綿羊Y染色體特異性引物及SNPs的篩選

曹學濤，裴生偉，張晉，李發(fā)弟,2，李剛，李萬宏，樂祥鵬

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綿羊Y染色體特異性引物及SNPs的篩選

曹學濤1，裴生偉1，張晉3，李發(fā)弟1,2，李剛3，李萬宏1，樂祥鵬1

（1蘭州大學草地農業(yè)生態(tài)系統(tǒng)國家重點實驗室/蘭州大學農業(yè)農村部草牧業(yè)創(chuàng)新重點實驗室/蘭州大學草地農業(yè)科技學院，蘭州 730020；2甘肅省肉羊繁育生物技術工程實驗室，甘肅民勤 733300；3甘肅省家畜繁殖中心，甘肅武威 733000）

【目的】哺乳動物Y染色體雄性特異區(qū)在減數分裂過程中不與X染色體發(fā)生重組，遵循嚴格的父系遺傳，是研究父系遺傳多樣性的重要遺傳資源；此外絕大多數Y染色體基因主要或者特異性的在睪丸組織中表達，并在精子發(fā)生和雄性繁殖力方面扮演著至關重要的作用。由于Y染色體測序極其困難，造成很多物種Y染色體序列很少。因此本文基于目前現有?？苿游颵染色體引物信息，旨在鑒定綿羊Y染色體特異性引物，比較綿羊Y染色體基因片段與巖羊、牛、山羊和牦牛Y染色體的差異，同時篩選不同綿羊品種在Y染色體基因片段內的SNPs，將找到的Y-SNPs和綿羊的睪丸大小進行相關性分析，為鑒定綿羊Y染色體基因片段奠定基礎，并為今后綿羊Y染色體單倍型的構建、綿羊胚胎性別早期鑒定和公綿羊繁殖力相關分子標記的篩選提供科學依據?！痉椒ā扛鶕壳拔墨I公布的29對牛科動物Y染色體特異性引物序列，以母綿羊和水分別作陰性和空白對照，以公綿羊DNA為模板驗證引物的雄性特異性；確定綿羊Y染色體特異引物后，利用DNA混合池測序結合限制性長度片段多態(tài)性等技術在薩?？搜颍╪=146）、白薩福克羊（n=91）、東弗里升羊（n=6）、特克塞爾羊（n=72）、南非肉用美利奴羊（n=17）、杜泊羊（n=32）、湖羊（n=55）、藏羊（n=34）、灘羊（n=43）和巖羊（n=14）公羊群體中進行Y-SNPs掃描。用Chromas和DNASTAR等軟件分析混合池測序的結果，利用DNAman軟件將綿羊Y染色體基因片段與牦牛、山羊、黃牛和巖羊進行同源性分析。同時，測量薩?？搜颉姿_?？搜颉|弗里升羊、特克塞爾羊、南非肉用美利奴羊、杜泊羊周歲的陰囊圍，利用SPSS 19.0軟件分析SNPs位點與公羊陰囊圍的相關性?！窘Y果】在分析的29對引物中，6對引物為綿羊Y染色體特異性引物，分別能擴增出3、6、、、11和6片段。17對引物未能出現擴增條帶，6對引物在母羊DNA中出現擴增條帶。通過比對發(fā)現綿羊6個基因片段與巖羊、牛、山羊、牦牛的同源性在81.51%—98.84%。此外，首次在薩?？撕桶姿_福克羊群體的11片段中鑒定得到一個G＞A的突變，通過I酶切分析發(fā)現在薩?？搜?、白薩?？搜蛑杏?種基因型（AA、GG），在其他7個綿羊品種中只有GG基因型。在白薩?？搜蛉后w中，GG基因型的頻率為0.747，AA基因型的頻率為0.253；在薩?？搜蛉后w中GG基因型的頻率為0.986，AA基因型的頻率為0.014；說明在薩?？搜蚝桶姿_?？搜蛉后w中，GG基因型為優(yōu)勢基因型。關聯分析顯示在白薩?？搜蛉后w中，GG基因型個體周歲的陰囊圍顯著的高于AA基因型（=0.029）?！窘Y論】鑒定得到6個綿羊Y染色體基因片段，它們與牛、山羊、牦牛和巖羊具有較高的同源性，表明Y染色體基因在進化過程中具有一定的保守性。首次在薩福克和白薩?？搜蛉后w11片段中找到一個Y-SNP（G＞A），其與白薩?？搜蛑軞q的睪丸大小緊密相關。

