左旋紫草素抑制NF-κB信號(hào)通路保護(hù)LPS/D-GalN誘導(dǎo)的小鼠急性肝損傷

侯金秋，鄒 楠，袁今奇，杜夢(mèng)鴿，張 薇，秦冬梅

(1.石河子大學(xué)藥學(xué)院/新疆植物藥資源利用教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，新疆 石河子 832002；2.石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院，新疆 石河子 832002；3.新疆全安藥業(yè)股份有限公司，新疆 庫(kù)爾勒 841011)

急性肝損傷(acute liver failure,ALF)是一種致死性臨床綜合征，其病理特征是廣泛的肝細(xì)胞壞死、劇烈的氧化應(yīng)激和持續(xù)的炎癥反應(yīng)[1]，引起急性肝損傷的因素較多，其中爆發(fā)性肝臟炎癥是引起肝臟急性衰竭的主要原因[2]。研究表明[3]，在ALF發(fā)病進(jìn)程中，全身炎癥反應(yīng)的嚴(yán)重失調(diào)是導(dǎo)致大多數(shù)患者死亡的主要原因。炎癥反應(yīng)的特征是巨噬細(xì)胞的積累和激活[4]，在ALF的早期階段，大量的肝巨噬細(xì)胞被激活，通過(guò)過(guò)度產(chǎn)生促炎細(xì)胞因子和介質(zhì)進(jìn)一步導(dǎo)致炎癥的傳播和持續(xù)[5]，從而加重疾病進(jìn)程。因此，巨噬細(xì)胞的活化和ALF的發(fā)展密切相關(guān)。

革蘭陰性細(xì)菌外壁層中的成分脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)是一種內(nèi)毒素，可以誘導(dǎo)激活巨噬細(xì)胞活化并與巨噬細(xì)胞表面的TLR4受體結(jié)合[6]，從而進(jìn)一步激活該受體介導(dǎo)的下游MAPK/NF-κB信號(hào)通路，使得NF-κB信號(hào)通路中的IKK激酶激活，從而導(dǎo)致IκB蛋白磷酸化，磷酸化的IκB蛋白泛素化降解，使得NF-κB二聚體釋放后轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核中，其中MAPK是NF-κB的上游激動(dòng)劑，參與調(diào)控NF-κB通路的激活[7]，NF-κB p65的激活可以進(jìn)一步促進(jìn)巨噬細(xì)胞分泌細(xì)胞炎癥因子，從而加重炎癥反應(yīng)，NF-κB p65主要參與炎癥和免疫反應(yīng)的調(diào)節(jié)。同時(shí)研究發(fā)現(xiàn)，LPS是肝損傷發(fā)病機(jī)制中的關(guān)鍵因素，而D-氨基半乳糖(一種特定肝毒素)D-GalN和LPS聯(lián)合使用時(shí)又能加強(qiáng)LPS的急性毒性，因此，使用D-GalN結(jié)合LPS可以成功誘導(dǎo)動(dòng)物肝損傷模型，該模型也與人類肝炎模型非常相似[8]。目前，ALF死亡率高，迫切需要找到有效的藥物來(lái)改善急性肝損傷和避免嚴(yán)重并發(fā)癥的產(chǎn)生，研究巨噬細(xì)胞引起的炎癥反應(yīng)可能是一種治療ALF很有前途的治療策略。

L-SK是從紫草科植物紫草萘醌類成分中提取分離得到的單體化合物，其具有較好的藥理作用，包括抗菌、抗炎、抗腫瘤[9-10]等作用，本課題組在前期研究發(fā)現(xiàn)L-SK對(duì)于ConA誘導(dǎo)的小鼠免疫性肝損傷具有較好的保護(hù)作用[11]，同時(shí)初步判斷其有一定的抗炎作用，但對(duì)于L-SK的具體抗炎機(jī)制尚未闡明。前期研究考察的是免疫性肝損傷，本文探討的是急性肝損傷，同時(shí)本文細(xì)胞與動(dòng)物實(shí)驗(yàn)均采用LPS誘導(dǎo)，對(duì)于詮釋在炎癥相關(guān)肝損傷更具說(shuō)服力，因此本研究主要探究左旋紫草素紫草抗炎保肝作用機(jī)制。

