在體跨尺度雙光子顯微成像技術(shù)

陳 帥，任 林，周鎮(zhèn)喬，李 敏，賈宏博

（1. 廣西大學(xué) 物理科學(xué)與工程技術(shù)學(xué)院和腦與智能研究中心, 廣西 南寧 530004；2. 中國(guó)科學(xué)院 蘇州生物醫(yī)學(xué)工程技術(shù)研究所, 江蘇 蘇州 215163）

1 引 言

1930年，物理學(xué)家Maria Goeppert-Mayer在其博士論文《研究原子的雙光子吸收之可能性》中指出雙光子的吸收是介質(zhì)吸收兩個(gè)光子的過(guò)程，該過(guò)程中單個(gè)光子能量無(wú)法使介質(zhì)中的分子從其基態(tài)變成激發(fā)態(tài)，只能使兩個(gè)光子在極短的時(shí)間內(nèi)（ps量級(jí)）同時(shí)被吸收，從基態(tài)通過(guò)一個(gè)虛態(tài)最后達(dá)到激發(fā)態(tài)，過(guò)程中將有兩個(gè)光子被吸收，所以稱(chēng)為雙光子吸收?；谠摾碚摚?990年，博士生Winfried Denk提出了一種成像技術(shù)：雙光子激光掃描顯微鏡，該技術(shù)的出現(xiàn)對(duì)神經(jīng)科學(xué)研究產(chǎn)生了革命性影響[1]。相比于單光子熒光激發(fā)，雙光子熒光激發(fā)需要更長(zhǎng)波長(zhǎng)和更高光子密度的激光。這些紅外激發(fā)光在生物組織中散射小，且只有焦點(diǎn)附近小體積的熒光分子能被激發(fā)，因此提高了成像深度和信噪比，并使得雙光子在厚生物組織中仍能具有極高的三維空間分辨率(～0.5 μm)，結(jié)合雙光子光毒性小等優(yōu)點(diǎn)，雙光子顯微鏡非常適合用來(lái)對(duì)腦神經(jīng)細(xì)胞活動(dòng)進(jìn)行在體成像[2-4]。

自1997年，Winfried Denk等人首次將雙光子顯微成像技術(shù)用于在體觀測(cè)小鼠大腦的錐體神經(jīng)元的感官刺激修道樹(shù)突鈣離子動(dòng)態(tài)以來(lái)，雙光子顯微鏡在神經(jīng)科學(xué)研究領(lǐng)域的潛能完全凸顯[5-6]。但是初代雙光子顯微鏡存在成像視野小、成像通量低、鏡體體積較大的問(wèn)題，限制了其獲取生物圖像信息的能力。尤其是其主要適用應(yīng)用場(chǎng)景暨腦科學(xué)在體神經(jīng)細(xì)胞形態(tài)和功能研究，特別需要跨尺度成像技術(shù)的發(fā)展。因?yàn)樯窠?jīng)細(xì)胞具有與身體其他器官細(xì)胞完全不同的形態(tài)和功能。神經(jīng)細(xì)胞互相連接組成全腦范圍的復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)，一個(gè)皮層單個(gè)神經(jīng)元的軸突投射范圍就幾乎可以從大腦皮層的一側(cè)半球直接到達(dá)另一側(cè)半球，大腦神經(jīng)活動(dòng)信息傳遞的距離（小鼠：cm量級(jí)；人類(lèi)：dm量級(jí)），相比于釋放神經(jīng)遞質(zhì)的突觸尺寸（μm量級(jí)），其尺度至少跨越4～5個(gè)數(shù)量級(jí)，因此對(duì)于空間跨尺度成像有很高需求[7-8]。在深度維度上面，雙光子顯微鏡激發(fā)光的波段集中在600～1 100 nm，該波段的光子最容易被水吸收而不易被組織中的其他物質(zhì)吸收，因此有較強(qiáng)的穿透能力，雙光子顯微鏡的探測(cè)深度可達(dá)700～1 000 μm，而小鼠腦皮層的厚度約為1 mm，因此雙光子顯微技術(shù)剛好可以觀測(cè)小鼠腦皮層各層的神經(jīng)元及其信號(hào)。而小鼠腦皮層以下的區(qū)域如下丘腦、海馬等，其深度在皮層下大于1 mm處，因此深層腦區(qū)域成像也對(duì)雙光子顯微鏡在擴(kuò)展成像深度的尺度上提出了新需求[9-10]。在時(shí)間維度上，神經(jīng)突觸間的信號(hào)傳遞時(shí)間在10 ms量級(jí)，為了能更高效地探測(cè)到神經(jīng)元信號(hào)，需要更快的掃描速度對(duì)信號(hào)進(jìn)行捕獲。目前基于共振鏡掃描的雙光子圖像刷新頻率為10～30 Hz，在該頻率下通常只能滿足記錄反映神經(jīng)功能活動(dòng)的鈣火花信號(hào)（～100 ms量級(jí)）的需求，目前最新發(fā)展的反映膜電位活動(dòng)和谷氨酸等化學(xué)信號(hào)的新型熒光探針，響應(yīng)速度更快，記錄的信號(hào)能更直接真實(shí)地反映神經(jīng)動(dòng)作電位的活動(dòng)情況，但是要求雙光子顯微鏡的掃描成像速率達(dá)到100～1 000 Hz量級(jí)，即在時(shí)間尺度上需要提高1～2個(gè)數(shù)據(jù)級(jí)[11-13]。雙光子顯微鏡實(shí)現(xiàn)了實(shí)驗(yàn)動(dòng)物處在活體狀態(tài)下的腦神經(jīng)結(jié)構(gòu)與功能成像，但是需要對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的頭部（通常是顱骨）進(jìn)行固定，并放于顯微鏡鏡頭下進(jìn)行成像，動(dòng)物的行為依然受限且經(jīng)常需要全程麻醉處理。當(dāng)前腦功能研究通常需要結(jié)合動(dòng)物行為學(xué)實(shí)驗(yàn)，許多行為學(xué)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)要求實(shí)驗(yàn)動(dòng)物能在m級(jí)范圍內(nèi)自由清醒活動(dòng)，而傳統(tǒng)的固定臺(tái)式顯微鏡幾乎不可能做到在這樣大的范圍中仍保持μm級(jí)顯微分辨率，因此最近頭戴式雙光子成像探頭也是一個(gè)重要的發(fā)展方向，其需要雙光子顯微鏡在自身體積尺度下進(jìn)行減縮，同時(shí)增加實(shí)驗(yàn)動(dòng)物在成像過(guò)程中可自由活動(dòng)的尺度范圍。

本綜述將在介紹雙光子顯微鏡工作原理的基礎(chǔ)上，詳細(xì)介紹近年來(lái)雙光子顯微鏡在成像視野、成像通量、成像深度、分辨率等方面取得的跨量級(jí)技術(shù)指標(biāo)突破，并討論跨尺度雙光子在體顯微成像技術(shù)發(fā)展的難點(diǎn)及未來(lái)挑戰(zhàn)。