Y染色體；綿羊；單核苷酸多態(tài)性

0 引言

【研究意義】Y染色體基因在研究父系遺傳多樣性、維持雄性特性，精子發(fā)生和雄性繁殖力起著關鍵作用，Y染色體分子標記已經運用于綿羊父系起源進化研究及父系單倍型構建[1-3]。然而Y染色體測序困難，造成綿羊Y染色體基因序列極度貧乏。因此本研究基于前期?？苿游颵染色體研究成果，進行綿羊Y染色體基因片段鑒定和Y-SNPs的篩選，以期為優(yōu)秀種公羊的早期選擇、胚胎性別的早期鑒定和綿羊品種的父系遺傳多樣性的保護提供理論依據。【前人研究進展】哺乳動物的性染色體，X和Y染色體，是由一對原始的常染色體進化而來[4]。Y染色體是雄性動物特有的性染色體，由兩部分組成：擬常染色體區(qū)域和Y染色體雄性特異區(qū)（male specific region of Y chromosome, MSY）組成。MSY區(qū)在減數分裂過程中不與X染色體發(fā)生重組交換，遵循嚴格的父系遺傳。Y染色體結構非常復雜，包含有大量的重復序列和回文結構，使得其序列的組裝極為困難[5]。到目前為止，綿羊Y染色體只有、等少數基因的部分序列已公布[6-8]。MEADOWS等利用23對人、牛、綿羊Y染色體特異性引物擴得到綿羊、、、、等Y染色體基因的部分片段[9]。FENG等擴增得到巖羊ZFY基因639 bp的片段[7]。劉帥兵克隆得到ZFY基因整個mRNA全長[10]。熊勇等克隆得到藏系綿羊ZFY基因447 bp的片段[11]。蔣利等利用山羊SRY基因序列設計引物，擴增得到阿勒泰羊、藏綿羊SRY基因整個編碼區(qū)的雄性特異性片段，研究表明SRY基因在不同綿羊品種間具有高度的同源性[12]?！颈狙芯壳腥朦c】目前只有人類、猩猩、獼猴、小鼠和牛等少數物種的Y染色體完成了測序[3,5,13-15]。關于綿羊Y染色體，少數研究者只擴增出基因的部分片段，未見克隆得到完整的Y染色體基因序列?！緮M解決的關鍵問題】本研究基于牛科動物現有Y染色體特異引物鑒定綿羊Y染色體單拷貝基因，掃描Y染色體基因在不同綿羊品種中的SNPs，以期找到Y染色體分子標記，以期為篩選不同羊品種Y染色體SNPs提供基礎，也為綿羊早期胚胎性別的鑒定提供了分子標記，為進一步研究綿羊Y染色體基因序列奠定基礎。

1 材料與方法

試驗于2016年10月至2017年5月在蘭州大學草地農業(yè)生態(tài)系統(tǒng)國家重點實驗室完成。

1.1 試驗材料

496份公綿羊和14份公巖羊的血液樣本，包括采自北京澳鑫牧業(yè)有限公司的薩福克羊（n=146）、白薩?？搜颍╪=91）、東弗里升羊（n=6）、特克塞爾羊（n=72）、南非肉用美利奴羊（n=17）、杜泊羊（n=32），甘肅金昌中天羊業(yè)有限公司的湖羊（n=55），甘肅甘南藏族自治州的藏羊（n=34），寧夏鹽池縣的灘羊（n=43），巖羊采自新疆動物園野生動物保護中心。采集3只湖羊母羊血液（甘肅金昌中天羊業(yè)有限公司）及3只巖羊母羊血液，作為陰性對照。同時在收集血樣時測定薩?？搜?、白薩福克羊、東弗里升羊、特克塞爾羊、南非肉用美利奴羊、杜泊羊周歲（周歲±15—20 d）的陰囊圍直徑。

