基于微流控芯片的復(fù)方木雞顆?？垢文[瘤的“譜-物-效”關(guān)系

秦 妍，包永睿，王 帥，李天嬌，張秀君，孟憲生，潘海鷗

(1. 遼寧中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院；2. 遼寧省中藥多維分析專業(yè)創(chuàng)新技術(shù)中心，遼寧省現(xiàn)代中藥研究工程實(shí)驗(yàn)室，遼寧 大連 116600；3. 丹東藥業(yè)集團(tuán)有限公司, 遼寧 丹東 118303；4. 遼寧中醫(yī)藥大學(xué)外國(guó)語(yǔ)學(xué)院，遼寧 沈陽(yáng) 110000)

復(fù)方木雞顆粒源自于滿族民間驗(yàn)方“木雞湯”，部頒標(biāo)準(zhǔn)《中藥成方制劑》第十六冊(cè)中記載，其具有抑制甲胎蛋白升高的作用。主要用于治療慢性乙型病毒性肝炎、肝纖維化、肝硬化以及肝癌。木雞湯此前由云芝、核桃楸皮兩味藥材組成，后經(jīng)多年實(shí)踐應(yīng)用，在此基礎(chǔ)上增添扶正祛邪的山豆根以及補(bǔ)益肝腎的菟絲子兩味藥材[1]。目前，復(fù)方木雞顆粒文獻(xiàn)中圍繞物質(zhì)基礎(chǔ)的研究較少，主要集中在作用機(jī)制以及成分解析[2-5]方面，其中多數(shù)成果為本實(shí)驗(yàn)室研究所得。本實(shí)驗(yàn)在前期工作基礎(chǔ)之上，針對(duì)復(fù)方木雞顆粒抗肝癌藥效物質(zhì)基礎(chǔ)不明確的問題展開了譜效學(xué)研究[6]，通過(guò)建立數(shù)學(xué)模型賦予VIP值，確定與藥效呈現(xiàn)正相關(guān)的色譜峰。在此基礎(chǔ)上，基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)對(duì)正相關(guān)成分進(jìn)行“成分-靶點(diǎn)-通路”預(yù)測(cè)。故將“譜-效”分析的結(jié)果與“物”進(jìn)行關(guān)聯(lián)，建立“譜-物-效”分析方法，為其合理的機(jī)制闡述提供數(shù)據(jù)支撐，同時(shí)也為更好地控制其藥品質(zhì)量提供研究依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 儀器LSP04-1A型精密注射泵(保定蘭格公司)；HPDC-32G-2型等離子清洗機(jī)(美國(guó)Harrick Plasma公司)；JKG-2A型光刻機(jī)(上海學(xué)澤光學(xué)機(jī)械有限公司)；SC-1B型勻膠機(jī)(北京創(chuàng)世威納科技有限公司)；Agilent 1260液相色譜儀(美國(guó)安捷倫科技有限公司)；Agilent 1290 Infinity II型超高效液相色譜儀(美國(guó)安捷倫科技有限公司)；Agilent 6550型質(zhì)譜聯(lián)用儀(美國(guó)安捷倫科技有限公司)；Nikon ECLIPSE TI倒置顯微鏡(日本Nikon公司)。

1.2 試劑與藥品復(fù)方木雞顆粒(批號(hào)：210103)來(lái)源于遼寧丹東藥業(yè)集團(tuán)有限公司；細(xì)胞凋亡與壞死檢測(cè)試劑盒(Hoechst33342與碘化丙啶PI)購(gòu)自碧云天生物技術(shù)研究所；細(xì)胞增殖與毒性檢測(cè)試劑盒(Cell Counting Kit8，貨號(hào)：MA0218)購(gòu)自Meilunbio公司；乙腈(色譜純，批號(hào)：20210512)購(gòu)自于德國(guó)Merck公司；甲酸(色譜純，批號(hào)：20210408)購(gòu)自天津科密歐化學(xué)試劑有限公司；胎牛血清、DMEM培養(yǎng)基、胰蛋白酶均購(gòu)自于美國(guó)Gibco公司；青霉素/鏈霉素溶液購(gòu)自于Meilunbio公司。