本研究擬通過(guò)建立誘導(dǎo)RAW264.7巨噬細(xì)胞炎癥模型以及LPS/D-GalN誘導(dǎo)的急性肝損傷模型，從炎癥角度進(jìn)一步闡明L-SK的抗炎保肝作用機(jī)制，為其進(jìn)一步開(kāi)發(fā)提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 試劑與儀器

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物80只SPF級(jí)♂ C57BL/6小鼠(20～22) g，均購(gòu)自新疆維吾爾自治區(qū)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究中心，生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK(新)2016-0001，使用許可證號(hào)：SYXK(新)2016-0001，該動(dòng)物實(shí)驗(yàn)在新疆醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心進(jìn)行，按照國(guó)家實(shí)驗(yàn)室動(dòng)物飼養(yǎng)管理規(guī)范飼養(yǎng)，并經(jīng)石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)審核批準(zhǔn)(批準(zhǔn)號(hào)為：A2018-047-01)。

1.2 藥品與試劑左旋紫草素(110769)購(gòu)自上海源葉公司；小鼠巨噬細(xì)胞株(RAW264.7)(新疆自治區(qū)藥物研究所惠贈(zèng))；胎牛血清(FBS)(1828728)、胰酶(2193232)、DMEM Basic培養(yǎng)基(C11995500BT)均購(gòu)自Gibco；HIFIScript cDNA Synthesis Kit(批號(hào)：CW2569M)購(gòu)自康為世紀(jì)；QPCR引物購(gòu)自生工生物公司；MTT試劑盒(20181224)；脂多糖(620V0324)、青霉素-鏈霉素雙抗(10000 u)購(gòu)自Solarbio公司；TRNzol Universal Reagent試劑(80802)購(gòu)自Ambion公司；ECL超敏發(fā)光液(202003)購(gòu)自北京普利萊基因技術(shù)有限公司；INOS(10120S)、p-ERK1/2(4070T)、p-p38(4511T)、p-JNK(4668T)抗體均購(gòu)自CST公司，COX-2(BS90326)購(gòu)自Bioworld；ERK1/2(AM076)、p38(AM065)、JNK(AJ518)、p-p65(042919190703)、p65(031219190718)、p-IKKα/β(111518190703)、IKKα(102318190718)、IKKβ(111617190718)、GAPDH(070320200902)抗體均購(gòu)自碧云天，山羊抗兔lgG/la辣根酶標(biāo)記(214120813)購(gòu)自中杉金橋；D-氨基半乳糖(011421210405)購(gòu)自Bioworld；水飛薊賓(H20040299)購(gòu)自天津天士力圣特制藥，MDA(批號(hào)20210616)、SOD(批號(hào)20210607)、AST(批號(hào)20210122)、ALT(批號(hào)20210123)、AKP(批號(hào)20210115)均購(gòu)自南京建成生物工程研究所。

1.3 儀器臺(tái)式離心機(jī)(上海安亭科學(xué)儀器廠，TDL-50型)；旋渦混勻器(江蘇海門其林醫(yī)用儀器廠，TS-8型)；電子天平(上海精密科學(xué)儀器有限公司，F(xiàn)A210B)；分析天平(德國(guó)Sartorius賽多利斯，BP211D型)；全波長(zhǎng)掃描多功能讀數(shù)儀(賽默飛世爾科技有限公司，3001 型)；PCR熒光定量?jī)x(美國(guó)羅氏，LightCycler 480)；核酸蛋白檢測(cè)儀(美國(guó)QUAWELL公司，Q5000型)；凝膠成像系統(tǒng)(美國(guó)UVP公司，EC3600型)；梯度基因擴(kuò)增儀(北京大龍，TC1000-G)；超凈工作臺(tái)(型號(hào)：BCM1300，蘇潔醫(yī)療器械有限公司)，CO2恒溫培養(yǎng)箱(型號(hào)：3111型，賽默飛世爾科技有限公司)。

2 方法

2.1 動(dòng)物分組及處理將80只♂ C57BL/6隨機(jī)分為5組，每組16只，分別為正常組、模型組、L-SK高劑量組(8 mg·kg-1)、L-SK低劑量組(2 mg·kg-1)、陽(yáng)性藥物組(水飛薊賓60 mg·kg-1)，正常對(duì)照組、模型組小鼠每天同一時(shí)間灌胃生理鹽水0.2 mL/只，L-SK高劑量組、低劑量組、陽(yáng)性對(duì)照藥1 d1次，連續(xù)灌胃14 d。末次給藥2 h后，除正常對(duì)照組外，其余各組腹腔注射LPS(10 μg·kg-1)和D-GalN(700 mg·kg-1)，正常對(duì)照組腹腔注射等量生理鹽水，使小鼠形成急性肝損傷模型。禁食不禁水，觀察小鼠狀態(tài)，6 h后處死一半小鼠進(jìn)行采血，解剖取其肝臟、脾臟組織，另一半小鼠用于檢測(cè)生存率。