1.2 DNA的提取和DNA池的構建

采用常規(guī)的酚-氯仿抽提法提取綿羊血液基因組DNA[16]。用Nano drop 2000（Thermo，美國）檢測提取的DNA濃度和純度，并用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA的質量。將質量檢測合格綿羊和巖羊DNA統(tǒng)一稀釋為50 ng·μL-1，每個個體DNA取10 μL，以同一個品種盡量在一個DNA池的原則，每10個個體混成一個DNA池，共計51個DNA池，混合均勻后-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 綿羊Y染色體特異性引物的篩選

查閱相關文獻可知，目前在牛、牦牛、山羊等牛科動物Y染色體研究有29對引物（表1），分別能擴增出MSY區(qū)的、、、、、等基因。本研究的29對引物均由北京六合華大基因科技有限公司合成。實驗以公羊DNA混合池為模板，以母羊DNA為陰性對照，滅菌水為空白對照，通過PCR擴增確定綿羊Y染色體特異性引物。PCR擴增體系為50 μL：模板2 μL，上、下游引物各1 μL，2×EasyTaq酶25 μL和ddH2O 21μL。擴增反應條件：94℃預變性30 s；94℃變性30 s，退火30 s，72℃延伸1 min/1kb，34個循環(huán)；72℃延伸5 min；4℃保存。PCR產物用1％瓊脂糖凝膠電泳檢測。

表1 引物序信息

表中僅列出綿羊Y染色體特異性引物的退火溫度The annealing temperatures were listed for those ovine Y-specific primers

1.4 綿羊Y染色體特異性基因片段SNPs篩選

將上述鑒定為綿羊Y染色體特異性引物，以DNA混合池為模板的PCR產物送北京六合華大基因科技有限公司進行測序。DNAstar和Chromas軟件用于測序結果分析，DNAMAN用于多序列比對及同源性分析。經過混合池測序，在11片段內鑒定得到一個G＞A突變，利用Watcut軟件分析（http://watcut. uwaterloo.ca/template.php?act=snp_new）發(fā)現該突變位點可被限制性內切酶188I識別。酶切反應體系：10×NEB Buffer 3 μL，PCR產物4 μL和5U188I內切酶，加滅菌水至25 μL。酶切反應條件為37℃溫育3 h。取酶切消化液10 μL加樣于2.5%瓊脂糖凝膠上進行電泳。

1.5 數據處理與統(tǒng)計分析

利用SPSS 19.0軟件分析基因位點與綿羊睪丸大小的相關性。先對數據進行描述性統(tǒng)計分析，確定是否存在離群值，根據數據特征，利用單因素方差分析（ANOVA）探究基因型效應。

2 結果

2.1 綿羊Y染色體特異性引物

通過PCR擴增，本研究發(fā)現29對引物中6對引物，包括3、6、、、11、6確定為Y染色體特異性引物（圖1），只在公羊DNA上出現擴增條帶，在母羊DNA及水中沒有擴增產物。此外17對引物未能出現擴增條帶或非特異性擴增，6對引物母羊DNA能擴增出條帶（電子版附圖S1）。

2.2 綿羊Y染色體特異性DNA片段與其他物種的同源性分析

通過對上述6對特異性引物的PCR產物進行測序，分析發(fā)現3片段大小為614 bp，該片段與山羊第11外顯子和部分CDS區(qū)相似度較高，相似度為98.84%。6片段大小為461 bp，該片段與山羊部分CDS區(qū)相似度較高，相似度為98.84%。片段大小為444 bp，該片段與牛第26外顯子相似度較高，相似度為84.96%。片段大小為256 bp，該片段與牛第19外顯子相似度較高，相似度為81.51%。片段大小為440 bp，該片段與山羊SRY基因序列相似度較高，相似度為90.41%，該基因片段的部分片段（237 bp）與NCBI公布的綿羊的SRY基因CDS區(qū)（AY604735.1）相似度達100%。3片段大小為621 bp，該片段與牛ZFY基因第11外顯子和部分CDS區(qū)相似度較高，相似度為97.67%。