1.3 凋亡特征芯片的設(shè)計(jì)與制作實(shí)驗(yàn)所需芯片設(shè)計(jì)為PDMS-玻璃的雙層微流控芯片，從上到下依次為流體通道層以及玻璃基片層，流體通道層包括流體通道區(qū)以及多個(gè)細(xì)胞腔組成的細(xì)胞培養(yǎng)區(qū)，每列培養(yǎng)腔設(shè)置5個(gè)復(fù)孔。

1.4 芯片和孔板中生長(zhǎng)狀態(tài)比較取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HepG2細(xì)胞，消化后制成濃度為5×108個(gè)· L-1的單細(xì)胞懸液，使用1 mL無(wú)菌微量注射器吸取適量細(xì)胞懸液，注入芯片細(xì)胞培養(yǎng)腔內(nèi)，使懸液順利進(jìn)入腔內(nèi)并均勻鋪滿管路，置于培養(yǎng)箱中進(jìn)行孵育6 h，待其完全貼壁后，使用精密注射泵將培養(yǎng)液注入至培養(yǎng)通道中，流速設(shè)置為0.2 μL· min-1。每24 h拍照1次，通過(guò)IPP軟件對(duì)細(xì)胞圖像進(jìn)行計(jì)數(shù)分析，取3個(gè)復(fù)孔平均值，繪制HepG2細(xì)胞芯片內(nèi)生長(zhǎng)曲線；將細(xì)胞密度調(diào)整為5×108個(gè)·L-1的單細(xì)胞懸液接種于96孔板中，每孔接種100 μL，并設(shè)置調(diào)零組。使用CCK-8法測(cè)定細(xì)胞在450 nm處的OD值，繪制HepG2細(xì)胞孔板內(nèi)生長(zhǎng)曲線。

1.5 復(fù)方木雞顆粒不同提取方式下藥液的制備提取溶劑為水(S1)、95%乙醇(S2)、氯仿(S3)、乙酸乙酯(S4)、正丁醇(S5)、甲醇(S6)、丙酮(S7)；稱取復(fù)方木雞顆粒50 g，S2 ～ S7分別加入10倍體積的提取溶劑回流提取1 h，抽濾后回收溶劑揮干，即得。精密稱取上述提取物2.00 g，置于10 mL容量瓶中，制成200 g·L-1的儲(chǔ)備液，過(guò)0.2 μm PTFE膜后轉(zhuǎn)移至樣品瓶中。S1稱取復(fù)方木雞顆粒2.00 g，同上述方法直接制備，供HPLC及UPLC-Q-TOF-MS分析使用；另外，采用培養(yǎng)液稀釋為濃度為10 g·L-1的儲(chǔ)備液，供微流控芯片藥效試驗(yàn)使用。

1.6 復(fù)方木雞顆粒提取物指紋圖譜的測(cè)定及體外藥效學(xué)評(píng)價(jià)

1.6.1HPLC色譜條件 Agilent Poroshell SB C18(4.6 mm×100 mm，2.7 μm)色譜柱，流動(dòng)相為乙腈(A)-0.04%甲酸水(B)進(jìn)行梯度洗脫(0-13 min，1%-6% A；13-19 min，6%-8% A；19-32 min，8%-13% A；32-34 min，13%-13% A；34-44 min，13%-17% A；44-52 min，17%-21% A；52-86 min，21%-41% A)，流速0.6 mL· min-1，柱溫30 ℃，UV檢測(cè)器254 nm，進(jìn)樣量5 μL。

1.6.2體外藥效學(xué)評(píng)價(jià) 取人肝癌細(xì)胞HepG2，常規(guī)培養(yǎng)于含10%的胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液中，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞接種于芯片中。待細(xì)胞貼壁后，以0.2 μL· mL-1的流速經(jīng)蠕動(dòng)泵給藥刺激24 h，使用Hoechst 33342和碘化丙啶(PI)染液對(duì)細(xì)胞進(jìn)行雙染，使用Nikon ECLIPSE TI倒置顯微鏡對(duì)芯片細(xì)胞進(jìn)行拍照，檢測(cè)S1～S7不同提取方式下藥效的差異。

