大視場(chǎng)高分辨HiLo光切片顯微成像系統(tǒng)

郎 松，張艷微，鄭漢青，徐林鈺，汪路涵，鞏 巖

（1. 中國(guó)科學(xué)技術(shù)大學(xué) 生物醫(yī)學(xué)工程學(xué)院(蘇州) 生命科學(xué)與醫(yī)學(xué)部, 江蘇 蘇州 215163；2. 中國(guó)科學(xué)院 蘇州生物醫(yī)學(xué)工程技術(shù)研究所, 江蘇 蘇州 215163）

1 引 言

現(xiàn)代生物學(xué)和生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域迫切需要大視場(chǎng)、高分辨率的顯微成像技術(shù)和儀器對(duì)生物樣品進(jìn)行兼顧“全局形態(tài)”和“細(xì)節(jié)特征”的跨尺度觀測(cè)，以滿足重大科學(xué)問題的研究需求。在腦科學(xué)研究領(lǐng)域，需要在全腦范圍內(nèi)獲取介觀尺度的單神經(jīng)元結(jié)構(gòu)和功能信息，揭示腦連接及腦活動(dòng)的運(yùn)行機(jī)制[1-2]；在發(fā)育生物學(xué)和胚胎學(xué)研究領(lǐng)域，需要對(duì)發(fā)育早期的胚胎進(jìn)行快速三維成像，同時(shí)以亞細(xì)胞尺度的分辨率對(duì)器官或組織進(jìn)行更加精細(xì)的追蹤分析[3-4]；在腫瘤學(xué)研究領(lǐng)域，需要對(duì)活體腫瘤組織進(jìn)行大視野、亞細(xì)胞分辨率成像，進(jìn)而對(duì)腫瘤發(fā)生和發(fā)展的機(jī)理、腫瘤分子診斷及邊界識(shí)別等開展研究[5-6]。

然而，通過傳統(tǒng)的顯微鏡捕捉到的圖像，樣品的成像范圍和圖像的細(xì)節(jié)水平間存在矛盾，即成像視場(chǎng)（Field of View, FOV）和分辨率相互制約，這主要受限于系統(tǒng)的空間帶寬積（Space Bandwidth Product, SBP）?？臻g帶寬積指顯微系統(tǒng)的成像視場(chǎng)中可解析像素的數(shù)量，用于表征系統(tǒng)所傳遞的信息量。顯微系統(tǒng)的空間帶寬積由顯微物鏡的空間帶寬積和探測(cè)器的空間帶寬積共同決定。一般而言，探測(cè)器的空間帶寬積（指探測(cè)器的像素?cái)?shù)）需與顯微物鏡的空間帶寬積相匹配。顯微物鏡的空間帶寬積與成像視場(chǎng)成正比，與分辨率的平方成反比，即SBP=FOV/(0.5ε)2，其中，系數(shù)0.5來源于奈奎斯特采樣定律，ε為顯微物鏡的橫向分辨率，其由顯微物鏡的工作波長(zhǎng)和數(shù)值孔徑（Numerical Aperture，NA）決定?，F(xiàn)有商業(yè)顯微鏡的空間帶寬積通常在幾兆至幾十兆范圍內(nèi)。一方面，受設(shè)計(jì)、加工和裝調(diào)工藝的限制，顯微物鏡的空間帶寬積難以提升，此外，商業(yè)顯微鏡的物鏡需滿足互換性要求，通常按照一定行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)或企業(yè)標(biāo)準(zhǔn)設(shè)計(jì)，這也限制了顯微物鏡的設(shè)計(jì)空間；另一方面，商業(yè)圖像傳感器的像素?cái)?shù)量有限，無法滿足高空間帶寬積成像需求。