用DNAMAN生物軟件，將綿羊3、6、、、11、6基因序列與山羊、牛、牦牛和巖羊相應基因序列進行序列比對（電子版附圖S2—S7），計算不同物種基因序列間的同源性大?。ū?）。結果表明，綿羊3基因片段與巖羊、山羊、牛、牦牛各物種間同源性大小分別為98.84%、97.89%、97.08%和95.79%；綿羊SRY6基因片段與巖羊、山羊、牛、牦牛各物種間同源性大小分別為95.25%、93.93%、90.54%和90.32%；綿羊USP9Y基因片段與牛、牦牛各物種間同源性大小分別為84.96%、84.67%；綿羊UTY基因片段與巖羊、黃牛、牦牛各物種間同源性同為96.77%、81.51%和81.51%；綿羊SRY11基因片段與巖羊、山羊、牛、牦牛各物種間同源性大小分別為92.63%、90.41%、84.97%和84.75%；綿羊ZFY6基因片段與巖羊、山羊、牛、牦牛各物種間同源性大小分別為99.06%、89.11%、97.67%和86.76%。由于USP9Y基因是從巖羊母羊DNA中擴增出，表明該片段并不是巖羊Y染色體片段。

A：ZFY3基因PCR擴增結果；B：SRY6基因PCR擴增結果；C：USP9Y基因PCR擴增結果；D：UTY基因PCR擴增結果；E：SRY11基因PCR擴增結果；F：ZFY6基因PCR擴增結果；1-3公羊DNA，4-6母羊DNA，7-9 ddH2O，M.DNA相對分子質量標準DL2000

表2 綿羊Y染色體基因與不同物種同源基因的比較

2.3 綿羊Y染色體SNPs的篩選及基因效應分析

通過測序，3、6、、、6基因序列均未發(fā)現突變位點。在薩?？撕桶姿_?？搜蛉后w中，11片段混合池測序出現雙峰，進一步對其中一個混池的每個個體分別進行測序，驗證為G＞A的突變（圖2）。對薩福克及白薩?？说膫€體進行PCR-RFLP檢測，PCR產物經188I酶切后產生AA和GG 2種基因型（圖3）。AA基因型個體的擴增產物能被188I酶切后將產生4個片段，分別為54、63、151和172 bp；GG基因型個體的擴增產物能被188I酶切后將產生3個片段，分別為63、172和205bp。11片段G＞A突變位點在薩?？搜颉姿_?？搜颉|弗里升羊、特克塞爾羊、南非肉用美利奴羊、杜泊羊、湖羊、藏羊、灘羊公羊群體中的基因型頻率、等位基因頻率見表3。結合混合池測序及酶切結果發(fā)現，在薩?？搜?、白薩福克羊中存在AA和GG基因型，其中在白薩福克羊群體中AA基因型頻率為0.253，GG基因型頻率為0.747；在薩?？搜蛉后w中AA基因型頻率為0.014，GG基因型頻率為0.986。結果顯示GG基因型在薩?？搜蚝桶姿_?？搜蛉后w中為優(yōu)勢基因型；而東弗里升羊、特克塞爾羊、南非肉用美利奴羊、杜泊羊、湖羊、藏羊、灘羊公羊群體中只有GG基因型。通過對巖羊個體的混合池測序，在11片段也未發(fā)現突變位點。性狀關聯分析表明，在白薩?？搜蛉后w中，GG基因型個體的睪丸大小顯著的高于AA基因型（表4）。

