漂洗降低白及militarine含量的響應面法研究

陳默然， 于華忠， 劉磊磊， 唐克華

(吉首大學 林產化工工程湖南省重點實驗室，湖南 張家界 427000)

白及為蘭科白及屬多年生草本植物，在我國分布廣泛[1]。白及藥材為白及的干燥塊莖，有清熱利濕、消腫生肌、收斂止血的功效，臨床療效顯著[1-2]。迄今為止，在白及中已發(fā)現超過190余種化合物[3]，包括多糖、三萜類、類固醇、蘋果酸衍生物等[4-6]。但在2005～2006年注冊的保健食品中，白及原料的使用頻次極低(僅1～4次)且未見相關產品[7]；在2013～2015年批準的3 073個保健食品中，依舊未見以白及為原料的產品[8]。白及經水提醇沉之后的上清液，再經過乙酸乙酯萃取后的水層是苦味集中部位，從中鑒別確認的苦味成分主要是1，4-二[4-(葡萄糖氧)芐基]-2-異丁基蘋果酸酯(militarine)[9]。植物中的苦味物質主要包括多酚類、生物堿類、氨基酸及多肽類、皂苷類，以及無機鹽類[10]。白及的苦味來源除了militarine之外，可能還有其它的苦味物質，但尚未發(fā)現相關的研究報道。militarine是蘋果酸衍生物，主要發(fā)現于蘭科白及屬(Bletilla)、杜鵑蘭屬(Cremastra)和紅門蘭屬(Orchis)植物中[11]，在白及塊莖中的含量較高[3]，并已作為白及藥材品質鑒別的指標成分[12]。作為糖苷的一種，militarine可溶于水、乙醇，難溶于極性小的有機溶劑[13]。劉娜等[14]對24批次白及飲片運用UPLC法測定，發(fā)現militarine質量分數在18.98～44.87 mg/g；唐修靜等[15]研究發(fā)現，不同炮制方法對白及藥材中militarine含量和浸出物含量有一定的影響。militarine是已探明的白及苦味成分，極性強且溶于水、醇。為建立簡便、有效降低白及原料苦味的初加工方法，遂開展熱水漂洗法降低militarine含量的研究，探討漂洗溫度、漂洗次數、漂洗時間、pH值等因素對該苦味成分的具體影響與響應面法優(yōu)化的效果，以期為提高白及的感官評價和白及保健產品的開發(fā)應用提供理論依據。

1 實 驗

1.1 原料、試劑與儀器

白及(Bletillastriata(Thunb. ex A. Murray)Rchb. f.)，張家界圣君中藥材有限公司馴化栽培6年。采集2021年3～6月期間的單窩塊莖，將表面附著的泥土充分洗凈，再剪除須根，沖洗之后自然晾干，用手動切片器，沿著塊莖的長軸方向切制，每片厚度控制在2～3 mm。將切片均勻分組，供試。

militarine標準品(純度98.7%)，上海同田生物科技有限公司；乙腈、甲醇為色譜純；無水乙醇、NaOH、HCl等試劑為分析純；水為實驗室自制超純水。DBS-139手動切片器；SHZ-D(Ⅲ)循環(huán)水多用真空泵；GZX-9146 MBE數顯鼓風干燥箱；HH-S4電熱恒溫水浴鍋；RS-FS150榮事達小型磨粉機；XO-3200DT數控超聲波清洗機，南京先歐儀器制造有限公司；Agilent 1260高效液相色譜儀，美國安捷倫公司；FE20實驗室pH計，梅特勒-托利多儀器(上海) 有限公司。

1.2 HPLC法測定militarine方法的建立

1.2.1對照品溶液和供試品溶液的配制 參考文獻[16]配制對照品和供試品溶液。取militarine對照品適量，干燥至質量恒定，精密稱定，容量瓶定容，加50%乙醇溶解，搖勻，制成質量濃度為1.3 g/L的對照品溶液。

取干燥好的白及片，磨粉并過3號篩(粒徑≤0.48 mm)，精密稱取粉末0.200 0 g，置于錐形瓶中，精密加入50%乙醇25 mL，稱定質量；超聲波處理 30 min，冷卻至室溫，用50%乙醇補足質量，搖勻，過濾，取上清液，得供試品溶液。

1.2.2色譜條件 采用Kromasil C18色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)，以乙腈/0.1%的磷酸水(體積比為22 ∶78)為流動相，流速1 mL/min，檢測波長223 nm，色譜柱溫30 ℃，進樣量20 μL。

1.2.3標準曲線的繪制 精密吸取militarine對照品溶液0.2、 0.4、 0.8、 1.0、 1.2和2.0 mL，置于10 mL 容量瓶中，用50%乙醇稀釋至刻度，分別精密吸取上述稀釋后的對照品溶液各20 μL，按照1.2.2節(jié)色譜條件進行檢測，以峰面積為縱坐標(Y)，militarine質量濃度為橫坐標(X)，繪制標準曲線。