為了突破成像系統(tǒng)空間帶寬積的限制，研究者們采取了以下兩種方法：(1)掃描拼接成像[7-10]；(2)傅立葉切片成像[11-12]。然而，這兩類方法的缺點(diǎn)是全視場(chǎng)成像速度慢，在成像過程中樣本需要保持靜態(tài)，這在生物動(dòng)力學(xué)的研究中很難實(shí)現(xiàn)[13]。在半導(dǎo)體器件制造領(lǐng)域，為了提高成像系統(tǒng)的空間帶寬積，研究者們開發(fā)了大視場(chǎng)浸水光刻物鏡及成像系統(tǒng)，但這些系統(tǒng)僅適用于單色光（例如波長(zhǎng)為193 nm的單色光）和固定物距的工作場(chǎng)景，難以應(yīng)用于生物醫(yī)學(xué)成像領(lǐng)域[14]。在生物醫(yī)學(xué)成像領(lǐng)域，英國(guó)科學(xué)家McConnell 等人研發(fā)了大視場(chǎng)高分辨率顯微物鏡 Mesolens[14-16]。該顯微物鏡成像視場(chǎng)為 Φ6 mm，數(shù)值孔徑為0.47，基于Mesolens設(shè)計(jì)的共聚焦顯微鏡橫向分辨率和軸向分辨率分別為 0.7 μm 和 7 μm，可以對(duì)直徑達(dá)Φ6 mm、厚達(dá)3 mm的生物樣本進(jìn)行三維成像，由于采用點(diǎn)掃描共聚焦成像的策略，該顯微鏡需要大約 200 s才能獲得全視場(chǎng)的圖像，這極大地限制了其在高動(dòng)態(tài)樣品上的應(yīng)用[14-16]。美國(guó)科學(xué)家Spencer LaVere Smith團(tuán)隊(duì)開發(fā)了大視場(chǎng)、雙路徑掃描的雙光子顯微鏡系統(tǒng)Diesel2p，該系統(tǒng)在全視場(chǎng)成像模式下，成像視場(chǎng)略小于5 mm×5 mm，橫向分辨率約為1 μm，軸向分辨率約為8 μm，成像深度可達(dá)500 μm；在多區(qū)域成像模式下，兩束獨(dú)立的激光同時(shí)在兩個(gè)不同的區(qū)域采集圖像，成像視場(chǎng)均為1.5 mm × 5 mm，分辨率為1.5 μm×1.2 μm，成 像速率為3.84 frame/s[17]。采用雙光子成像技術(shù)的Diesel2p較好地抑制了離焦信號(hào)的干擾且具有較深的成像穿透深度，但是其成像速度和成像分辨率仍有較大的提升空間。國(guó)內(nèi)方面，戴瓊海院士團(tuán)隊(duì)研發(fā)了超寬視場(chǎng)高分辨率實(shí)時(shí)顯微成像儀器（RUSH），采用特制高空間帶寬積顯微物鏡（成像視場(chǎng)為10 mm×12 mm，數(shù)值孔徑為0.35）和35個(gè)像素為2 560 × 2 160的相機(jī)陣列，構(gòu)建了多尺度曲面中繼協(xié)同的顯微成像系統(tǒng)，實(shí)現(xiàn)了兼具1 cm×1.2 cm超寬視場(chǎng)、1.2 μm高分辨率、30 frame/s高幀率、5.1 GPixel/s高數(shù)據(jù)通量的生物動(dòng)態(tài)成像[13]。然而，RUSH系統(tǒng)的軸向分辨率偏低，僅有15.52 μm±1.80 μm，而且視場(chǎng)拼接的成像方式會(huì)不可避免地降低全視場(chǎng)圖像中重疊區(qū)域的分辨率和強(qiáng)度。此外，上述高空間帶寬積顯微成像系統(tǒng)共同的特征是體積龐大、實(shí)施成本高昂、難以推廣應(yīng)用。

