáng)有關(guān)新技術(shù)開(kāi)發(fā)與探索，充分利用HPLC技術(shù)發(fā)揮其作用，提高藥品檢驗(yàn)規(guī)范化，為醫(yī)學(xué)界做出貢獻(xiàn)。