2 雙光子顯微成像基本工作原理

2.1 雙光子熒光激發(fā)原理

熒光團(tuán)分子中最外層的電子軌道決定了其作為熒光化合物的熒光量子產(chǎn)率以及吸收和發(fā)射光子的波長(zhǎng)。當(dāng)熒光化合物在其所謂的“基態(tài)”中吸收光能（光子）時(shí)，分子的電子態(tài)、振動(dòng)態(tài)和旋轉(zhuǎn)態(tài)就會(huì)發(fā)生改變。吸收的能量有時(shí)會(huì)將電子移動(dòng)到離原子核更遠(yuǎn)的軌道，其與原子核間的距離會(huì)隨時(shí)間發(fā)生變化，最終這些被吸收的能量都會(huì)被釋放。而振動(dòng)弛豫和熒光發(fā)射是熒光團(tuán)回到其低能基態(tài)的主要方式[14]，如圖1（a）（彩圖見(jiàn)期刊電子版）所示。熒光成像技術(shù)以及共聚焦顯微鏡，都是從光和物質(zhì)的相互作用中產(chǎn)生對(duì)比度，由于單光子熒光效應(yīng)是線性的，因此信號(hào)強(qiáng)弱與入射光強(qiáng)度呈線性關(guān)系。而在雙光子激發(fā)等非線性熒光效應(yīng)中，熒光信號(hào)大小與入射光強(qiáng)度呈非線性關(guān)系,如雙光子激發(fā)中熒光信號(hào)大小與入射光強(qiáng)度的平方有關(guān)，因此其對(duì)激光強(qiáng)度的敏感度更高。激光強(qiáng)度在時(shí)空分布上未達(dá)到基態(tài)電子躍遷所需條件時(shí)，電子躍遷的概率極低。為了產(chǎn)生足夠的信號(hào)，激發(fā)光必須空間和時(shí)間上高度集中[15-16]。高空間密度是通過(guò)高數(shù)值孔徑(NA)物鏡聚焦激光束產(chǎn)生的。時(shí)間上的高集中則需要使用激光器，發(fā)射“超短”脈沖（不到 1 ps）和相應(yīng)的高峰值強(qiáng)度。對(duì)于寬度為τ、 頻率為fR的激光脈沖，與連續(xù)波照明相比，非線性效應(yīng)產(chǎn)生的熒光信號(hào)增強(qiáng)了1 /(τfR)n-1倍 ，n為激發(fā)過(guò)程中參與的激發(fā)光子總數(shù)，對(duì)于雙光子熒光效應(yīng)，n=2。由此可知，激發(fā)光子在時(shí)間上越集中，熒光信號(hào)越強(qiáng)[17]。以上兩點(diǎn)使得基態(tài)的電子短期內(nèi)（ps范圍內(nèi)）吸收多個(gè)光子后擁有足夠的能量可以躍遷到更高能級(jí)上去，如圖1（b）（彩圖見(jiàn)期刊電子版）所示。

圖1 （a）單光子和（b）雙光子熒光激發(fā)原理Fig. 1 Excitation principles of (a) single photon and (b) two-photon fluorescence

相比于線性熒光顯微鏡，雙光子熒光顯微鏡的優(yōu)勢(shì)主要有以下兩點(diǎn)：（1）激發(fā)光的波長(zhǎng)范圍為670～1 070 nm，屬于近紅外光。由于在大多數(shù)組織中缺乏顯著近紅外光的內(nèi)源性（單光子）吸收劑，因此，近紅外光對(duì)生物組織的穿透性更強(qiáng)，其光毒性更小。而對(duì)于產(chǎn)生熒光而言，其主要分布在可見(jiàn)光波段，易于探測(cè)[18]。（2）當(dāng)激光束通過(guò)顯微鏡物鏡聚焦時(shí)，多光子吸收在空間上局限于焦點(diǎn)區(qū)域，非焦點(diǎn)區(qū)域被激發(fā)的可能性極低，因此，產(chǎn)生的熒光信號(hào)只會(huì)出現(xiàn)在目標(biāo)區(qū)域，大大增加了信號(hào)的信噪比，減少了光損傷，增加了組織活力，便于對(duì)組織進(jìn)行長(zhǎng)期探測(cè)[19]。線性激發(fā)時(shí)在激光束會(huì)聚的整個(gè)過(guò)程里都容易激發(fā)出熒光，焦外熒光干擾嚴(yán)重；非線性激發(fā)情況只有在焦點(diǎn)附近才發(fā)出熒光，因此非線性顯微鏡具有更高的空間分辨率和信噪比。

2.2 雙光子激光掃描顯微鏡

雙光子顯微鏡結(jié)構(gòu)如圖2所示，雙光子顯微鏡的結(jié)構(gòu)與共聚焦顯微鏡類(lèi)似，但相比于共聚焦顯微鏡，雙光子顯微鏡與其主要區(qū)別在于激發(fā)光源和熒光檢測(cè)路徑。雙光子顯微鏡主要包括6部分；飛秒激光器、光強(qiáng)調(diào)制器、激光掃描器、顯微物鏡、光電探測(cè)器、中央控制器和上位機(jī)軟件，掃描器目前主流部件為機(jī)械振鏡和聲光偏轉(zhuǎn)器[20]。雙光子顯微鏡的激光器多為鈦-藍(lán)寶石振蕩器，其重復(fù)頻率(～100 MHz)與典型的熒光壽命相匹配，從而平衡了激發(fā)效率和飽和現(xiàn)象。該類(lèi)激光器可以發(fā)射670～1 070 nm范圍的激光，因此可以激活多種生物熒光物質(zhì)[16]。激光的脈沖展寬需根據(jù)需求進(jìn)行設(shè)置，通常為100 fs。小于該脈寬的脈沖相對(duì)更容易被光路上的色散光學(xué)玻璃加寬。而大于該脈寬的激光脈沖激發(fā)效率低，需要傳遞的能量更大，容易對(duì)樣品造成熱損傷[21-22]。共聚焦熒光顯微鏡在收集熒光的時(shí)候需要在探測(cè)器前放置一個(gè)針孔光闌來(lái)減少焦外熒光對(duì)目標(biāo)區(qū)域信號(hào)的串?dāng)_。而對(duì)于雙光子顯微鏡，其熒光信號(hào)幾乎只在焦點(diǎn)產(chǎn)生，焦外熒光很少，因此不需要額外的輔助器件(如共焦小孔)來(lái)限制焦外熒光，從而顯著增強(qiáng)了熒光收集效率。

圖2 雙光子顯微鏡結(jié)構(gòu)示意圖Fig. 2 Schematic diagram of two-photon microscope structure