為了獲取大體積生物組織的三維精細(xì)結(jié)構(gòu)，顯微成像系統(tǒng)需具備光切片成像能力。通常采用兩種策略實(shí)現(xiàn)光切片成像[18]：一種是通過控制照明光僅激發(fā)樣品焦面附近信號(hào)，避免激發(fā)離焦信號(hào)，如多光子顯微成像技術(shù)[19]、光片照明顯微成像技術(shù)[20]、全內(nèi)反射顯微成像技術(shù)[21]等；另一種是通過物理阻擋、解調(diào)或去卷積算法實(shí)現(xiàn)對(duì)離焦信號(hào)的去除，留下焦面上的清晰信號(hào)，如共聚焦顯微成像技術(shù)[22]、結(jié)構(gòu)光照明顯微成像技術(shù)[23]、動(dòng)態(tài)散斑照明顯微成像技術(shù)[24]、HiLo顯微成像技術(shù)[25]等。相關(guān)的研究證明了HiLo 顯微成像與共聚焦顯微成像技術(shù)的光切片能力相當(dāng)，但前者全視場(chǎng)光切片成像速度明顯優(yōu)于后者，原則上僅受相機(jī)曝光時(shí)間的限制，此外，HiLo 顯微鏡僅需要消散斑裝置和相干照明光源（如激光）即可低成本地實(shí)施[25]，且與常規(guī)熒光顯微鏡具有良好的兼容性。

因此，針對(duì)現(xiàn)代生物學(xué)和生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域?qū)ι飿悠愤M(jìn)行大視野、高分辨率的跨尺度觀測(cè)需求，以及現(xiàn)有高空間帶寬積顯微成像系統(tǒng)存在體積龐大、實(shí)施成本高昂等問題，本文基于HiLo光切片技術(shù)和自主設(shè)計(jì)的大視場(chǎng)高分辨顯微物鏡，研發(fā)了具有高空間帶寬積特點(diǎn)的大視場(chǎng)高分辨HiLo光切片顯微成像系統(tǒng)，測(cè)試了系統(tǒng)的成像視場(chǎng)和分辨率，開展了生物樣本成像實(shí)驗(yàn)，旨在展示該系統(tǒng)具有兼顧大視場(chǎng)和高分辨率成像的優(yōu)勢(shì)和快速光切片成像的能力，能夠?qū)Υ篌w積生物樣本開展快速三維成像，為胚胎發(fā)育、腦成像、數(shù)字病理診斷等研究提供有力的技術(shù)支撐。

2 方法及原理

2.1 HiLo光切片技術(shù)

HiLo光切片技術(shù)最早由Mertz等人提出，其中，“Hi”和“Lo”分別代表焦面高（High）空間頻率和焦面低(Low)空間頻率分量。該技術(shù)需對(duì)樣本采集一幅散斑照明圖像Is和一幅均勻照明圖像Iu（包含焦面高頻信息、焦面低頻信息和離焦信息），然后對(duì)Is和Iu的差分圖像進(jìn)行對(duì)比度評(píng)價(jià)，得到加權(quán)函數(shù)，以此函數(shù)作為Iu中焦面信息的比例，將低通濾波器應(yīng)用于加權(quán)的均勻照明圖像，得到Iu中的焦面低頻分量，然后，將互補(bǔ)的高通濾波器應(yīng)用于Iu，獲得焦面高頻分量，最后，將二者加權(quán)融合，得到光切片圖像[25-26]。相應(yīng)算法的流程如下：

首先，計(jì)算散斑照明圖像和均勻照明圖像的差分圖像δI的 散斑對(duì)比度Cδs(z)，Cδs(z)在樣本對(duì)焦時(shí)達(dá)到峰值，而在樣本離焦時(shí)衰減為零，因此可以用于區(qū)分均勻照明圖像中焦面信息和離焦信息，具體表達(dá)式為[26]：

其中，As是 散斑顆粒的平均橫向面積， OTFdet(k,z)是顯微系統(tǒng)光學(xué)傳遞函數(shù)， OTFill(k,0)是照明光學(xué)傳遞函數(shù)，W(k)是通過兩個(gè)高斯低通濾波器相減生成的帶通濾波器，用于加速Cδs(z)離焦衰減，

其中，k是空間頻率，σ是帶通濾波器的標(biāo)準(zhǔn)偏差。仿真實(shí)驗(yàn)已經(jīng)證明，光切片能力（即系統(tǒng)軸向分辨率）與σ成反比[26]。系統(tǒng)的軸向分辨率與其三維點(diǎn)擴(kuò)散函數(shù)相關(guān)，可通過顯微物鏡焦深計(jì)算公式確定系統(tǒng)的軸向分辨率理論值，進(jìn)而估計(jì)σ。