1.7 灰色關(guān)聯(lián)分析灰色關(guān)聯(lián)分析法是中藥譜效關(guān)系中常用的方法之一，其主要途徑是通過(guò)計(jì)算指紋圖譜共有特征峰與藥效之間的關(guān)聯(lián)度大小，來(lái)以此確定特征峰對(duì)藥效的貢獻(xiàn)值[7]。本研究采用灰色關(guān)聯(lián)度分析軟件(Grey Modeling_V3.0)進(jìn)行分析，以細(xì)胞凋亡壞死率作為參考序列，不同提取方式下指紋圖譜共有峰峰面積作為比較序列[8]。采用灰色關(guān)聯(lián)分析法，先將原始數(shù)據(jù)進(jìn)行均值化處理，在獲得絕對(duì)差序列以及關(guān)聯(lián)系數(shù)。

1.8 UPLC-Q-TOF-MS成分解析色譜條件：Agilent Poroshell SB C18(4.6 mm×100 mm，2.7 μm)色譜柱；流動(dòng)相：乙腈(A)-0.04%甲酸水(B)；流速：0.6 mL· min-1；柱溫：30 ℃；梯度洗脫程序：0-3 min，1%-6% A；3-4.5 min，6%-8% A；4.5-8 min，8%-13% A；8-9 min，13%-13% A；9-12 min，13%-17% A；12-15 min，17%-21% A；15-23 min，21%-41% A。

質(zhì)譜條件：采用Dual AJS ESI離子源，正/負(fù)離子模式檢測(cè)，掃描范圍：m/z 100-1 500。干燥氣體流速為13 L· min-1，干燥氣體溫度為225 ℃，正離子模式下毛細(xì)管電壓為 3 500 V，負(fù)離子模式下毛細(xì)管電壓為-4 000 V，霧化器壓力為40 psig，碎裂電壓為125 V，OCT IRF Vpp為750 V，二級(jí)質(zhì)譜碰撞電壓為20 eV。

1.9 譜-物-效”關(guān)系研究中物質(zhì)基礎(chǔ)成分篩選將關(guān)聯(lián)系數(shù)>0.8的單體成分峰面積作為變量X，獲取的不同提取方式下復(fù)方木雞顆粒的藥效數(shù)據(jù)作為變量Y，導(dǎo)入SIMCA 14.1軟件中，經(jīng)UVN標(biāo)準(zhǔn)化后，進(jìn)行偏最小二乘法回歸(PLSR)分析。

1.10 “活性成分-靶點(diǎn)-通路”網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建通過(guò)TCMSP(http：//tcmspw.com/tcmsp.php)、BATMAN-TCM(http：//bionet.ncpsb.org/batman-tcm)、Uniprot(https：//www.uniprot.org)數(shù)據(jù)庫(kù)獲得上述7個(gè)成分的89個(gè)靶點(diǎn)以及KEGG(https：//David-d.ncifcrf.gov/home.jsp)富集的88條通路，運(yùn)用Cytoscape3.7.1軟件構(gòu)建“成分-靶點(diǎn)-通路”網(wǎng)絡(luò)。同時(shí)，采用STRING(https：//string-db.org)數(shù)據(jù)庫(kù)獲取核心靶蛋白，將其導(dǎo)入Cytoscape3.7.1運(yùn)用CytoNCA插件對(duì)核心蛋白進(jìn)行篩選。

Fig 1 Schematic diagram of microfluidic chip

2 結(jié)果

2.1 芯片的設(shè)計(jì)與制作本實(shí)驗(yàn)所需芯片包括3個(gè)入口以及3個(gè)廢液口，每列細(xì)胞腔下方設(shè)置有100 μm的彎曲管道，以防止液體倒流；其長(zhǎng)度為5 cm，寬度為4 cm，厚度為3 mm，每個(gè)腔室為橢圓形，規(guī)格是1.0 mm×1.2 mm。