3 雙光子顯微鏡跨尺度技術(shù)發(fā)展方向

3.1 成像視野

雙光子激光掃描顯微鏡已被廣泛應(yīng)用于在體研究哺乳動(dòng)物大腦中亞細(xì)胞分辨率的神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，雙光子顯微鏡結(jié)合基因可編碼鈣指示劑(GECIs)已經(jīng)成為在散射腦組織中進(jìn)行神經(jīng)元功能成像的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)[1,17]。然而，此類(lèi)研究的范圍通常僅限于大腦的單個(gè)功能區(qū)域。而解剖和功能觀察表明，復(fù)雜的大腦功能來(lái)自于高度平行的計(jì)算[23-24]，其中感覺(jué)信息和行為參數(shù)被映射到全腦神經(jīng)元種群，其范圍超出了傳統(tǒng)顯微鏡的視場(chǎng)（＜1 mm2），因此近年來(lái)出現(xiàn)了多種大視場(chǎng)的雙光子顯微鏡系統(tǒng)。

多區(qū)域?qū)崟r(shí)雙光子成像技術(shù)（Multiarea Twophoton Real-time in vivo Explorer，MATRIEX），在傳統(tǒng)單光束掃描雙光子顯微鏡的基礎(chǔ)上將物鏡替換為雙層復(fù)合物鏡結(jié)構(gòu)，上層使用空氣物鏡（DO）實(shí)現(xiàn)大視野成像，下層采用微型物鏡陣列（MOs）起到二次聚焦放大的作用，將分辨率提高到μm量級(jí)，而且同時(shí)實(shí)現(xiàn)了多個(gè)分離區(qū)域的同時(shí)成像（圖3（a），彩圖見(jiàn)期刊電子版）。如中國(guó)科學(xué)院蘇州生物醫(yī)學(xué)工程技術(shù)研究所賈宏博課題組，使用MATRIEX實(shí)現(xiàn)了軸向和橫向超過(guò)1 mm的成像視場(chǎng)，并同時(shí)記錄了小鼠的初級(jí)視覺(jué)皮層、初級(jí)運(yùn)動(dòng)皮層和海馬 CA1 區(qū)單神經(jīng)元活動(dòng)的實(shí)時(shí)功能成像，探測(cè)區(qū)域橫向跨度最大可達(dá)12 mm，軸向最大跨度超過(guò)1 mm[25]。其另外一個(gè)優(yōu)點(diǎn)是僅對(duì)物鏡部分進(jìn)行了模塊替換，而沒(méi)有改變雙光子顯微鏡的其他硬件模塊和控制時(shí)序，容易實(shí)現(xiàn)快速推廣應(yīng)用。缺點(diǎn)是雖然區(qū)域可選范圍直徑達(dá)到12 mm，但只能成像若干離散區(qū)域，沒(méi)有實(shí)現(xiàn)大視野連續(xù)覆蓋成像。

Mark J Schnitzer研究組開(kāi)發(fā)一種離散多區(qū)域成像方法，其將兩個(gè)顯微鏡（獨(dú)立的掃描采集系統(tǒng)）放置在同一動(dòng)物的大腦上（圖3（b），彩圖見(jiàn)期刊電子版）。這種雙軸顯微鏡，因?yàn)槭褂玫氖峭耆?dú)立的兩套掃描、激發(fā)和探測(cè)系統(tǒng)，因此其不同區(qū)域可以同時(shí)被記錄，成像面積可提升為傳統(tǒng)雙光子顯微鏡成像面積的兩倍[26-27]，并且兩個(gè)成像區(qū)域可以間隔較大距離，實(shí)現(xiàn)兩個(gè)不同腦功能區(qū)的同時(shí)成像。然而，用這種方法對(duì)兩個(gè)以上的大腦區(qū)域成像會(huì)大幅增加裝置的成本和復(fù)雜性。

實(shí)現(xiàn)連續(xù)覆蓋大視野腦皮層成像，首先需要設(shè)計(jì)并制作大視野高分辨的介觀物鏡[28-29]。如Spencer L Smith設(shè)計(jì)了一款大視野介觀物鏡（圖3（c），彩圖見(jiàn)期刊電子版），在保持μm級(jí)分辨率的同時(shí)將成像視野增加到25 mm2[30]。同時(shí)為了提高成像通量，通過(guò)偏振光學(xué)器件(PBS)將入射激光分為兩束光路，同時(shí)使其中一路光的光程增加了1.87 m，比另一束光延遲6.25 ns到達(dá)腦表面。通過(guò)控制機(jī)動(dòng)轉(zhuǎn)向鏡（SM1、SM2）和XY掃描鏡（XYscan lens）改變光束在鼠腦XY平面的位置，再通過(guò)控制液體變焦透鏡（ETL）來(lái)改變激發(fā)光在鼠腦Z軸方向上的位置，被調(diào)控的激發(fā)光通過(guò)物鏡聚焦在指定位置。因?yàn)閮墒す獾竭_(dá)腦表面的時(shí)間不一樣（同一脈沖相差6.25 ns），因此每束激光產(chǎn)生的熒光可以利用時(shí)分多路復(fù)用技術(shù)，對(duì)不同區(qū)域的熒光信號(hào)分開(kāi)記錄，有效提升了信號(hào)采樣率。

Karel Svoboda研究組設(shè)計(jì)了大口徑大視野介觀物鏡，成像視野直徑達(dá)到5 mm（圖3（d），彩圖見(jiàn)期刊電子版）。在掃描方案上，他們通過(guò)共振鏡串聯(lián)一組大孔徑振鏡（20 mm），該共振鏡組由3個(gè)振鏡組成，兩個(gè)振鏡負(fù)責(zé)X-Y面掃描，另一個(gè)振鏡管控掃描區(qū)域的選擇。通過(guò)振鏡組掃描和切換成像區(qū)域，共振鏡提供高速掃描，實(shí)現(xiàn)了在視野跨度為5 mm×5 mm×1 mm范圍對(duì)4個(gè)任意0.6 mm×0.6 mm的區(qū)域同時(shí)成像[31]。

圖3 大尺度成像視野雙光子顯微鏡。（a）多區(qū)域?qū)崟r(shí)雙光子成像技術(shù)[25]；（b）雙掃描系統(tǒng)雙光子顯微鏡[26]；（c）雙掃描區(qū)域同步成像雙光子顯微鏡[28]；（d）多區(qū)域隨機(jī)掃描雙光子顯微鏡[31]。Fig. 3 Two-photon microscope with large-scale imaging field of view. (a) Multi-area real-time two-photon imaging technology[25]; (b) dual scanning system two-photon microscope[26]; (c) two-photon microscope with dual scanning area simultaneous imaging[28]; (d) two-photon microscope with multi-region follow-on scanning[31]