以上述散斑對(duì)比度Cδs(z)為加權(quán)函數(shù)得到均勻照明圖像中焦面信息的比例，將低通濾波器LP(k)應(yīng)用于加權(quán)的均勻照明圖像，得到均勻照明圖像中的焦面低頻信息ILP為

進(jìn)一步，將高通濾波器 HP(k)=1-LP(k)直接應(yīng)用于均勻照明圖像，得到互補(bǔ)的焦面高頻信息，即

最后，由上述兩幅圖像加權(quán)融合得到HiLo 光切片圖像，即

其中，η是一個(gè)縮放函數(shù)，用于補(bǔ)償實(shí)際成像中散斑對(duì)比度通常不等于 1的情況，確保低空間頻率到高空間頻率的平滑過渡。η可以通過以下公式計(jì)算，

實(shí)踐中，高通濾波器和低通濾波器的分割頻率kc可 以按照kc=0.18σ估計(jì)[26]。

2.2 大視場(chǎng)高分辨顯微物鏡

顯微成像系統(tǒng)的視場(chǎng)和分辨率主要由顯微物鏡決定。根據(jù)瑞利判據(jù)和顯微物鏡焦深計(jì)算公式，顯微物鏡的橫分辨率 ε和軸向分辨率zmin分別為

式中，λ為工作波長(zhǎng)，n為 物方介質(zhì)折射率，NA為顯微物鏡的數(shù)值孔徑。若顯微物鏡工作波段為可見光波段，為保證系統(tǒng)橫向分辨率達(dá)到亞微米級(jí)，顯微物鏡數(shù)值孔徑至少為0.49。據(jù)此，設(shè)計(jì)了大視場(chǎng)高分辨顯微物鏡，其參數(shù)如表1所示。

表1 大視場(chǎng)高分辨顯微物鏡設(shè)計(jì)參數(shù)Tab. 1 Design parameters of the wide-field-of-view and high-resolution objective

大視場(chǎng)高分辨顯微物鏡光學(xué)采用無限遠(yuǎn)共軛距結(jié)構(gòu)，初始結(jié)構(gòu)采用傳統(tǒng)顯微物鏡的8組11片鏡片結(jié)構(gòu)形式，通過改變各個(gè)鏡片的曲率半徑與間距、選擇特殊玻璃材料以及控制鏡頭組的光焦度等一系列手段，對(duì)像差進(jìn)行優(yōu)化校正，得到滿足性能要求的光學(xué)設(shè)計(jì)，如圖1（彩圖見期刊電子版）所示。圖1（a）像差曲線表明，物鏡的球差和慧差控制良好；圖1（b）軸向色差曲線表明，各波長(zhǎng)的光在0.85歸一化光瞳坐標(biāo)下幾乎交于一點(diǎn)，表明良好地校正了軸向色差，實(shí)現(xiàn)了復(fù)消色差；圖1（c）場(chǎng)曲和畸變曲線表明，該鏡頭滿足平場(chǎng)條件，最大畸變小于1%；圖1（d）MTF曲線圖表明，全視場(chǎng)全波段的MTF接近衍射極限，在1 000 lp/mm處MTF達(dá)到0.2，物鏡設(shè)計(jì)良好。

圖1 大視場(chǎng)高分辨顯微物鏡光學(xué)設(shè)計(jì)評(píng)價(jià)圖Fig. 1 Design evaluation graphs of the wide-field-of-view and high-resolution objective

2.3 大視場(chǎng)高分辨HiLo光切片顯微成像系統(tǒng)