1.2.4精密度實驗 精密吸取標準品稀釋溶液，連續(xù)進樣5 次，每次20 μL，測定militarine的峰面積，計算相對標準偏差(RSD)。

1.2.5重復性實驗 取樣品5份，按1.2.2節(jié)色譜條件，測定militarine的峰面積，計算RSD。

1.2.6穩(wěn)定性實驗 取一份樣品，按1.2.2節(jié)色譜條件，分別于0、 2、 4、 8、 12、 24 h 進樣20 μL，測定militarine的峰面積，計算RSD。

1.2.7加標回收率 精密稱取已知含量的白及粉末3份，加入各對照品適量，按1.2.2節(jié)色譜條件，測定militarine的峰面積，計算回收率。

1.3 熱水漂洗降低白及中的militarine

1.3.1白及切片漂洗處理 對均勻分組的切片按組逐一稱質量，放入溫度參數預調的多孔水浴鍋進行漂洗，用鹽酸和NaOH溶液調節(jié)漂洗液pH值。漂洗過程中定時翻動切片，處理達到設定時間，用具孔不銹鋼勺撈出各組白及切片并瀝干水，再置于60 ℃的烘箱中干燥2～3天，即得干燥白及切片。

1.3.2單因素試驗 選擇漂洗溫度、漂洗時間和漂洗液pH值這3個因素，分別考察了不同因素對熱水漂洗處理的白及鮮莖切片中militarine含量的影響。設置的單因素分別為：漂洗溫度(60、 70、 80、 90和100 ℃)，漂洗時間(10、 20、 30、 40和50 min)，漂洗液pH值(3.5、 5.0、 6.5、 8.0和9.5)，在保證白及切片完全浸沒于漂洗液的前提下，從減少用水量、降低能耗等方面綜合考慮，切片與漂洗液的比例統(tǒng)一設置為1 ∶5(g ∶mL)。

1.3.3響應面優(yōu)化 通過對單因素的系統(tǒng)考察，以漂洗溫度(X1)、漂洗時間(X2)和漂洗液pH值(X3)為自變量，以白及militarine下降比例(Y)為響應值，運用Box-Behnken法[17]對工藝條件進行優(yōu)化。

1.3.4militarine含量的測定方法 取干燥至質量恒定的白及切片，磨粉過篩，提取[16]多次并定容至25 mL，測定各組白及的militarine含量。每個處理組均留出不處理的白及樣片，采取類似方法提取，再測定其militarine含量。熱水漂洗處理前的白及鮮莖切片militarine質量分數(ω1)及漂洗后的militarine質量分數(ω2)，均換算為下降比例(Y)以供分析，計算公式為：Y=(ω1-ω2)/ω1×100%。

1.4 漂洗次數對白及militarine含量的影響

在最佳漂洗降苦味參數組合下，研究漂洗1～3次對白及中militarine含量的影響。每組均留出未經處理的白及鮮莖切片為空白對照，將實驗組與空白組樣本的militarine含量下降比例作為分析依據。

2 結果與分析

2.1 HPLC法測定militarine的方法學驗證

militarine質量濃度(X)與峰面積(Y)的回歸方程為：Y=22 482X-11.903(R2=0.999 9)，表明militarine質量濃度與峰面積在25.662～256.62 mg/L范圍有良好的線性關系。精密度試驗的RSD為1.4%，表明儀器精密度良好；重復性試驗的RSD為2.5%，表明本方法重復性良好；穩(wěn)定性試驗的RSD為0.29%，表明供試品溶液在24 h 內穩(wěn)定。加標回收率平均值為101.08%，RSD為1.04%，反映HPLC法能有效提取檢測樣品中的militarine。

2.2 單因素試驗結果分析

2.2.1漂洗溫度的影響 固定熱水漂洗時間50 min、pH值6.5，研究漂洗溫度對白及中militarine質量分數的影響，結果見圖1(a)。由圖可知，在60～100 ℃范圍內，militarine質量分數的下降比例隨溫度升高而增大，100 ℃下漂洗的白及militarine質量分數為18.16 mg/g，相比未處理樣(43.77 mg/g)質量分數已下降58.51%。熱水漂洗溫度最高只可設定為100 ℃，故漂洗處理的溫度宜在80～100 ℃范圍內選擇。

圖1 漂洗溫度(a)、漂洗時間(b) 和漂洗液pH值(c)對白及militarine質量分數的影響Fig.1 Effect of rinsing temperature(a), rinsing time(b) and rinsing solution pH value(c) on the B. striata militarine mass fraction