基于介觀物鏡，可以實(shí)現(xiàn)連續(xù)覆蓋（非離散）的大視野腦皮層雙光子成像[32-33]。但是目前在全視野和細(xì)胞分辨率（通?！? μm）下進(jìn)行連續(xù)覆蓋成像，時(shí)間分辨率仍然低于1 Hz。若降低空間采樣率要求（如5 μm），時(shí)間分辨率能提高到2～3 Hz，勉強(qiáng)達(dá)到鈣離子功能成像的需求。更常用的應(yīng)用成像模式仍是選定2～4個(gè)腦區(qū)的離散子區(qū)域，在不犧牲空間采樣率下實(shí)現(xiàn)10～20 Hz的時(shí)間分辨率。

3.2 成像通量

雙光子顯微鏡的成像通量決定了獲取腦神經(jīng)結(jié)構(gòu)與功能信息的效率。腦神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)機(jī)理研究越來(lái)越需要對(duì)大規(guī)模的神經(jīng)元群落同時(shí)獲取實(shí)時(shí)的功能信息，或者需要精準(zhǔn)捕捉單細(xì)胞高精度樹(shù)突網(wǎng)絡(luò)中的高速神經(jīng)動(dòng)作電位信號(hào)，因此對(duì)雙光子顯微鏡成像通量的提高提出了迫切的需求。

成像通量可以定義為每秒獲取圖像像素的總數(shù)，即為圖像像素?cái)?shù)乘以成像幀率。如果是三維體成像，還要乘以同時(shí)成像的深度方向?qū)訑?shù)，用三者的乘積對(duì)雙光子顯微鏡的成像通量進(jìn)行評(píng)估。

雙光子顯微鏡非線性激發(fā)特點(diǎn)導(dǎo)致其每個(gè)激光脈沖所激發(fā)的體積受限，進(jìn)而導(dǎo)致其常規(guī)成像通量在百萬(wàn)量級(jí)[21,30-31]。即使是上述的大視場(chǎng)雙光子顯微鏡系統(tǒng)，仍然受限于點(diǎn)掃描激發(fā)速度，雖然成像視野或可選范圍極大，但在實(shí)時(shí)成像條件下也只能對(duì)若干少量局部區(qū)域進(jìn)行掃描成像，像素通量也僅勉強(qiáng)達(dá)到千萬(wàn)量級(jí)。

提高雙光子顯微鏡成像通量的一種傳統(tǒng)方式是采用寬場(chǎng)照明結(jié)合時(shí)間聚焦（Temporal Focusing,TF）方法[34]，但這一定程度減弱了雙光子點(diǎn)激發(fā)的高空間選擇性，令圖像分辨率和信噪比下降。下面將介紹幾種最新雙光子高通量成像方法，它們通過(guò)多焦點(diǎn)或線掃描的方法實(shí)現(xiàn)億級(jí)的成像通量，對(duì)分辨率的影響小于寬場(chǎng)照明結(jié)合時(shí)間聚焦方法。

一個(gè)發(fā)展方向是提高雙光子體成像的通量[35-37]。Alipasha Vaziri研究組開(kāi)發(fā)的光珠顯微鏡[37]，是一種基于多焦點(diǎn)掃描和時(shí)分復(fù)用技術(shù)的顯微鏡，像素通量?jī)H受熒光壽命的限制，其特點(diǎn)是軸向上產(chǎn)生的多個(gè)存在脈沖延時(shí)的焦點(diǎn)覆蓋了500 μm的軸向范圍，可實(shí)現(xiàn)高通量的體成像。該套儀器的原理是將激光重復(fù)頻率大幅降低（4.7 MHz），這么做的目的是在一個(gè)脈沖周期內(nèi)產(chǎn)生足夠多個(gè)焦點(diǎn)間的脈沖延時(shí)，相鄰脈沖延時(shí)（6 ns）大于熒光壽命（～3 ns），足夠區(qū)分各焦點(diǎn)產(chǎn)生的熒光信號(hào)，降低信號(hào)串?dāng)_。使用多重軸向多路復(fù)用模塊將輸入的激光分成N份，產(chǎn)生脈沖延時(shí)的同時(shí)改變激光發(fā)散度，令各個(gè)焦點(diǎn)聚焦在不同深度，形成“光珠”柱，并通過(guò)調(diào)整分光比令每束激光能量不一，使焦點(diǎn)能量分布與成像深度呈指數(shù)關(guān)系，以抵消成像深度對(duì)熒光信號(hào)強(qiáng)度的衰減作用（圖4（a），彩圖見(jiàn)期刊電子版）。該技術(shù)可以在鼠腦中最多同時(shí)追蹤100萬(wàn)個(gè)神經(jīng)元，成像通量可達(dá)億級(jí)（1.41×108），最大幀率為9.8 Hz。

圖4 快速掃描雙光子成像技術(shù)。（a）光珠雙光子顯微鏡[37]；（b）多焦點(diǎn)快速掃描雙光子顯微鏡[38]；（c）快速線掃描雙光子顯微鏡[39]Fig. 4 Fast scanning two-photon imaging technology. (a) Light beads two-photon microscope[37]; (b) multi-focus fast scanning two-photon microscope[38]; (c) fast line scanning two-photon microscope[39]

另外一個(gè)發(fā)展方向是使雙光子二維成像的幀率高于1 kHz[38-42]。Mark J. Schnitzer研究組設(shè)計(jì)的平面多焦點(diǎn)雙光子顯微鏡，通過(guò)微透鏡陣列（20×20陣列）產(chǎn)生400焦點(diǎn)，進(jìn)行同時(shí)掃描（圖4（b），彩圖見(jiàn)期刊電子版），其通過(guò)將焦點(diǎn)陣列傾斜一個(gè)角度，結(jié)合一維振鏡掃描，同時(shí)形成400行掃描線，并用sCMOS相機(jī)進(jìn)行熒光探測(cè)。這個(gè)方法的成像通量可達(dá)兩億，最大幀率為1 kHz[38]。Karel Svoboda研究組利用線掃描加快掃描速度。該顯微鏡以4個(gè)不同的角度掃描二維樣本平面上的焦線（圖4（c），彩圖見(jiàn)期刊電子版），視野內(nèi)每個(gè)點(diǎn)在每次線掃描過(guò)程中均被探測(cè)到，每個(gè)點(diǎn)對(duì)應(yīng)一個(gè)時(shí)間位點(diǎn)，但同一個(gè)時(shí)間位點(diǎn)包含線內(nèi)多個(gè)空間點(diǎn)的熒光信息，在樣品熒光點(diǎn)稀疏程度較低時(shí)，通過(guò)壓縮感知算法可以實(shí)現(xiàn)熒光圖像的重建而且真實(shí)性較高。該方法的優(yōu)點(diǎn)是僅用4次行掃描就完成了二維圖像掃描，圖像幀率達(dá)到1 kHz，缺陷是當(dāng)視野內(nèi)的熒光物質(zhì)密集程度較高時(shí)，重建圖像的真實(shí)性將降低。該方法可以使成像通量達(dá)到十億[39]。此外，通過(guò)自由空間角啁啾增強(qiáng)延遲器件（Free-space Angular-Chirp-Enhanced Delay，F(xiàn)ACED）對(duì)小鼠視皮層進(jìn)行快速成像，圖像幀率最快可達(dá)3 kHz，成像通量可達(dá)6.25億[40-41]。另一種基于掃描焦點(diǎn)的光譜時(shí)間編碼是通過(guò)掃描源的主動(dòng)調(diào)制來(lái)產(chǎn)生頻譜編碼的皮秒脈沖序列，然后通過(guò)衍射光柵以線掃描方式依次照射到圖像平面上，形成焦點(diǎn)線性陣列，該方法成像通量可達(dá)0.88億，最快掃描幀率可達(dá)2 kHz[42]。