2.2 肝脾指數(shù)的測(cè)定每只實(shí)驗(yàn)小鼠處死前進(jìn)行稱重，取出肝臟和脾臟組織，用生理鹽水洗凈后濾紙擦干，分別稱重，記錄重量。肝脾指數(shù)按照以下公式進(jìn)行計(jì)算： 肝指數(shù)/%=肝臟體質(zhì)量/小鼠體質(zhì)量×100，脾指數(shù)/%=脾臟體質(zhì)量/小鼠體質(zhì)量×100%。

2.3 動(dòng)物相關(guān)指標(biāo)檢測(cè)造模6 h結(jié)束后將小鼠稱質(zhì)量，然后進(jìn)行眼眶取血，置冰上30 min，3 000 r·min-1離心10 min，分離血清，分裝血清置于4 ℃冰箱備用檢測(cè)。取小鼠肝臟組織0.1 g，用4 ℃冷生理鹽水洗凈，加10倍量冰冷生理鹽水，冰水浴下進(jìn)行勻漿，然后置于4 ℃冷凍離心機(jī)中，以3 000 r·min-1離心10 min，取上清液，存于4 ℃下保存待測(cè)。取分裝好的血清進(jìn)行AST、ALT以及AKP酶活性檢測(cè)，具體操作步驟按照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行；將肝組織勻漿進(jìn)行蛋白定量后，按照試劑盒說(shuō)明書(shū)檢測(cè)肝組織勻漿中的NO含量、丙二醛(MDA)含量和總超氧化物歧化酶(SOD)活性。

2.4 肝臟組織HE染色取小鼠肝臟組織，置4%多聚甲醛中固定,用石蠟包埋組織進(jìn)行切片，常規(guī)HE染色觀察組織病理學(xué)變化。

2.5 細(xì)胞處理將RAW264.7細(xì)胞分為正常對(duì)照組：在37 ℃、5% CO2培養(yǎng)條件下，用含有10%胎牛血清、1%青鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)細(xì)胞RAW 264.7細(xì)胞；脂多糖組：細(xì)胞培養(yǎng)24 h后，加入終濃度為1 mg·L-1LPS繼續(xù)培養(yǎng)0.5、6、24 h；L-SK組：細(xì)胞培養(yǎng)24 h后，先加入50、100、200 μmol·L-1的L-SK溶液預(yù)處理30 min，然后加入終濃度為1 mg·L-1LPS繼續(xù)培養(yǎng)0.5、6 、24 h。

2.6 細(xì)胞活性檢測(cè)取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的RAW264.7細(xì)胞，按照1×105接種于96孔培養(yǎng)板中孵育過(guò)夜，棄去培養(yǎng)液，除空白對(duì)照組外，其余孔加入含不同濃度L-SK的培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞24 h后棄去培養(yǎng)基，加入含10% MTT溶液的新鮮培養(yǎng)基于每孔200 μL，孵育4 h后棄去MTT試劑，每孔加入110 μL DMSO溶解液裂解細(xì)胞，于搖床上搖晃10 min后，在波長(zhǎng)490 nm處測(cè)量吸光度A(λ)490值，按下列公式計(jì)算細(xì)胞存活率。

存活率/%=(A藥物組值/A對(duì)照組值)×100%

2.7 NO實(shí)驗(yàn)細(xì)胞處理中加入終濃度為1 mg·L-1LPS培養(yǎng)24 h后，取100 μL細(xì)胞培養(yǎng)上清液與100 μL的Griess 試劑混合。5 min內(nèi)于550 nm波長(zhǎng)處使用酶標(biāo)儀測(cè)量每孔的吸光度(A)值，通過(guò)標(biāo)曲計(jì)算各組NO含量。