2.2 芯片和孔板中生長(zhǎng)狀態(tài)比較結(jié)果HepG2細(xì)胞在鼠尾膠原包被的芯片中完全伸展，形態(tài)良好；通過(guò)比較兩種培養(yǎng)方式，其細(xì)胞形態(tài)上并無(wú)明顯差異；通過(guò)Nikon ECLIPSE TI倒置顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)，芯片中細(xì)胞連接更為緊密，培養(yǎng)腔室內(nèi)細(xì)胞生長(zhǎng)環(huán)境較佳。同時(shí)能夠說(shuō)明流動(dòng)培養(yǎng)能夠及時(shí)清理細(xì)胞培養(yǎng)腔中細(xì)胞代謝物。始終為細(xì)胞提供新鮮的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，充分為細(xì)胞生存提供良好的微環(huán)境。見Fig 2A和Fig 2B。

Fig 2 (A) Cell growth in chip; (B) Cell growth in pore plate

HepG2在芯片中24～168 h之間細(xì)胞數(shù)量持續(xù)增長(zhǎng)，且在24～144 h內(nèi)呈現(xiàn)對(duì)數(shù)增長(zhǎng)，144～168 h增長(zhǎng)速率相對(duì)緩慢；細(xì)胞在孔板中72 h內(nèi)已經(jīng)達(dá)到對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，孔板內(nèi)細(xì)胞代謝物大量堆積，在144 h后細(xì)胞數(shù)量出現(xiàn)下降的趨勢(shì)；結(jié)果表明兩種培養(yǎng)方式的生長(zhǎng)規(guī)律基本一致，但芯片培養(yǎng)方式更有利于細(xì)胞長(zhǎng)期培養(yǎng)。見Fig 3A和Fig 3B。

Fig 3 (A) Cell growth curve in chip; (B) Cell growth curve in pore plate

Fig 4 (A) Efficacy of HepG2 cells in vitro; (B) Hoechst 33342/PI double staining fluorescence detection results (×100)

2.4 復(fù)方木雞顆粒不同提取方式指紋圖譜的建立取供試品溶液按“1.6.1”色譜條件進(jìn)行檢測(cè)，得到7個(gè)不同提取方式下復(fù)方木雞顆粒的指紋圖譜。其中，S4作為全色譜峰。圖譜信息導(dǎo)入中藥指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)軟件(2012版)。見Fig 5和Fig 6。

Fig 5 Full spectrum peak of Compound Muji Granules

Fig 6 Fingerprint of Compound Muji Granules under different extraction methods

Fig 7 Regression coefficient and VIP value analysis results

2.4.1相似度評(píng)價(jià) 利用中藥指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)軟件(2012版)分析，7種不同提取方式下復(fù)方木雞顆粒指紋圖譜的相似度分別為S1：0.635，S2：0.988，S3：0.939，S4：0.957，S5：0.943，S6：0.864，S7：0.405。結(jié)果表明，除S1和S7外，其余樣品相似度在0.864～0.988，表明不同提取方式下峰面積以及峰數(shù)量存在明顯差異，即化學(xué)成分之間存在一定的差異性。

2.4.2方法學(xué)考察

2.4.2.1精密度試驗(yàn) 取S1供試品粉末，以“1.5”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，以“1.6.1”項(xiàng)下色譜條件重復(fù)進(jìn)樣6次，以木犀草素為參照峰，計(jì)算各峰相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積。結(jié)果顯示，各峰相對(duì)保留時(shí)間RSD<0.35%，相對(duì)峰面積RSD<2.74%，表明該方法精密度良好。