3.3 成像深度

Mark J Schnitzer課題組開(kāi)發(fā)出一種使用光學(xué)器件梯度折射透鏡（Gradient-index (GRIN) lens）配合雙光子掃描顯微鏡的裝置。該裝置理論上可以在任意深度對(duì)細(xì)胞進(jìn)行成像[43]。梯度折射率材料之前常用在自聚焦光纖當(dāng)中，對(duì)于實(shí)驗(yàn)中用的梯度折射率透鏡，從截面看，材料折射率隨著距圓心的距離增加而減少，其圓心位置的材料折射率最高。入射光在透鏡切線方向的分量隨著透鏡折射率的減少逐漸減小，直到達(dá)到全反射邊界條件后，光切線的方向?qū)l(fā)生變化，光線第一次到達(dá)軸線時(shí)，光線與軸線的夾角等于光線剛?cè)肷溥M(jìn)透鏡時(shí)與軸線的夾角，同理，當(dāng)光線第二次達(dá)到光軸時(shí)，此時(shí)光線的方向與入射時(shí)的方向相同，將其稱(chēng)為光線在透鏡中的空間頻率。由于透鏡很細(xì)，可以認(rèn)為滿足傍軸條件，因此所有的光線都會(huì)以該空間頻率在透鏡中傳播，在1/2周期整數(shù)倍時(shí)匯聚[44-45]。如圖5（a）（彩圖見(jiàn)期刊電子版）所示（參考Mark J Schnitzer課題組相關(guān)技術(shù)成果）[43]。該技術(shù)大量應(yīng)用于小鼠腦深處神經(jīng)信號(hào)的探測(cè)，Yeka Aponte課題組使用該技術(shù)對(duì)小鼠腦深5 mm處的外側(cè)下丘腦神經(jīng)元進(jìn)行16天的熒光成像（圖5（a））[44]。Jianan Y Qu課題組將該技術(shù)和自適應(yīng)光學(xué)相結(jié)合，用于觀測(cè)小鼠海馬神經(jīng)元可塑性[46]。

圖5 超深度探測(cè)顯微成像技術(shù)。（a）梯度折射率透鏡雙光子顯微鏡[44]；（b）三光子小鼠神經(jīng)元成像[49]；（c）三光子小鼠腦血管成像[51]Fig. 5 Ultra depth detection microscopic imaging. (a) Gradient refractive index lens two-photon microscope[44]; (b) threephoton neuron imaging in mice[49]; (c) three-photon cerebral vascular imaging in mice[51]

雙光子成像中，最大可實(shí)現(xiàn)的成像深度與散射平均自由程成正比，并與所用的激光功率、雙光子的脈沖時(shí)間、頻率的倒數(shù)以及收集效率的對(duì)數(shù)成正比[47]。目前在最理想情況下，雙光子的探測(cè)深度也只能達(dá)到1 mm, 再往下焦斑逐漸惡化[48]。而三光子熒光顯微鏡在對(duì)小鼠神經(jīng)元活體成像時(shí)，最深探測(cè)深度可以達(dá)到1.4 mm。三光子顯微鏡和雙光子顯微鏡類(lèi)似，都屬于非線性光學(xué)，激發(fā)過(guò)程中，熒光分子吸收3個(gè)光子，經(jīng)過(guò)兩個(gè)虛擬態(tài)分子由基態(tài)升至激發(fā)態(tài)。入射光的波前隨著組織深度的增加產(chǎn)生畸變，導(dǎo)致系統(tǒng)成像質(zhì)量下降，可通過(guò)自適應(yīng)光學(xué)對(duì)入射光進(jìn)行波前補(bǔ)償，使得系統(tǒng)在組織深處也可以得到良好的光學(xué)分辨率[49-50]。Robert Prevedel課題組利用三光子技術(shù)呈現(xiàn)了小鼠腦皮層下1.4 mm處的海馬樹(shù)突精細(xì)結(jié)構(gòu)和單個(gè)神經(jīng)元活動(dòng)情況（圖5（b），彩圖見(jiàn)期刊電子版）[49]。Wang Ke課題組利用三光子技術(shù)，將1 700 nm波長(zhǎng)的光作為激發(fā)光，獲得小鼠皮層下2.1 mm處血管的結(jié)構(gòu)圖像[51]（圖5（c），彩圖見(jiàn)期刊電子版）。

3.4 成像分辨率

大部分熒光顯微鏡的光學(xué)分辨率都在μm量級(jí)，這對(duì)于觀測(cè)人體細(xì)胞（10～20 μm）可以滿足需求，但是對(duì)于亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)，如中心體、高爾基體、線粒體、細(xì)胞骨架，細(xì)胞間的信號(hào)傳導(dǎo)等，還遠(yuǎn)遠(yuǎn)不夠。為了滿足生物醫(yī)學(xué)研究與發(fā)展的需求，超分辨率光學(xué)顯微鏡應(yīng)運(yùn)而生。超分辨率光學(xué)顯微鏡主要分為3類(lèi)：（1）單分子定位顯微鏡（Single-Molecule Localization Microscopy, SMLM）；（2）受激輻射耗盡熒光顯微鏡（Stimulated Emission Depletion, STED）；（3）結(jié)構(gòu)光照明顯微鏡（Structured Illumination Microscopy，SIM)[52-54]。目前未發(fā)現(xiàn)有關(guān)SMLM和雙光子技術(shù)結(jié)合的研究報(bào)道，而STED和SIM已被證明能與雙光子成像技術(shù)結(jié)合并提高其成像分辨率。