基于HiLo光切片技術(shù)和大視場(chǎng)高分辨顯微物鏡設(shè)計(jì)了大視場(chǎng)高分辨HiLo光切片顯微成像系統(tǒng)，系統(tǒng)光學(xué)原理如圖2所示，其主要由激光光源模塊、落射式照明模塊、白光照明模塊和成像模塊等組成。激光光源模塊由波長(zhǎng)為488 nm和561 nm的雙色激光器、消散斑裝置和光纖耦合器構(gòu)成，消散斑裝置基于多模光纖振動(dòng)的方法抑制激光散斑，通過控制消散斑裝置中音圈電機(jī)模組振動(dòng)的關(guān)閉/開啟，獲取散斑照明激光和均勻照明激光。落射式照明模塊由光纖耦合器、兩套4f中繼鏡組和光闌構(gòu)成，用于將激光光源模塊傳導(dǎo)過來的激光光束準(zhǔn)直、擴(kuò)束、會(huì)聚、再準(zhǔn)直，最后，形成平行光照亮樣品面。白光照明模塊由白光LED光源、科勒照明光路構(gòu)成，用于為顯微系統(tǒng)提供合適的白光照明光源。成像模塊由軸向電動(dòng)精密位移臺(tái)、二維載物臺(tái)、大視場(chǎng)顯微物鏡、熒光濾光器模組、反射鏡、管鏡、大靶面相機(jī)構(gòu)成。其中，熒光濾光器模組由488 nm熒光濾光器和561 nm熒光濾光器構(gòu)成，它們可以切換至成像模塊主光路中，每一組熒光濾光器由對(duì)應(yīng)的激發(fā)光濾光片、二向色鏡、發(fā)射光濾光片構(gòu)成。成像模塊用于接收樣品的透射光和熒光信號(hào)，實(shí)現(xiàn)明場(chǎng)成像或熒光成像。

圖2 大視場(chǎng)高分辨HiLo光切片顯微成像系統(tǒng)光學(xué)原理圖Fig. 2 Schematic diagram of wide-field-of-view and high-resolution HiLo optical sectioning microscopy system

為了匹配大視場(chǎng)顯微物鏡的空間帶寬積，需選用大靶面科學(xué)級(jí)相機(jī)（sCMOS），根據(jù)奈奎斯特采樣定理，探測(cè)器對(duì)角線方向需要的像素?cái)?shù)為6 mm/(0.98 μm/2)＝12 245。因此，選用韓國(guó)LAON PEOPLE公司LPMVC-CXP151M面陣相機(jī)，像素為14 192(H)×10 640(V)，像元大小為3.76 μm×3.76 μm，全分辨率幀率為6 frame/s。由于該相機(jī)數(shù)據(jù)通量高達(dá)0.9 GPixel/s，為其配備了高速數(shù)據(jù)采集卡。高速數(shù)據(jù)采集卡型號(hào)為以色列KAYA Instruments公司的Komodo CoaXPress 4CH，具備4個(gè)CoaXPress接口通道，每個(gè)通道數(shù)據(jù)傳輸速度為6.25 frame/s。此外，根據(jù)大視場(chǎng)顯微物鏡和大靶面相機(jī)參數(shù)，匹配設(shè)計(jì)了成像管鏡，焦距為444 mm。

基于上述原理研發(fā)了大視場(chǎng)高分辨HiLo光切片顯微成像系統(tǒng)，實(shí)物照片如圖3所示。相較現(xiàn)有商業(yè)顯微鏡幾兆（Million，M）至幾十兆的空間帶寬積，本系統(tǒng)空間帶寬積高達(dá)151 M，系統(tǒng)參數(shù)如表2所示。系統(tǒng)具備3種成像模式：（1）白光照明的明場(chǎng)成像；（2）均勻激光照明的寬場(chǎng)熒光成像；（3）散斑和均勻激光混合照明的HiLo光切片成像。

圖3 系統(tǒng)實(shí)物照片F(xiàn)ig. 3 Photo of the system

表2 系統(tǒng)參數(shù)Tab. 2 Parameters of the system

綜上，HiLo光切片顯微成像系統(tǒng)與落射式熒光顯微鏡類似，只是在照明路徑中增加了激光束和消散斑裝置，以形成散斑照明和均勻照明光。當(dāng)消散斑裝置處于靜態(tài)時(shí)，在樣品面上形成散斑照明；當(dāng)消散斑裝置工作時(shí)，產(chǎn)生的散斑在相機(jī)曝光過程中變得模糊，有效地在樣品面上形成了均勻照明。對(duì)采集的散斑照明圖像和均勻光照明圖像進(jìn)行處理，得到HiLo光學(xué)切片圖像。