2.4.2.2穩(wěn)定性試驗(yàn) 取S1供試品粉末，以“1.5”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，以“1.6.1”項(xiàng)下色譜條件分別于0、2、4、8、12、24 h進(jìn)行測(cè)定，以木犀草素為參照峰，計(jì)算各峰相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積。結(jié)果顯示，各峰相對(duì)保留時(shí)間RSD<0.26%，相對(duì)峰面積RSD<2.66%，表明室溫條件下樣品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.4.2.3重復(fù)性試驗(yàn) 取S1供試品粉末，以“1.5”項(xiàng)下方法制備6份供試品溶液，以“1.6.1”項(xiàng)下色譜條件分別進(jìn)樣，以木犀草素為參照峰，計(jì)算各峰相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積。結(jié)果顯示，各峰相對(duì)保留時(shí)間RSD<0.42%，相對(duì)峰面積RSD<2.98%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.5 灰色關(guān)聯(lián)度分析與UPLC-Q-TOF-MS解析將細(xì)胞凋亡壞死率作為母序列，72個(gè)色譜峰峰面積作為子序列，采用灰色關(guān)聯(lián)度軟件展開分析，由此得到，不同提取方式色譜峰與其凋亡壞死率的關(guān)聯(lián)系數(shù)。其中相關(guān)性系數(shù)>0.8的列表如Tab 1。

Tab 1 Grey correlation analysis of chemical components and pharmacodynamic indexes of Fufang Muji Granules by different extraction methods

對(duì)關(guān)聯(lián)性>0.8的色譜峰進(jìn)行質(zhì)譜解析，共確認(rèn)了11種成分，見Tab 2。

Tab 2 Preliminary examination of effective components of Compound Muji Granules

2.6 復(fù)方木雞顆?？垢伟┗钚晕镔|(zhì)基礎(chǔ)將Tab 2中關(guān)聯(lián)系數(shù)>0.8的各成分峰面積作為變量X，獲取的不同提取方式下復(fù)方木雞顆粒的藥效數(shù)據(jù)作為變量Y，導(dǎo)入SIMCA 14.1軟件中，經(jīng)UVN標(biāo)準(zhǔn)化后進(jìn)行PLSR分析。其中PLSR成分?jǐn)?shù)為2，模型P值為0.004 7。OPLS-DA模型中R2X=0.837，R2Y=0.726模型預(yù)測(cè)參數(shù)Q2=0.81，均>0.5，表明建立的模型有效穩(wěn)定。具體VIP值見Fig 7。一般認(rèn)為VIP值越大的變量其貢獻(xiàn)也越大，其中有7個(gè)色譜峰的VIP值 > 1，包括圖中48(木犀草素)、6(沒食子酸)、19(綠原酸)、59(槲皮素)、67(山柰酚)、65(柚皮素)、38(鞣花酸)與藥效指標(biāo)呈較強(qiáng)的正相關(guān)(VIP>1)。

2.7 “活性成分-靶點(diǎn)-通路”的構(gòu)建與分析“活性成分-靶點(diǎn)-通路”可視化網(wǎng)絡(luò)中共有184個(gè)節(jié)點(diǎn)，包括木犀草素、沒食子酸、綠原酸、槲皮素、山柰酚、柚皮素、鞣花酸7種成分、89個(gè)靶點(diǎn)蛋白、88條信號(hào)通路。通過(guò)CytoNCA分析節(jié)點(diǎn)度值較高的前20個(gè)靶基因，度值分值均大于10，間距中心度、緊密中心度、特征向量中心度均大于中位值，在網(wǎng)絡(luò)中篩選出與7種活性成分存在關(guān)聯(lián)的靶點(diǎn)有：ESR1、JUN、HSP90AA1、SMAD3、FOS、AKT1、NOS3、ACTB、CEBPB、ESR2以及SMAD2，提示這些基因可能是復(fù)方木雞顆粒治療肝腫瘤的核心靶點(diǎn)(Tab 3)。KEGG富集信號(hào)通路主要涉及炎癥、免疫等方面，如TNF信號(hào)通路(TNF signaling pathway)、HIF-1信號(hào)通路(HIF-1 signaling pathway)、FoxO信號(hào)通路(FoxO signaling pathway)、乙型肝炎信號(hào)通路(hepatits B)、NF-κB信號(hào)通路(NF-kappa B signaling pathway)等。