A. AA基因型; B. GG基因型

表3 SRY11片段G＞A 位點在不同綿羊品種中的基因型和等位基因頻率

1，3：AA基因型；2，4：GG基因型；M為DNA相對分子質量標準DL2000

表4 SRY11片段G＞A位點與白薩福克羊睪丸大小之間的關聯分析

3 討論

在目前研究綿羊起源進化及單倍型分析中，更多的是以線粒體基因遺傳多樣性為基礎的母系遺傳研究，而利用以Y-SNPs為基礎的父系遺傳的研究較少。綿羊的父系及母系遺傳相結合才能更加全面、系統(tǒng)的分析綿羊起源進化、單倍型及分類。本研究篩選得到了6對綿羊Y染色體特異性引物，均為首次擴增得到，與MEADOWS等篩選得到9對綿羊Y染色體特異性引物無重復[9]。（sex-determining region on Y chromosome,）位于哺乳動物Y染色體，是性別決定直接相關的基因。該基因從人的Y染色體上首次分離得到，并被確定為睪丸決定因子[24]。MEADOWS等通過測序在SRY基因5′啟動區(qū)發(fā)現8個SNPs，結合Y染色微衛(wèi)星鑒定綿羊及野生綿羊單倍型[25]。MEADOWS等發(fā)現得到綿羊第一外顯子與牛的同源性為94.7%，并在5′啟動區(qū)鑒定得到了一個A＞G的突變[9]。在本次研究擴增得到了兩個SRY基因片段，其與牛的同源性分別為90.54%和84.97%，這與前人的研究相似，說明綿羊和牛SRY基因具有較高的同源性。本研究在11片段鑒定到1個G＞A的同義突變，通過188I酶切分析，發(fā)現只有在薩?？搜颉姿_?？搜蛑杏蠥A和GG 2種基因型，而在其他7個綿羊品種和巖羊中只有GG基因型，暗示該位點可能只存在于薩福克羊和白薩?？搜虻难y(tǒng)中，但還需要在更多的綿羊品種群體中進行驗證。此外該突變位點與白薩?？搜蛑軞q的睪丸大小緊密相關，即GG基因型個體的睪丸大小顯著大于AA型個體。本研究為首次發(fā)現Y染色體突變與綿羊繁殖性狀相關。該位點在更大的白薩福克羊群體進行驗證后可用于白薩?？朔N公羊的選育。

ZFY基因即Y連鎖的鋅指蛋白因子（zinc finger protein, Y-linked），位于Y染色體短臂（Yp11.3）上，由11個外顯子和1個隨機重復區(qū)域的13個“鋅-指”結構組成，在雄性動物睪丸的生長發(fā)育過程中發(fā)揮作用[26-27]。毛德才研究發(fā)現牦牛、猩猩、人、牛等9個物種間的核苷酸序列有較高同源性[28]。熊勇等研究表明藏系綿羊ZFY基因與豬、摩弗倫羊、狼、人類等其他物種之間具有很高的同源性[11]。LAWSON等通過進化樹分析發(fā)現：綿羊與巖羊、山羊、牛的親緣關系較近[8]。ARKADI克隆得到了整個牛ZFY基因整個編碼區(qū)及馬和豬ZFY基因編碼區(qū)部分序列，通過比對發(fā)現ZFY基因編碼區(qū)在3個物種的同源性較高[29]。本研究發(fā)現綿羊3和6片段與巖羊、山羊、牛、牦牛等物種間同源性大小在89.11%—99.6%，表明該基因在不同物種間也具有較高的同源性，與前人的研究基本一致。AASEN等[30]利用片段的擴增及酶切鑒別人、牛、綿羊和山羊的胚胎性別，該研究的結果也可用于綿羊胚胎性別的早期鑒定。

SATOU等[31]研究發(fā)現USP9Y基因的突變影響小鼠睪丸重量。有學者發(fā)現在牛USP9Y基因第26內含子發(fā)現了一個81 bp的插入缺失，并用于構建牛Y染色體單倍型及區(qū)分瘤牛和普通牛[21,32-33]。本研究在USP9Y基因片段中沒有檢測到遺傳變異，今后需要在更多的綿羊品種進行Y-SNPs掃描。先前的研究利用BAC的方法在絨山羊上鑒定到USP9Y基因348 bp的片段，其與家貓、人、恒河猴、黑猩猩等的同源性在89％以上[34]。本研究擴增得到的綿羊USP9Y基因與牛、牦牛各物種間同源性大小分別為84.96%、84.67%，表明該基因在進化過程中具有一定的保守性。USP9Y基因在巖羊母羊DNA中擴增出，表明該片段并不是巖羊Y染色體片段，因此本研究的結果可作為區(qū)分巖羊和綿羊的分子標記。