STED顯微鏡的原理，熒光分子在激光照射下將從基態(tài)變成激發(fā)態(tài)，經(jīng)過(guò)振動(dòng)弛豫，熒光分子躍遷至激發(fā)態(tài)的最低振動(dòng)能級(jí)，在無(wú)干擾情況下，處于激發(fā)態(tài)最低能級(jí)的熒光分子將通過(guò)發(fā)射熒光的方式退激發(fā)至基態(tài)。但熒光分子處于激發(fā)態(tài)，外界又給予激光照射時(shí)，則處于激發(fā)態(tài)的熒光分子會(huì)產(chǎn)生與外界激光相同頻率、偏振、相位的輻射[55]。因此可以將輻射光以光圈的形式對(duì)激發(fā)光光斑進(jìn)行照射，通過(guò)控制光圈內(nèi)環(huán)的大小調(diào)整熒光激發(fā)區(qū)域，該技術(shù)實(shí)現(xiàn)了5.8 nm的分辨率[56]。

STED技術(shù)可以配合雙光子顯微鏡使用，在進(jìn)行深度探測(cè)的同時(shí)也保證了極佳的分辨率[57-59]。對(duì)于大多數(shù)STED-雙光子顯微鏡來(lái)說(shuō)，將同時(shí)應(yīng)用兩束不同波長(zhǎng)的光，光路設(shè)計(jì)需要考慮光束畸變的問(wèn)題[59]。最近，Alberto Diaspro課題組開(kāi)發(fā)了一種單一光源的STED-雙光子顯微鏡。原理如圖6（a）所示。其選用特殊染料使耗盡光和激發(fā)光為同一波段的光。該技術(shù)可以實(shí)現(xiàn)80 nm的分辨率，遠(yuǎn)優(yōu)于普通雙光子顯微鏡的分辨率（0.5～1 μm量級(jí)）[57-58]。

SIM成像技術(shù)是一種改變照明光空間結(jié)構(gòu)的照明方式，其將樣品中不可見(jiàn)的高頻信息攜帶到顯微鏡的可見(jiàn)低通頻帶；通過(guò)改變圖案方向和相位，記錄熒光結(jié)果并得到多個(gè)圖像數(shù)據(jù)集，再對(duì)數(shù)據(jù)集進(jìn)行空間域和頻域的傅立葉變化，提取攜帶的高頻信息并重建出超分辨率圖像。該技術(shù)原理如圖6（b）所示[54]。

SIM結(jié)合雙光子技術(shù)，使用電光調(diào)制器改變?nèi)肷浣Y(jié)構(gòu)光的相位和角度，利用雙軸振鏡對(duì)樣品進(jìn)行逐點(diǎn)掃描。Qionghai Dai課題組采用對(duì)每個(gè)像素點(diǎn)取3個(gè)入射方向的結(jié)構(gòu)光對(duì)樣品進(jìn)行照射（相鄰方向角度差值為120°），每個(gè)方向的結(jié)構(gòu)光中又包含3個(gè)等間距的相位角（相鄰相位角差值為120°），每個(gè)像素點(diǎn)需要拍攝9張圖，該方法所得重建結(jié)果，橫向分辨率可達(dá)141 nm[60]。還有一種方法使用聲光調(diào)制器形成5個(gè)相位角（相鄰相位角差值為72°），再通過(guò)衍射光柵產(chǎn)生結(jié)構(gòu)光，結(jié)構(gòu)光的入射方向保持固定。該裝置主要對(duì)樣品進(jìn)行線掃描，對(duì)小鼠神經(jīng)元成像結(jié)果如圖6（b）所示，其橫向分辨率可達(dá)208 nm[61]。該技術(shù)除了具有優(yōu)異的成像分辨率外，相對(duì)于STED，其成像速度快，使用低強(qiáng)度光源就可以產(chǎn)生足夠的熒光信號(hào)，減少了光漂白的可能性[60]。SIM也可配合自適應(yīng)光學(xué)方法使用。該設(shè)備對(duì)果蠅大腦和斑馬魚(yú)胚胎探測(cè)的橫向分辨率可達(dá)170 nm左右[62]。

圖6 超分辨率雙光子顯微鏡。（a）STEM成像原理和實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)[58]；（b）SIM結(jié)構(gòu)光生成方法和結(jié)構(gòu)光與均勻光照射探測(cè)精度對(duì)比[60]Fig. 6 Super-resolution two-photon microscope. (a) STEM imaging principles and experimental data[58]; (b) SIM structured light generation method and comparison of structured light and uniform light irradiation detection accuracy[60]

以上技術(shù)主要針對(duì)雙光子熒光顯微鏡橫向分辨率的提升，也有課題組通過(guò)液體透鏡配合自適應(yīng)光學(xué)以及使用空間調(diào)制器來(lái)改善雙光子熒光顯微鏡的軸向分辨率，他們可以將軸向分辨率提升至普通雙光子顯微鏡軸向分辨的3倍[63-64]。

3.5 設(shè)備微型化

使用雙光子顯微成像設(shè)備探測(cè)動(dòng)物的神經(jīng)生理活動(dòng)狀態(tài)時(shí)，通常需要對(duì)小鼠頭部進(jìn)行固定。但一些科學(xué)問(wèn)題，例如對(duì)空間導(dǎo)航和記憶的研究，不應(yīng)束縛實(shí)驗(yàn)動(dòng)物行為，才能得到更切合實(shí)際生理?xiàng)l件的結(jié)果。為了使實(shí)驗(yàn)結(jié)果更接近自然行為狀態(tài)，科學(xué)家們研制了頭戴式微型雙光子顯微鏡[65-68]。程和平團(tuán)隊(duì)研制的微型化雙光子顯微鏡探頭質(zhì)量只有2～3 g，和實(shí)驗(yàn)小鼠頭部固連在一起，可以長(zhǎng)時(shí)間記錄小鼠在劇烈運(yùn)動(dòng)下的神經(jīng)元活動(dòng)（圖7）[65]。該設(shè)備通過(guò)光纖傳導(dǎo)激發(fā)光和熒光，結(jié)合微型化振鏡（MEMS），電潤(rùn)濕可調(diào)透鏡以及微型物鏡等器件將雙光子成像設(shè)備進(jìn)行了微型化改造。Emily A Gibson使用微型化頭戴式雙光子顯微鏡對(duì)小鼠腦血管進(jìn)行連續(xù)17天的觀測(cè)[66]。最近，諾貝爾獎(jiǎng)獲得者Edvard I Moser團(tuán)隊(duì)在此基礎(chǔ)上改進(jìn)了微型光學(xué)系統(tǒng)和微型變焦透鏡，開(kāi)發(fā)了不足3 g的微型化雙光子MINI2P系統(tǒng)，可以對(duì)自由小鼠多平面實(shí)現(xiàn)1 000個(gè)神經(jīng)元鈣成像，成功揭示了不同腦區(qū)細(xì)胞的空間聯(lián)系[68]。

圖7 超分辨率雙光子顯微鏡實(shí)驗(yàn)結(jié)果[65-66]Fig. 7 Experimental results of super-resolution two-photon microscope[65-66]

4 跨尺度雙光子在體顯微成像技術(shù)的難點(diǎn)及未來(lái)挑戰(zhàn)