Tab 3 The core targets screened by CytoNCA pluggable unit

3 討論

本研究對(duì)不同提取方式的復(fù)方木雞顆粒進(jìn)行了HPLC分析，根據(jù)色譜峰的差異，選取S4作為全譜峰，共標(biāo)定72個(gè)色譜峰。經(jīng)“譜-效”分析的相關(guān)性結(jié)果可知，共有14個(gè)色譜峰的相關(guān)度>0.8，UPLC-Q-TOF-MS共解析14個(gè)色譜峰中的11個(gè)成分。同時(shí)對(duì)14個(gè)色譜峰進(jìn)行偏最小二乘回歸分析，得到木犀草素、沒食子酸、綠原酸、槲皮素、山柰酚、柚皮素以及鞣花酸7個(gè)抗肝癌活性物質(zhì)基礎(chǔ)。再對(duì)7個(gè)活性成分展開“成分-靶點(diǎn)-通路”網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建，預(yù)測(cè)其潛在靶標(biāo)為ESR1、JUN、HSP90AA1、SMAD3、FOS、AKT1、NOS3、ACTB、CEBPB、ESR2以及SMAD2，進(jìn)一步闡述復(fù)方木雞顆?？垢文[瘤的“譜-物-效”關(guān)系。

并且根據(jù)文獻(xiàn)研究報(bào)道，上述7種藥效物質(zhì)單體均有抑制肝腫瘤的作用。木犀草素能促進(jìn)肝癌細(xì)胞自噬，促進(jìn)肝細(xì)胞凋亡[9]。沒食子酸誘導(dǎo)SMMC-7721細(xì)胞凋亡，同時(shí)升高p53 mRNA水平和p53蛋白表達(dá)[10]。綠原酸可以抑制肝腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞M2極化，且影響JAK/STAT6信號(hào)通路[11]。槲皮素能較為顯著的抑制體內(nèi)外HepG2肝癌細(xì)胞的增殖，并會(huì)導(dǎo)致其發(fā)生凋亡[12]。山柰酚對(duì)肝癌Huh7細(xì)胞生長(zhǎng)有明顯的抑制作用，且提高了細(xì)胞caspase-3的活性，與誘導(dǎo)細(xì)胞的凋亡有關(guān)[13]。柚皮素增強(qiáng)抗人DR5單克隆抗體對(duì)HepG2的凋亡作用，其可能機(jī)制為柚皮素誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞表面DR5受體表達(dá)上調(diào)所致[14]。鞣花酸通過(guò)抑制CtBP、Stathmin和COX-2的表達(dá)發(fā)揮抗肝癌的生物學(xué)作用[15]。靶點(diǎn)作為藥物治療疾病的最小單位，并非獨(dú)立個(gè)體存在，“成分-靶點(diǎn)-通路”網(wǎng)絡(luò)是一個(gè)相互作用的復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)，通過(guò)多個(gè)通路同時(shí)發(fā)揮多重或協(xié)同作用。復(fù)方木雞顆粒成分眾多，因此，本文采用“譜-物-效”研究方法，對(duì)“譜-效”篩選出的物質(zhì)基礎(chǔ)進(jìn)行“成分-靶點(diǎn)-通路”藥理網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建，并且富集癌癥以及與細(xì)胞生長(zhǎng)、凋亡、增殖相關(guān)的通路；FoxO signaling pathway、HIF-1 signaling pathway等與免疫相關(guān)通路；TNF signaling pathway、Hepatits B等與肝炎相關(guān)的通路。

故推測(cè)復(fù)方木雞顆粒通過(guò)多過(guò)程、多通路共同參與抗腫瘤作用。本文從整體揭示復(fù)方木雞顆粒對(duì)肝腫瘤的干預(yù)作用及潛在靶標(biāo)，為后續(xù)深入研究復(fù)方木雞顆粒中不同活性成分調(diào)節(jié)肝腫瘤的作用機(jī)制以及抗肝腫瘤藥物的研發(fā)提供依據(jù)。