2.8 實(shí)時(shí)熒光定量-聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)檢測(cè)細(xì)胞處理中加入終濃度為1 mg·L-1LPS培養(yǎng)6 h后，按照TRIzol法提取細(xì)胞總RNA后，測(cè)定RNA濃度，按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒HIFIScript cDNA Synthesis Kit將RNA反轉(zhuǎn)為cDNA，按說(shuō)明書(shū)于熒光定量PCR儀上檢測(cè)各組的INOS、COX-2、IL-6、IL-1β、TNF-α以及IFN-β的mRNA表達(dá)，反應(yīng)條件為95 ℃，10 min；95 ℃，15 s；57 ℃，15 s；72 ℃，15 s,擴(kuò)增45個(gè)循環(huán)，最終72 ℃延長(zhǎng)10 min，該實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用的定量數(shù)據(jù)分析方法是2-ΔΔCT法，各組引物序列如下[12]：INOS上游：5′- CCCTTCCGAAGTTTCTGGCAGCAG-3′，下游：5′- GGCTGTCAGAGCCTCGTGGCTTTGG-3′，COX-2上游：5′-CACTACATCCTGACCCACTT-3′，下游：5′-ATGCTCCTGCTTGAGTATGT-3′GAPDH上游：5′-AGGAGAGTGTTTCCTCGTCC-3′，下游：5′-TGAGGTCAATGAAGGGGTCG-3′；IL-6上游：5′- CCGGAGAGGAGACTTCACAG-3′，下游：5′-TCCACGATTTCCCAGAGAAC-3′；IL-1β上游：5′-TGCAGAGTTCCCCAACTGGTACA-3′，下游：5′- GTGCTGCCTAATGTCCCCTTG-3′；TNF-α上游：5′-TCAGCCTCTTCTCATTCCTG-3′，下游：5′-TGAAGAGAACCTGGGAGTAG-3′；IFN-β上游：5′- CTGCGTTCCTGCTGTGCTTC-3′，下游：5′- CGCCCTGTAGGTGAGGTTGAT-3′。

2.9 Western blot檢測(cè)蛋白表達(dá)水平細(xì)胞處理中加入終濃度為1 mg·L-1LPS培養(yǎng)30 min后，進(jìn)行蛋白定量后加上樣緩沖液，沸水煮沸20 min，即可用于Western blot蛋白檢測(cè)，常規(guī)進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉后放入一抗中4 ℃過(guò)夜孵育，d 2用TBST洗PVDF膜3次后放入二抗孵育1 h后，TBST洗膜3次用凝膠成像系統(tǒng)UVP采集蛋白條帶，用ImageJ軟件進(jìn)行定量分析，計(jì)算各組目的條帶與內(nèi)參GAPDH的比值，或磷酸化目的蛋白與非磷酸化蛋白的比值來(lái)反映目的蛋白的相對(duì)表達(dá)水平。一抗根據(jù)1∶1 000(ERK1/2)、1∶1 000(p-ERK1/2)、1∶1 000(JNK)、1∶1 000(p-JNK)、1∶1 000(p38)、1∶1 000(p-p38)、1∶1 000(INOS)、1∶1 000(COX2)、1∶1 000(p65)、1∶1 000(p-p65)、1∶1 000(p-IKKα/β)、1∶1 000(IKKα)、1∶1 000(p-IKKβ)、1∶2 000(GAPDH)以及1∶5 000(二抗)的稀釋比例進(jìn)行孵育。

3 結(jié)果

3.1 L-SK緩解LPS/D-GalN所致的小鼠急性肝損傷注射完造模藥后觀察小鼠的狀態(tài)，結(jié)果表明，模型組的24 h生存率為0，L-SK給藥組明顯提高動(dòng)物生存率，其中陽(yáng)性藥組和L-SK高劑量組作用明顯(Fig 1A)。與正常組相比，模型組小鼠的肝臟、脾臟指數(shù)明顯增加(P<0.05或P<0.01)，說(shuō)明造模成功。與模型組相比，L-SK低、高劑量組和陽(yáng)性藥組的肝臟指數(shù)有所降低，但差異無(wú)顯著性(P>0.05)，而L-SK給藥組以及陽(yáng)性藥組均明顯降低脾臟系數(shù)(P<0.01)(Fig 1B和1C)。小鼠血清轉(zhuǎn)氨酶及AKP酶的異常升高，說(shuō)明肝臟實(shí)質(zhì)受到損傷，肝臟細(xì)胞受損，本研究中，模型組小鼠血清中的AST、ALT及AKP酶均明顯增加(P<0.01)，其中L-SK各劑量組能明顯降低AST、ALT及AKP的活性(P<0.05或P<0.01)，陽(yáng)性藥物組均能極明顯降低小鼠血清中的AST、ALT及AKP酶活性(P<0.01)(Fig 1D～F)。