3 系統(tǒng)性能測(cè)試

3.1 成像視場(chǎng)測(cè)試

利用大視場(chǎng)高分辨HiLo光切片顯微成像系統(tǒng)對(duì)Thorlabs公司測(cè)試靶標(biāo)R1L3S5P進(jìn)行白光照明明場(chǎng)成像，開展系統(tǒng)成像視場(chǎng)測(cè)試實(shí)驗(yàn)，測(cè)試結(jié)果如圖4所示，其中，圖4(a)為橫向視場(chǎng)測(cè)試結(jié)果，圖4(b)為縱向視場(chǎng)測(cè)試結(jié)果。由圖4可知，系統(tǒng)的橫向視場(chǎng)H約為4.8 mm，縱向視場(chǎng)V約為3.6 mm。計(jì)算可得，系統(tǒng)的對(duì)角視場(chǎng)

圖4 系統(tǒng)成像視場(chǎng)測(cè)試結(jié)果圖Fig. 4 The test results of FOV of the system

3.2 分辨率測(cè)試

利用大視場(chǎng)高分辨HiLo光切片顯微成像系統(tǒng)對(duì)經(jīng)過標(biāo)定的星點(diǎn)直徑為 Φ 200 nm的星點(diǎn)板進(jìn)行白光照明明場(chǎng)成像，開展系統(tǒng)橫向分辨率測(cè)試實(shí)驗(yàn)。在采集的星點(diǎn)圖像上隨機(jī)選取15個(gè)星點(diǎn)像，對(duì)其橫向光強(qiáng)分布進(jìn)行高斯擬合，得到橫向光強(qiáng)分布半峰全寬（Full Width at Half Maximum，F(xiàn)WHM），F(xiàn)WHM取平均值后，由以下公式計(jì)算得到系統(tǒng)橫向分辨率ε，即

式中，dx是相機(jī)像元大小，X是大視場(chǎng)高分辨HiLo光切片顯微成像系統(tǒng)的放大倍率。

系統(tǒng)橫向分辨率測(cè)試結(jié)果如圖5（彩圖見期刊電子版）所示。圖5（a）是200 nm星點(diǎn)板白光照明明場(chǎng)成像結(jié)果，圖5（b）是隨機(jī)選取的15個(gè)星點(diǎn)像橫向光強(qiáng)分布曲線，圖5（c）是15個(gè)星點(diǎn)像橫向光強(qiáng)分布高斯擬合曲線的FWHM。FWHM平均值為2.19 pixel，相機(jī)像元尺寸為3.76 μm，系統(tǒng)放大倍率設(shè)計(jì)值為11.1×，由式（9）計(jì)算得到系統(tǒng)的橫向分辨率為0.74 μm。

圖5 系統(tǒng)橫向分辨率測(cè)試結(jié)果圖Fig. 5 The test results of lateral resolution of the system

利用大視場(chǎng)高分辨HiLo光切片顯微成像系統(tǒng)對(duì)2 μm綠色熒光聚甲基丙烯酸甲酯微球（無錫瑞格生物科技有限責(zé)任公司，型號(hào)UniFlu PMMA-0202G，以下簡(jiǎn)稱“熒光微球”）進(jìn)行三維光切片成像，開展系統(tǒng)軸向分辨率測(cè)試實(shí)驗(yàn)。將稀釋后的熒光微球溶液用濃度為6%甲基纖維素凝膠固定在培養(yǎng)皿中，然后將培養(yǎng)皿固定在樣品臺(tái)上。在488 nm激發(fā)光照明下，系統(tǒng)以0.3 μm的運(yùn)動(dòng)步長(zhǎng)對(duì)熒光微球樣品軸向（Z向）掃描成像，共采集50層圖像，每層圖像包含一幅散斑照明熒光圖像和一幅均勻照明熒光圖像。