綜上所述，近年來(lái)雙光子顯微鏡在多個(gè)維度上均獲得了快速的發(fā)展，表1是本文介紹的新型雙光子在體顯微成像技術(shù)的一個(gè)簡(jiǎn)單匯總。在成像視野方面，通過(guò)改善單光軸大視野介觀物鏡或多光軸二級(jí)成像物鏡結(jié)構(gòu)，雙光子成像視野直徑由～1 mm提升至～10 mm，實(shí)現(xiàn)了一個(gè)量級(jí)的提升；成像通量方面通過(guò)多焦點(diǎn)或線焦斑掃描，實(shí)現(xiàn)了近兩個(gè)量級(jí)的提升，達(dá)到數(shù)億像素每秒，局部圖像幀率提高到1～3 kHz；通過(guò)三光子或自適應(yīng)光學(xué)方法，成像深度提升程度超過(guò)100%，采用侵入式的梯度折射率透鏡可以將成像深度提高數(shù)倍，但對(duì)腦組織有一定損傷；通過(guò)結(jié)合STED技術(shù)，雙光子成像極限分辨率達(dá)到了80 nm；微型化雙光子顯微鏡的重量?jī)H數(shù)克，遠(yuǎn)小于常規(guī)雙光子顯微鏡數(shù)十公斤的重量，能被小鼠頭部攜帶并在數(shù)米范圍自由活動(dòng)并同時(shí)成像。顯然，相比初代雙光子顯微鏡，當(dāng)前雙光子在體顯微成像技術(shù)已獲得了跨尺度的發(fā)展。

表1 雙光子顯微鏡在多個(gè)尺度方向的性能提升進(jìn)展現(xiàn)狀Tab. 1 Progress in performance improvement of two-photon microscopy in multiple scale directions

但是需要看到的共性問(wèn)題是，上述多光子顯微成像技術(shù)都是僅在1～2個(gè)維度實(shí)現(xiàn)了跨尺度跨量級(jí)的技術(shù)指標(biāo)突破，這可能與技術(shù)的應(yīng)用場(chǎng)景需求有關(guān)，通常是集中針對(duì)某一、兩個(gè)關(guān)鍵點(diǎn)進(jìn)行巧妙設(shè)計(jì)或參數(shù)平衡，但目前還未能在多個(gè)尺度同時(shí)實(shí)現(xiàn)跨量級(jí)提高。

譬如使用梯度折射率透鏡雖然能提高成像深度，但一方面是有損植入，另一方面自身視野有限，采用多個(gè)分離元件組合的方式也難以實(shí)現(xiàn)成大視野面積連續(xù)覆蓋的成像[25,44]。而三光子技術(shù)無(wú)需破損皮層就能對(duì)超過(guò)1 mm深度的區(qū)域進(jìn)行成像，三光子激發(fā)對(duì)單脈沖能量的要求比雙光子激發(fā)要高，往往采用低重復(fù)頻率高脈沖能量的飛秒激光器。低重復(fù)頻率通常會(huì)限制成像通量，不過(guò)與時(shí)分復(fù)用多焦點(diǎn)技術(shù)對(duì)重復(fù)頻率的需求一致，兩種技術(shù)有結(jié)合的可能性，但如果焦點(diǎn)數(shù)量很多，則分到每個(gè)焦點(diǎn)的單脈沖能量仍然有限，簡(jiǎn)單增加激光器功率又容易對(duì)生物組織產(chǎn)生較大的熱損傷，因此需要合理選取焦點(diǎn)數(shù)量[48-51]。

在提高通量方面，線掃描結(jié)合壓縮傳感進(jìn)行圖像重建要求樣品滿足一定稀疏性，故對(duì)其應(yīng)用場(chǎng)景有所限制[39]。采用多焦點(diǎn)同時(shí)掃描是目前最佳的方案，其在焦點(diǎn)熒光信號(hào)區(qū)分方面，一方面可以與時(shí)分復(fù)用技術(shù)結(jié)合，但提高倍數(shù)有限，最終受熒光探針探測(cè)壽命限制；另一方面可以使用CMOS等面陣探測(cè)器，但隨著成像深度的增加，散射程度提高，面陣探測(cè)器成像分辨率將急劇下降。前述提到的高通量雙光子成像方法，在小視野范圍內(nèi)的生物應(yīng)用中已經(jīng)取得了不錯(cuò)的成果，典型應(yīng)用場(chǎng)景是記錄單神經(jīng)元樹(shù)突網(wǎng)絡(luò)的動(dòng)作電位活動(dòng)圖譜，結(jié)合目前最新發(fā)展電壓敏感探針或谷氨酸熒光探針，能以1 kHz成像幀率捕捉細(xì)小的樹(shù)突棘上快速的動(dòng)作電位信號(hào)[38]。在大規(guī)模神經(jīng)元群落成像方面，目前一些高通量體積成像方法，如“光珠”軸向多焦點(diǎn)、貝塞爾軸向焦深擴(kuò)展等，已經(jīng)與大視野介觀物鏡技術(shù)相結(jié)合，并取得了一定成果，但其在進(jìn)行全視野體成像的時(shí)候，為了達(dá)到鈣成像的速度門(mén)檻，還是通過(guò)降低橫向空間采樣率（5 μm）的方式進(jìn)行掃描成像，采樣率雖勉強(qiáng)達(dá)到細(xì)胞直徑（～10 μm）的奈奎斯特采樣要求，但其較粗的空間采樣率使神經(jīng)元結(jié)構(gòu)和功能解析精度降低了不少[37]。

微型化雙光子顯微鏡的重量和體積大幅減小，但由于使用了MEMS掃描鏡、微型物鏡等小型光學(xué)器件，元件口徑限制了成像視野直徑，目前局限在1 mm以內(nèi)（通常僅數(shù)百微米），如需在多個(gè)腦區(qū)域同時(shí)成像，勢(shì)必需要使實(shí)驗(yàn)動(dòng)物頭戴多個(gè)微型化雙光子成像探頭，這又會(huì)增加動(dòng)物的負(fù)重，更適合應(yīng)用于體型較大的動(dòng)物。除了成像視野，應(yīng)用這些微型光學(xué)器件進(jìn)一步提高成像速度和通量也極為困難，結(jié)合微型電潤(rùn)濕可調(diào)透鏡進(jìn)行軸向掃描或體成像擴(kuò)展是不錯(cuò)的選擇[65-68]。

結(jié)合STED技術(shù)雖然可以大幅提高雙光子成像分辨率，但大視野范圍內(nèi)保持耗盡圓環(huán)光斑與激發(fā)圓斑對(duì)齊比較困難，因此目前未見(jiàn)該超分辨方法與大視野介觀雙光子成像相結(jié)合的研究。雙光子技術(shù)與SIM結(jié)合可以將分辨率提高近1倍，但SIM技術(shù)需要對(duì)多幅經(jīng)調(diào)制的圖像進(jìn)行算法解調(diào)，重建所需的圖像數(shù)量很大，進(jìn)一步降低了雙光子的成像速度[57-62]。