Fig 1 Effect of L-SK on LPS/D-GalN-induced acute liver injury in

3.2 L-SK改善LPS/D-GalN所致急性肝損傷小鼠的肝功能研究發(fā)現(xiàn)NO含量可預(yù)測(cè)肝臟損傷程度，并且MDA含量升高和SOD酶活性降低均表明肝臟組織發(fā)生氧化損傷。本研究中LPS/D-GalN誘導(dǎo)的模型組小鼠肝臟組織上清中的NO和MDA含量均明顯增加(P<0.01)，SOD酶活性明顯降低(P<0.01)，與模型組相比，L-SK治療組均能明顯降低NO含量(P<0.01)和MDA含量(P<0.05)(Fig 2A和Fig 2B)，且呈一定的劑量依懶性，SOD酶的活性明顯升高(P<0.01)，陽(yáng)性藥物組均能明顯降低小鼠肝組織上清中NO含量和升高SOD酶的活性(P<0.01)(Fig 2A和Fig 2C)。此實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,L-SK通過(guò)影響氧化/抗氧化平衡從而對(duì)LPS/D-GalN所致急性肝損傷起到保護(hù)作用。

通過(guò)對(duì)小鼠肝臟組織進(jìn)行HE染色后發(fā)現(xiàn)，正常組小鼠肝臟表面光滑、質(zhì)地堅(jiān)韌、色澤紅潤(rùn)、鏡頭下觀察肝細(xì)胞大小均一，結(jié)構(gòu)正常、排列有序、且細(xì)胞核位于肝細(xì)胞中央，炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)較少，模型組小鼠肝臟組織充血嚴(yán)重，表面粗糙，顏色發(fā)暗，為黑紅色，鏡下觀察肝組織結(jié)構(gòu)異常，肝細(xì)胞排列紊亂，肝索異常，肝細(xì)胞明顯變性，胞質(zhì)內(nèi)充滿小氣泡且有明顯的紅染，炎性細(xì)胞浸潤(rùn)明顯。L-SK低、高劑量組相較于模型組，其肝組織有所改善，尤其是高劑量組，肝細(xì)胞排列比較均勻，肝細(xì)胞胞質(zhì)均勻且間隔變窄，炎性浸潤(rùn)明顯減輕，陽(yáng)性藥相對(duì)于模型組也具有明顯改善，其肝臟細(xì)胞的形態(tài)基本正常，炎性浸潤(rùn)程度明顯減輕，細(xì)胞間隙也較窄，有輕微的腫脹(Fig 2D)。

Fig 2 Effects of L-SK on oxidative indices and liver tissue injury in

3.3 L-SK對(duì)RAW264.7細(xì)胞活性和釋放NO的影響細(xì)胞存活率實(shí)驗(yàn)表明，細(xì)胞在0 μmol·L-1至200 μmol·L-1的范圍內(nèi)，各劑量組對(duì)Raw264.7巨噬細(xì)胞無(wú)細(xì)胞毒性，無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)(Fig 3A)，濃度計(jì)量范圍參考本課題組前期研究[11]。NO結(jié)果顯示，與模型組比較，L-SK在50 μmol·L-1、100 μmol·L-1以及200 μmol·L-1均能夠明顯降低NO水平(P<0.01)，且呈現(xiàn)一定的濃度依賴性(Fig 3B)。

Fig 3 Effect of L-SK on NO

3.4 L-SK對(duì)RAW264.7細(xì)胞炎癥基因mRNA表達(dá)水平影響本研究進(jìn)一步探究了L-SK在LPS刺激6 h后的炎癥相關(guān)基因的mRNA表達(dá)水平變化，在LPS刺激下，模型組的INOS、COX-2、IFN-β、IL-6、TNF-α及IL-1β的mRNA水平相較于空白對(duì)照組明顯升高(P<0.01)，與模型組比較，L-SK的高劑量組極明顯下調(diào)IFN-β和TNF-α的mRNA水平(P<0.01)，明顯下調(diào)INOS和COX-2的mRNA水平(P<0.05)，L-SK的中、高劑量組均能極明顯下調(diào)IL-6及IL-1β的mRNA水平(P<0.01)。這些結(jié)果表明，L-SK能夠通過(guò)抑制炎癥基因的表達(dá)發(fā)揮其抗炎作用(Fig 4)。