UTY基因即Y連鎖的泛轉錄三角形四肽重復因子，在人上的研究發(fā)現UTY基因有6個不同的mRNA轉錄本，UTY蛋白被認為是未成熟的組織適合性抗原，可啟動男性特異性細胞毒性T淋巴細胞反應[35-36]。MEADOWS等擴增得到了UTY基因外顯子1，通過比對發(fā)現與牛的同源性為98.1%[9]。本研究擴增得到的綿羊UTY基因與巖羊、牛、牦牛各物種間同源性達81.51%—96.77%，表明該基因在進化過程中相對保守。GINJA等擴增牛UTY基因19外顯子，發(fā)現有一個C＞A的突變[23]。然而在本研究中在UTY基因上并未檢測到突變位點。

本研究首次在發(fā)現一個G＞A的突變，在3、6、、、6片段均未發(fā)現突變，其原因可能與樣本量大小及品種差異有關。但是本研究的結果為今后我國綿羊品種父系遺傳多樣性的研究奠定了基礎。當然，為了系統(tǒng)和全面研究綿羊Y染色體，必須依賴綿羊Y染色體完整的序列，完成綿羊Y染色體測序是研究綿羊父系遺傳多樣性和綿羊雄性繁殖力育種亟待解決的難題。

4 結論

本研究首次擴增得到綿羊、、和4個基因的6個片段。通過比對發(fā)現綿羊3、6、、、6片段與巖羊、牛、山羊、牦牛的具有較高的同源性。首次在11片段發(fā)現G＞A的突變，該突變位點只存在于薩?？撕桶姿_?？斯蛉后w中，并與白薩?？搜虿G丸大小緊密相關。

A：2 PCR擴增結果；B：4 PCR擴增結果；C：5 PCR擴增結果；D：9 PCR擴增結果；E：1 PCR擴增結果；F：9 PCR擴增結果；1-3公羊DNA，4-6母羊DNA，7-9ddH2O，M.DNA相對分子質量標準DL2000

A.PCR products of3 fragment; B.PCR products of6 fragment; C.PCR products offragment; D.PCR products offragment; E.PCR products of11 fragment; F.PCR products of3 fragment;1-3 rams DNA;4-6 ewes DNA;7-9 ddH2O;M.DL2000 marker

圖S1 綿羊Y染色體非特異性PCR擴增結果

Fig. S1 PCR products of Y nonspecific fragment in sheep

圖S2 不同物種3基因序列比對結果

Fig. S2 Comparison of ovine3 gene sequence with other species

圖S3 不同物種6基因序列比對結果

Fig. S3 Comparison of ovine6 gene sequence with other species

圖S4 不同物種基因序列比對結果

Fig. S4 Comparison of ovinegene sequence with other specie

圖S5 不同個物種基因序列比對結果

Fig. S5 Comparison of ovinegene sequence with other specie

圖S6 不同物種11基因序列比對結果

Fig. S6 Comparison of ovine11 gene sequence with other specie

圖S7 不同物種6基因序列比對結果

Fig. S7 Comparison of ovine6 gene sequence with other specie

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（責任編輯 林鑒非）

Screening of Y Chromosome Specific Primers and Y-SNPs in Sheep

CAO XueTao1, PEI ShengWei1, ZHANG Jin3, LI FaDi1,2, Li Gang3, LI WanHong1, YUE XiangPeng1

(1State Key Laboratory of Grassland Agro-ecosystems, Lanzhou University/Key Laboratory of Grassland Livestock Industry Innovation, Ministry of Agriculture and Rural Affairs/ College of Pastoral Agriculture Science and Technology, Lanzhou University, Lanzhou 730020;2Engineering Laboratory of Mutton Sheep Breeding and Re-production Biotechnology in Gansu Province, Minqin 733300, Gansu;3Animal Breeding Centre of Gansu Province, Wuwei 733000, Gansu)