綜上所述，跨尺度雙光子在體顯微成像技術(shù)仍有許多難點(diǎn)需要攻克，仍有待進(jìn)一步發(fā)展。而腦神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)研究對(duì)于跨尺度在體成像的需求在很長(zhǎng)一段時(shí)間內(nèi)仍將為雙光子成像技術(shù)發(fā)展提供強(qiáng)大動(dòng)力。當(dāng)前很多基于單光子激發(fā)熒光的成像技術(shù)，如光場(chǎng)顯微鏡，得益于單光子高的熒光激發(fā)效率，在實(shí)現(xiàn)高通量大視野體積成像方面有很大優(yōu)勢(shì)，但組織散射背景干擾等因素仍是其難以克服的障礙，這限制了其對(duì)神經(jīng)結(jié)構(gòu)功能信息的解析精度[69-70]。而多光子成像技術(shù)在散射組織內(nèi)具有高保真的成像能力，獲得的神經(jīng)結(jié)構(gòu)功能信息更接近真實(shí)情況，成像深度更是有3倍以上的優(yōu)勢(shì)，但非線性激發(fā)的特性對(duì)其通量提高有所限制，也是妨礙其真正實(shí)現(xiàn)跨尺度成像的核心因素。

實(shí)現(xiàn)大腦在體大視野高分辨率高通量成像，獲得大規(guī)模神經(jīng)元網(wǎng)絡(luò)的結(jié)構(gòu)連接與功能活動(dòng)圖譜，是解決神經(jīng)環(huán)路工作機(jī)理的重要一步，目前腦科學(xué)領(lǐng)域已達(dá)成共識(shí)，這離不開(kāi)跨尺度雙光子在體顯微成像技術(shù)的下一步發(fā)展。筆者認(rèn)為，實(shí)現(xiàn)該宏偉目標(biāo)首先需要大視野高分辨介觀物鏡的發(fā)展，這是實(shí)現(xiàn)大視野高分辨腦皮層連續(xù)覆蓋成像的核心器件，但分辨率與視野之間存在天然的制約關(guān)系，這對(duì)光學(xué)設(shè)計(jì)與制造技術(shù)是一個(gè)挑戰(zhàn)，而且進(jìn)一步擴(kuò)展視野直徑后還需要考慮適配動(dòng)物腦輪廓形狀，這需要打破傳統(tǒng)的平場(chǎng)顯微光學(xué)設(shè)計(jì)范式[32-33]。其次，可結(jié)合三光子技術(shù)和自適應(yīng)光學(xué)方法擴(kuò)展成像深度，但三光子激發(fā)需要高單脈沖能量，采用低重復(fù)頻率高脈沖能量飛秒激光器往往會(huì)導(dǎo)致成像通量有所降低[49]。結(jié)合SIM或STED技術(shù)提高空間分辨率也會(huì)降低成像通量，一方面空間分辨率的提高需要更高的空間采樣率，即更多的采樣點(diǎn)數(shù)；另一方面如結(jié)合SIM技術(shù)需要對(duì)多幅圖像進(jìn)行重建，這會(huì)降低有效幀率[59,61]。因此，需要研究提高成像通量的新技術(shù)，至少要實(shí)現(xiàn)10 Hz附近鈣離子成像所需的幀率，在各方面指標(biāo)同時(shí)提高的情況下，成像通量需要至少提升2～3個(gè)量級(jí)才能保證實(shí)時(shí)成像。相比線掃描，采用多焦點(diǎn)技術(shù)有利于保持層析效果、信息串?dāng)_更少，有利于保證神經(jīng)結(jié)構(gòu)功能信息的解析精度和保真度[37-38]。最近的研究中使用時(shí)分復(fù)用技術(shù)或其改進(jìn)技術(shù)以降低焦點(diǎn)間的串?dāng)_，有效提高成像通量。但時(shí)分復(fù)用技術(shù)的采樣通量受限于熒光探針的熒光壽命，一般為～3 ns，因此僅結(jié)合時(shí)分復(fù)用技術(shù)，成像通量的提升上限為2×108～3×108pixel/s，這依然不能滿足cm級(jí)大視野和高分辨成像需求。如果需要采用軸向的多個(gè)焦點(diǎn)實(shí)現(xiàn)體積成像，如“光珠”技術(shù)，則對(duì)成像通量的需求更高[28,39]。多焦點(diǎn)技術(shù)，在結(jié)合時(shí)分復(fù)用技術(shù)的同時(shí)，可進(jìn)一步考慮結(jié)合在空間上有多個(gè)陣元的陣列探測(cè)器，在空間上進(jìn)一步對(duì)各焦點(diǎn)產(chǎn)生的熒光進(jìn)行區(qū)分，在時(shí)空兩維同時(shí)進(jìn)行焦點(diǎn)區(qū)分。這樣一方面可以進(jìn)一步降低串?dāng)_，另一方面將使可容納的焦點(diǎn)數(shù)量大幅提高，有望實(shí)現(xiàn)2～3個(gè)量級(jí)的提高。熱效應(yīng)也是需要考慮的因素，大規(guī)模飛秒焦點(diǎn)并行掃描會(huì)產(chǎn)生更多熱效應(yīng)。為了避免動(dòng)物腦組織產(chǎn)生嚴(yán)重?zé)釗p傷，一方面可結(jié)合外部主動(dòng)散熱技術(shù)，另一方面需要研制更高效的熒光探針，用更少的激光能量得到更多的熒光光子。具有更低熒光壽命以及更長(zhǎng)發(fā)射光譜的熒光探針有利于通量和成像深度的提高?？梢云诖?，這些方面都在跨尺度雙光子在體顯微成像技術(shù)的下一步發(fā)展中得到實(shí)現(xiàn)。

5 結(jié)束語(yǔ)

自雙光子顯微鏡誕生以來(lái)，在體腦成像研究的需求促使雙光子顯微鏡在成像視野、成像通量、成像深度、分辨率、微型化等多個(gè)維度上性能指標(biāo)有所提升。本文在介紹雙光子顯微鏡工作原理的基礎(chǔ)上，對(duì)近年來(lái)雙光子顯微鏡在這些方面的快速發(fā)展情況進(jìn)行了詳細(xì)綜述?？偟膩?lái)說(shuō)，目前雙光子顯微鏡在各個(gè)維度上均分別有了跨量級(jí)的發(fā)展，但仍未實(shí)現(xiàn)多個(gè)維度同時(shí)跨量級(jí)突破。量變產(chǎn)生質(zhì)變，相信在不久的將來(lái)，將出現(xiàn)真正意義的在體跨尺度雙光子顯微成像技術(shù)，并在突破解析大腦“黑盒子”內(nèi)部工作原理的過(guò)程中起到關(guān)鍵作用。