2.2.2漂洗時間的影響 固定熱水漂洗溫度90 ℃、pH值6.5，研究漂洗時間對白及中militarine質量分數的影響，結果見圖1(b)。由圖1(b)可知，20 min的漂洗處理即可使militarine質量分數快速下降；隨著處理時間的延長，militarine質量分數的下降比例呈緩慢遞增變化，在處理50 min時白及militarine質量分數為18.16 mg/g，相比未處理樣(43.11 mg/g)質量分數已下降59.60%。從能源消耗成本與提高生產時效的實踐要求來看，50 min的熱水漂洗處理時間已夠長，且能達到較理想的苦味成分降低結果，繼續(xù)延長熱水漂洗處理時間對苦味物質militarine質量分數降低的實際意義不大。

2.2.3漂洗液pH值的影響 固定熱水漂洗時間50 min、漂洗溫度90 ℃，研究pH值對militarine質量分數的影響，結果見圖1(c)。由圖可知，pH值在3.5～9.5范圍內，相比未處理樣(50.40 mg/g)militarine質量分數的下降比例在51.59%～58.37%之間，表明在熱水漂洗中pH值對militarine的溶出影響較小。漂洗液pH值為6.5時，militarine的下降比例最小，為51.59%，此時militarine質量分數為19.80 mg/g，在偏弱堿性的水中militarine的下降比例有遞增趨勢。綜合考慮漂洗液pH值宜在6.5～9.5范圍內選擇。

2.3 響應面試驗優(yōu)化工藝條件

2.3.1響應面試驗設計及結果 鑒于在偏弱堿性的水中militarine的下降比例有遞增趨勢，遂重點考察弱堿性、近中性的pH值環(huán)境因子組合影響。從生產實踐應用的時間投入、能耗等經濟成本降低需要考慮，選擇各單因素中值水平為：漂洗溫度90 ℃、漂洗時間40 min、漂洗液pH值8，試驗因素及水平見表1。

表1 響應面法試驗設計及結果Table 1 Experimental design and results of response surface methodology

以白及鮮莖切片的militarine質量分數下降比例為響應值，運用Box-Behnken試驗方法，進行漂洗溫度(X1)、漂洗時間(X2)和漂洗液pH值(X3)的3因素3水平響應面試驗，各試驗因素組合及測定結果見表1。對表1試驗結果進行回歸擬合，得到二次回歸方程:

表2 回歸模型的方差分析Table 2 Variance analysis of the models

2.3.2驗證實驗 為檢測響應曲面法所得因素組合結果預測的可靠性，進行驗證實驗。根據軟件分析得到的最優(yōu)工藝組合條件，考慮實踐操作時的便利，將漂洗溫度調整為95 ℃，然后進行5 次平行實驗，militarine質量分數下降比例的平均值為63.55%，與模型方程的理論預測值僅相差1.97%。

擬合方程模型預測值及響應面試驗個別組數值都存在優(yōu)于驗證實驗組數值的情況，推測原因有3方面：1) 單因素試驗中，溫度、時間的中值選擇并不是拐點，更多的是考慮到實踐應用時的需要，對響應面優(yōu)化結果可能造成一定影響；2) 由于白及含有豐富的多糖，切片內的多糖在高溫下容易滲出并成膜，導致militarine溶出的傳質通道受阻，只進行單次漂洗可能造成實驗結果誤差；3) 每窩白及的切片分組可能不是十分均勻，且受白及塊莖的不規(guī)則形狀及militarine可能在塊莖中存在部位分布差異的影響，也可造成實驗誤差。

2.4 漂洗次數對白及militarine質量分數的影響

兩次漂洗后的白及militarine質量分數下降比例由61.94%提升到76.02%，第3次漂洗后則提升到83.10%。在漂洗過程中，由于白及切片中的多糖或其它可溶浸出物的溶出，容易在切片表面成膜，增加漂洗次數的過程相當于不斷破壞切片表面的膜，有助于militarine更充分的溶出。顯然，漂洗次數繼續(xù)增加，militarine質量分數下降比例還有可能繼續(xù)提升。由于每次漂洗時間接近1 h，漂洗次數增加導致的加工綜合成本也將成倍增加，故建議漂洗次數最多不超過3次。

3 結 論

3.1采用響應面法研究了熱水漂洗法的漂洗溫度、漂洗時間及漂洗液pH值對白及鮮莖切片的militarine質量分數下降比例的影響，得到的最佳因素組合為：漂洗溫度95.02 ℃、漂洗時間50 min、pH值6.5。最優(yōu)條件下簡化溫度為95 ℃，并進行5次平行實驗，militarine質量分數下降比例平均值為63.55%。

3.2熱水漂洗次數對白及鮮莖切片的militarine質量分數降低有顯著影響。3次漂洗后，militarine質量分數下降比例達到83.10%，故建議漂洗次數最多不超過3次。熱水漂洗法降低白及militarine質量分數，操作條件要求簡單，能顯著降低白及中已明確的苦味成分，滿足苦味降低的白及保健食品原料加工要求。