Fig 4 Effect of L-SK on expression of relevant

3.5 L-SK對(duì)RAW264.7細(xì)胞中的MAPK/NF-κB通路蛋白表達(dá)影響本實(shí)驗(yàn)探究了L-SK對(duì)RAW264.7細(xì)胞MAPK/NF-κB通路中的INOS、COX-2、p38、ERK1/2、JNK、p65和IKKα/β蛋白表達(dá)。Western blot結(jié)果顯示，與空白組比較，模型組中的INOS、COX-2的蛋白水平明顯升高(P<0.01)，與模型組比較，L-SK高劑量組能夠極明顯下調(diào)INOS蛋白水平(P<0.01)(Fig 5A)，中、高劑量組能夠明顯下調(diào)COX-2的蛋白表達(dá)(P<0.01)(Fig 5B)；在MAPK信號(hào)通路中，與空白組比較，模型組的p-p38、p-ERK1/2的蛋白表達(dá)水平均極明顯上調(diào)(P<0.01)，但L-SK各劑量組與模型組比較差異均無(wú)顯著性(P>0.05)并且L-SK給藥后p-JNK蛋白表達(dá)水平明顯升高(Fig 5C)；在NF-κB信號(hào)通路中，模型組的p-p65和p-IKKα/β的蛋白表達(dá)水平相較于空白組均極明顯上調(diào)(P<0.01)，與模型組比較，L-SK的高劑量組能明顯下調(diào)的p-IKKα/β蛋白表達(dá)(P<0.01)，L-SK中、高劑量組均明顯下調(diào)p-p65蛋白水平(P<0.01)(Fig 5D)。Western blot結(jié)果表明L-SK發(fā)揮抗炎作用是通過(guò)下調(diào)NF-κB通路中INOS、COX-2、p-p65和p-IKKα/β的蛋白表達(dá)，對(duì)于MAPK信號(hào)通路蛋白無(wú)明顯抑制作用。

Fig 5 Effect of L-SK on LPS-induced protein expression in RAW264.7 cells

4 討論

急性肝損傷(ALF)是致命的臨床綜合征之一，其特點(diǎn)是肝功能迅速惡化導(dǎo)致肝性腦病，全身炎癥反應(yīng)綜合征甚至多器官衰竭，從而對(duì)患者生命構(gòu)成嚴(yán)重威脅[1]。常見(jiàn)的ALF造模方法較多，其中LPS聯(lián)合D-氨基半乳糖(D-galactosamine，D-GalN)是一種經(jīng)典的ALF誘導(dǎo)方法[8]，D-GalN是一種強(qiáng)效的RNA合成抑制劑，可導(dǎo)致肝細(xì)胞出現(xiàn)不可逆的損傷以及巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)[13]。LPS是一種內(nèi)毒素，可以引起免疫刺激的級(jí)聯(lián)反應(yīng)，其中LPS誘導(dǎo)激活巨噬細(xì)胞產(chǎn)生炎癥反應(yīng)，是經(jīng)典的體外炎癥模型[6]，而D-GalN和LPS聯(lián)合使用時(shí)又能加強(qiáng)LPS的急性毒性。因此，本研究通過(guò)建立LPS刺激RAW264.7巨噬細(xì)胞的體外炎癥模型以及建立LPS/D-GalN誘導(dǎo)的小鼠體內(nèi)急性肝損傷模型，探討L-SK抗炎保肝作用及其作用機(jī)制。