【Objective】The male specific region of the mammalian Y chromosome (MSY)does not recombine with X chromosome during meiosis process, which is an important genetic resource for analyzing paternal genetic diversity due to its strict father to son inherited character. In addition, most of genes on MSY exclusively or predominantly express in the testis, indicating they may play essential roles in spermatogenesis and male reproduction. Since it is extremely difficult to sequence of entire Y chromosome, many species have very few Y chromosome sequences. Therefore, the current study was conducted to select ovine Y chromosome specific primers and Y-SNP based on the previous primer information used in bovidae species, and to compare the Y-fragment sequences similarity among sheep, bovine, goat, yak and bharal. Meanwhile, the Y-SNP was associated with sheep scrotal circumference to supply scientific basis for constructing ovine Y-haplotypes, identifying molecular markers for embryo sex and male reproductive traits in the future.【Method】Based on the investigation of available references about bovidae Y chromosome, 29 pairs of Y-primers reported in cattle, yak, goat were selected to amplify rams DNA using ewes DNA and ddH2O as negative controls. Subsequently, the Y-SNPs within ovine Y-specific fragment identified of different sheep breeds were investigated by DNA sequencing of DNA pooling and PCR-RFLP methods, including Suffolk sheep (n=146),White Suffolk sheep (n=91),East Friesian sheep (n=6), Texel sheep (n=72), South African Mutton Merino (n=17), Dorper sheep (n=32), Hu sheep (n=55),Tibetan sheep (n=34), Tan sheep (n=43), and bharal (n=14). Chromas and DNASTAR were used to analyze the results of DNA-pool sequencing, and DNAman was used for homology analysis of yak, goat, cattle and bharal. Meanwhile, the correlation analysis between the11 gene fragment polymorphisms and the testis size was performed by SPSS 19.0.【Result】The results showed that 6 out of 29 pairs of primers analyzed were ovine Y-specific, which could amplify3,6,,,11 and6 fragments, respectively. However, 17 pairs of primers failed to show amplification bands, and 6 pairs of primers showed amplified bands in the DNA of the ewes. The similarity of them among sheep, bharal, cattle, goat and yak ranged from 81.51% to 98.84%. In addition, a Y-SNP (G＞A) with in11 fragment was first identified in the Suffolk and white Suffolk sheep.According to RCR-RFLP analysis, two genotypes (AA, GG) were detected in the Suffolk sheep and white Suffolk sheep, while only the GG genotype was found in the other seven sheep breeds. The genotypic frequencies of the GG and AA were 0.747 and 0.253 in White Suffolk sheep, respectively, while they were 0.986 and 0.014 in Suffolk sheep, indicating the dominant genotype was GG genotype in White Suffolk sheep and Suffolk sheep. Association analysis suggested that the testis size of the GG genotype was significantly higher than those of the AA genotype in the white Suffolk sheep population (=0.029).【Conclusion】In this study, six pairs of ovine Y-specific primers were identified, and the Y-linked fragment identified in ovine showed a high similarity with cattle, goats and yaks, indicating certain conservation in the evolutionary process. In addition, a Y-SNP was found to be specific in White Suffolk sheep and Suffolk sheep, which was closely associated with the testis size of white Suffolk sheep.

Y chromosome; sheep; single nucleotide polymorphism (SNP)

2017-12-25；

2018-04-17

甘肅省農業(yè)生物技術研究與應用開發(fā)項目（GNSW-2015-24，GNSW-2016-22）、甘肅省重點研發(fā)計劃（17YF1NA066）、甘肅省農業(yè)科技創(chuàng)新項目（GNCX-2014-41）、國家肉羊產業(yè)技術體系（CARS-38）和長江學者和創(chuàng)新團隊發(fā)展計劃（IRT13019）

曹學濤，E-mail：caoxt16@ lzu.edu.cn。信作者樂祥鵬，E-mail：lexp@lzu.edu.cn

10.3864/j.issn.0578-1752.2018.15.0014