利用HiLo光切片算法處理每層散斑照明圖像和均勻照明圖像，得到50層熒光微球光切片圖像，合成為熒光微球三維光切片圖像。在三維光切片圖像中隨機(jī)選取15個(gè)熒光微球，對(duì)其光強(qiáng)分布進(jìn)行去卷積處理，排除熒光微球直徑對(duì)測(cè)量結(jié)果的影響，得到系統(tǒng)三維點(diǎn)擴(kuò)散函數(shù)（Point Spread Function, PSF），然后對(duì)三維PSF軸向光強(qiáng)分布進(jìn)行高斯擬合，得到FWHM，F(xiàn)WHM取平均值后，結(jié)合電動(dòng)精密位移臺(tái)運(yùn)動(dòng)步長(zhǎng)dz計(jì)算得到系統(tǒng)軸向分辨率zmin，即

系統(tǒng)軸向分辨率測(cè)試結(jié)果如圖6（彩圖見期刊電子版）所示：圖6（a）是熒光微球部分Z平面的熒光圖像，圖6（b）是隨機(jī)選取的15個(gè)熒光微球去卷積后得到的三維PSF軸向光強(qiáng)分布曲線，圖6（c）是三維PSF軸向光強(qiáng)分布高斯擬合曲線的FWHM。FWHM平均值為13.87步（step），由式（10）計(jì)算得到系統(tǒng)軸向分辨率為4.16 μm。

圖6 系統(tǒng)軸向分辨率測(cè)試結(jié)果圖Fig. 6 The test results of the axial resolution of the system

綜上，系統(tǒng)成像視場(chǎng)測(cè)試值為6.0 mm，與設(shè)計(jì)值一致；系統(tǒng)橫向分辨率測(cè)試值為0.74 μm，軸向分辨率測(cè)試值為4.16 μm。

4 生物樣本成像實(shí)驗(yàn)

4.1 小鼠腦切片明場(chǎng)成像實(shí)驗(yàn)

利用大視場(chǎng)高分辨HiLo光切片顯微成像系統(tǒng)對(duì)蘇木精-伊紅(HE)染色的小鼠腦冠狀切片開展白光照明明場(chǎng)成像實(shí)驗(yàn)，并與成像視場(chǎng)相近的OLYMPUS顯微鏡BX50（配備PLN4X物鏡：NA，0.1，F(xiàn)OV，Φ5.5 mm）和分辨率相近的OLYMPUS顯微鏡BX50（配備PLN20X物鏡：NA，0.4；FOV，Φ1.1 mm）成像結(jié)果對(duì)比，成像結(jié)果如圖7（彩圖見期刊電子版）所示。圖7（a）是大視場(chǎng)高分辨HiLo光切片顯微成像系統(tǒng)的成像結(jié)果，圖7（b）是成像視場(chǎng)相近的OLYMPUS顯微鏡成像結(jié)果，圖7（c）是分辨率相近的OLYMPUS顯微鏡成像結(jié)果。圖7表明，大視場(chǎng)高分辨HiLo光切片顯微成像系統(tǒng)與成像視場(chǎng)相近的OLYMPUS顯微鏡相比，具有更高的分辨率；與分辨率相近的OLYMPUS顯微鏡相比，具有更大的成像視場(chǎng)。因此，系統(tǒng)具有兼顧大視場(chǎng)和高分辨成像的優(yōu)勢(shì)。

圖7 HE染色的小鼠腦切片白光照明明場(chǎng)成像結(jié)果對(duì)比圖Fig. 7 Comparison of brightfield imaging results of a HEstained mouse brain slice illuminated by white light

4.2 小麥種子熒光切片三維光切片成像實(shí)驗(yàn)

利用大視場(chǎng)高分辨HiLo光切片顯微成像系統(tǒng)對(duì)異硫氰酸熒光素-小麥胚芽凝集素(FITCWGA)染色的小麥種子切片開展三維（Three-dimensional，3D）光切片成像實(shí)驗(yàn)。被測(cè)樣品體積約為4.2 mm×3.6 mm×0.1 mm，激發(fā)光波長(zhǎng)為488 nm，激光器功率約為50 mW，樣品平面上的光功率密度約為1.2 mW/cm2，相機(jī)曝光時(shí)間設(shè)為500 ms，以2 μm的運(yùn)動(dòng)步長(zhǎng)對(duì)樣本進(jìn)行軸向（Z向）掃描