體內(nèi)實(shí)驗(yàn)采用LPS/D-GalN誘導(dǎo)的小鼠急性肝損傷模型，本研究中我們發(fā)現(xiàn)L-SK能明顯提高小鼠存活率，降低模型小鼠血清中的的AST、ALT、AKP酶活性，該實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明L-SK具有一定的保肝作用。我們研究還發(fā)現(xiàn)小鼠組織中的NO含量明顯降低，NO可與過(guò)氧化物結(jié)合生成過(guò)氧亞硝酸鹽化合物，是氧化損傷的主要自由基之一，可預(yù)測(cè)肝臟損傷程度[14]；同時(shí)發(fā)現(xiàn)小鼠組織中的MDA的含量明顯降低，SOD酶活性明顯提升，MDA可以間接反映氧化損傷的嚴(yán)重程度，SOD可以阻斷脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)的發(fā)生，維持機(jī)體代謝平衡，當(dāng)機(jī)體發(fā)生氧化應(yīng)激時(shí)，MDA含量升高，SOD活性降低，自由基的積累將使細(xì)胞膜的脂質(zhì)發(fā)生過(guò)氧化作用進(jìn)一步加重而引起膜裂變, 從而導(dǎo)致細(xì)胞損傷甚至死亡[15]，該實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明L-SK可以通過(guò)改善氧化損傷起到保肝作用，同時(shí)給藥組可不同程度恢復(fù)肝功能異常，減輕肝臟炎癥。以上結(jié)果均表明，L-SK對(duì)ALF具有一定的治療作用，通過(guò)改善組織的炎癥反應(yīng)及氧化損傷從而延緩疾病的發(fā)展進(jìn)程。

炎癥被認(rèn)為是決定了ALF的發(fā)病進(jìn)程的關(guān)鍵因素，而炎癥反應(yīng)的特征是巨噬細(xì)胞的積累和激活[4]，因此巨噬細(xì)胞的激活與ALF有著密切聯(lián)系。LPS誘導(dǎo)活化巨噬細(xì)胞后導(dǎo)致誘導(dǎo)性一氧化氮合酶(iNOS)和環(huán)氧化酶(COX-2)表達(dá)增加，INOS誘導(dǎo)產(chǎn)生的NO又可以進(jìn)一步促進(jìn)細(xì)胞因子如IL-6、TNF-α和IL-1β的增加[16]，從而進(jìn)一步加劇炎癥反應(yīng)。體外模型中，L-SK給藥組能夠明顯抑制細(xì)胞NO含量以及炎癥因子mRNA水平，并且L-SK在基因和蛋白水平上均能抑制INOS和COX-2的表達(dá)，由此可知L-SK的抗炎作用與抑制炎癥因子表達(dá)和降低促炎癥酶活性有關(guān)。在LPS誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)中，絲裂原活化蛋白激酶(mitogen activated protein kinase，MAPK)和NF-κB(nuclear factor-κB)信號(hào)通路是兩條經(jīng)典的通路，其中NF-κB起到關(guān)鍵作用[17]，是炎癥反應(yīng)和抗炎的中心環(huán)節(jié)，MAPK參與調(diào)控NF-κB信號(hào)通路的激活，NF-κB通路的激活促使NF -κB p65與NF-κB p65 抑制劑(IκB)二聚體分離,并由胞質(zhì)向胞核轉(zhuǎn)移[7]，MAPK和NF-κB的磷酸化均能夠促使炎癥因子IL-6、TNF-α和IL-1β的釋放[18]，進(jìn)一步加重炎癥反應(yīng)。我們考察了L-SK對(duì)兩條信號(hào)通路的作用，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，模型組細(xì)胞的MAPK及NF-κB信號(hào)通路均被激活，磷酸化的ERK1/2、JNK、p38、p65和IKKα/β蛋白表達(dá)明顯上調(diào)，L-SK給藥后MAPK信號(hào)通路相關(guān)蛋白與模型無(wú)變化，然而L-SK給藥組明顯抑制了磷酸化的p65和IKKα/β蛋白表達(dá)，因此我們得出結(jié)論，L-SK發(fā)揮抗炎作用是通過(guò)抑制NF-κB信號(hào)通路中的p65和IKKα/β蛋白的表達(dá)，對(duì)于MAPK信號(hào)通路幾乎無(wú)作用(Fig 6)。

Fig 6 Anti-inflammatory mechanism diagram

綜上所述，本文研究結(jié)果證明，L-SK主要是通過(guò)抗炎作用進(jìn)行預(yù)防和保護(hù)由LPS/D-GalN誘導(dǎo)的小鼠急性肝損傷，其抗炎作用是抑制炎癥因子的表達(dá)以及相關(guān)蛋白表達(dá)，作用機(jī)制可能與降低COX-2、iNOS酶蛋白的表達(dá)，調(diào)控NF-κB信號(hào)通路相關(guān)，該研究為后續(xù)臨床開(kāi)發(fā)用藥提供理論依據(jù)。