成像，共采集50層100幅圖像（每層采集一幅散斑照明圖像和一幅均勻照明圖像）。利用HiLo光切片算法處理每層采集的散斑照明圖像和均勻照明圖像（即寬場(chǎng)熒光圖像），得到50層圖像切片，將所有切片合成為三維光切片圖像棧，相應(yīng)的均勻照明圖像切片合成為三維寬場(chǎng)圖像棧，成像結(jié)果對(duì)比圖如圖8（彩圖見期刊電子版）所示。圖8（a）和8（b）分別是三維光切片圖像棧和三維寬場(chǎng)圖像棧全視場(chǎng)XY平面均值投影圖，圖8（c）和8（d）分別是三維光切片圖像棧和三維寬場(chǎng)圖像棧局部視場(chǎng)XY平面均值投影圖，圖8（e）和8（f）分別是三維光切片圖像棧和三維寬場(chǎng)熒光圖像棧局部視場(chǎng)XZ平面投影圖。圖8表明，大視場(chǎng)高分辨HiLo光切片顯微成像系統(tǒng)具有顯著的光切片能力，在對(duì)厚樣本成像時(shí)，能夠有效抑制傳統(tǒng)寬場(chǎng)熒光成像時(shí)的離焦信息，提高圖像的橫向分辨率和軸向分辨率。

圖8 FITC-WGA染色的小麥種子熒光切片三維光切片成像和三維寬場(chǎng)熒光成像結(jié)果對(duì)比圖（50層圖像切片，單層圖像切片厚2 μm）Fig. 8 Comparison of 3D optical sectioning and wide-field fluorescence imaging results of a FITC-WGAstained wheat seed fluorescence slice (50 slices,2 μm thick of every slice)

此外，系統(tǒng)對(duì)小麥種子熒光切片50層圖像的采集共計(jì)耗時(shí)約150 s（包含軸向精密位移臺(tái)的運(yùn)動(dòng)時(shí)間和圖像存儲(chǔ)時(shí)間），這表明，大視場(chǎng)高分辨HiLo光切片顯微成像系統(tǒng)能夠?qū)Υ篌w積生物樣本開展快速光切片成像。

5 結(jié) 論

現(xiàn)代生物學(xué)和生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域迫切需要大視場(chǎng)、高分辨率的顯微成像技術(shù)和儀器對(duì)生物樣品進(jìn)行兼顧“全局形態(tài)”和“細(xì)節(jié)特征”的跨尺度觀測(cè)，以滿足重大科學(xué)問題的研究需求。受限于系統(tǒng)的空間帶寬積，傳統(tǒng)商業(yè)顯微鏡無法滿足這一需求，且現(xiàn)有高空間帶寬積顯微成像系統(tǒng)存在體積龐大、實(shí)施成本高昂等問題。本文基于HiLo光切片技術(shù)和自主設(shè)計(jì)的大視場(chǎng)高分辨顯微物鏡，研發(fā)了具有高空間帶寬積特點(diǎn)的大視場(chǎng)高分辨顯微成像系統(tǒng)，測(cè)試了系統(tǒng)的成像視場(chǎng)和分辨率，應(yīng)用該系統(tǒng)對(duì)小鼠腦切片開展了白光照明明場(chǎng)成像實(shí)驗(yàn)，并與成像視場(chǎng)和分辨率相近的OLYMPUS顯微鏡成像結(jié)果做了對(duì)比，同時(shí)，應(yīng)用該系統(tǒng)對(duì)小麥種子熒光切片開展了光切片成像和寬場(chǎng)熒光成像對(duì)比實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明, 大視場(chǎng)高分辨HiLo光切片顯微成像系統(tǒng)的成像視場(chǎng)為4.8 mm×3.6 mm(對(duì)角視場(chǎng)6.0 mm)，橫向分辨率為0.74 μm，軸向分辨率為4.16 μm。大視場(chǎng)高分辨HiLo光切片顯微成像系統(tǒng)具有兼顧大視場(chǎng)和高分辨率成像的優(yōu)勢(shì)和快速光切片成像的能力，能夠?qū)Υ篌w積生物樣本開展快速三維成像，將為胚胎發(fā)育、腦成像、數(shù)字病理診斷等研究提供有力的技術(shù)支撐。