G蛋白偶聯(lián)雌激素受體抑制劑增加他莫昔芬誘導(dǎo)T-47DTR耐藥細(xì)胞凋亡

張敏琴，宋雨萱，樊雙琴，任 爽，張 玥，陳 妍，沈祥春，劉同征，張 敏

(貴州醫(yī)科大學(xué) 1.基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生理學(xué)教研室、2.天然藥物資源優(yōu)效利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州 貴陽 550025；3.暨南大學(xué)腫瘤藥理研究所，廣東 廣州 510632)

乳腺癌是全球女性中最常見的惡性腫瘤[1]。約70%為雌激素受體(estrogen receptor，ER)陽性，抗雌激素的內(nèi)分泌治療是該類患者主要的治療手段[2]。作為最有效和最常用的抗雌激素藥物，他莫昔芬(Tamoxifen，TAM)已被證實(shí)可大大延長乳腺癌患者的生存期[3]。盡管大多數(shù)患者從這種治療中獲益，但臨床數(shù)據(jù)顯示，大約50%的患者對他莫昔芬產(chǎn)生耐藥性，最終導(dǎo)致復(fù)發(fā)和死亡[4]。

G蛋白偶聯(lián)雌激素受體(G-protein coupled estrogen receptor，GPER)，又稱GPR30，在結(jié)構(gòu)上不同于經(jīng)典的ERα和ERβ，是一種新型雌激素受體，介導(dǎo)多種雌激素反應(yīng)[5]，并在獲得性他莫昔芬耐藥中起重要作用。據(jù)有關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道，他莫昔芬對GPER具有激動(dòng)作用，體內(nèi)外研究數(shù)據(jù)表明，GPER的表達(dá)與他莫昔芬耐藥密切相關(guān)[6]，同時(shí)也是影響他莫昔芬治療過程的一個(gè)不利生存因素。G15是一種取代的二氫喹啉類似物，可抑制GPER，有望應(yīng)用于增加他莫昔芬耐藥細(xì)胞敏感性[7]。因此，本研究探討GPER抑制劑G15能否增加TAM對T-47DTR耐藥細(xì)胞誘導(dǎo)凋亡的作用，恢復(fù)耐藥細(xì)胞對他莫昔芬的敏感性，為抑制GPER增加耐藥細(xì)胞對治療藥物敏感性提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 藥品與試劑人乳腺癌他莫昔芬耐藥細(xì)胞株T47D Tam1(CRL-3436TM，T-47DTR)購自美國ATCC公司，人乳腺癌T-47D細(xì)胞株購于中國科學(xué)院昆明細(xì)胞庫。高糖DMEM培養(yǎng)基(Gibco公司)，胎牛血清(Gibco公司)。4-OHT(Cat#ab143638)購自Abcam公司，G15(Cat#14673)購自Sigma公司；BCA蛋白定量試劑盒(Cat#23227)購自賽默飛世爾科技(中國)有限公司；Annexin V-FITC/PI雙染細(xì)胞凋亡檢測試劑盒購自江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司；細(xì)胞膜蛋白與細(xì)胞質(zhì)蛋白抽提試劑盒(Cat#P0033)購自碧云天生物技術(shù)有限公司。MTT粉末(Cat#M8180)購自北京索萊寶公司。caspase-9/p35/p10單克隆抗體(Cat#66169-1-Ig)，caspase-3/p17/p19單克隆抗體(Cat#66470-2-Ig)，BAX 多克隆抗體(Cat#50599-2-Ig)，Bcl2多克隆抗體(Cat#26593-1-AP)抗體均購自proteintech公司；Na+,K+-ATPase α1(Y10)多克隆抗體(BS1436)，β-actin(4D3)單克隆抗體-HRP(Cat#BS6007M)，羊抗鼠 IgG(H+L)HRP(Cat#BS12478)，羊抗兔 IgG(H+L)HRP(Cat#BS13278)抗體均購自Bio-World公司；GPER多克隆抗體(Cat#PA5-28647)購自美國Invitrogen公司。

1.2 主要儀器3111二氧化碳培養(yǎng)箱(賽默飛世爾科技(中國)有限公司)；ChemiDoc XRS+凝膠成像系統(tǒng)(美國Bio-Rad公司)；ACEA NovoCyte 3008流式細(xì)胞儀(美國艾森公司)；Microfuge?20R冷凍離心機(jī)(美國Beckman Coulter公司)；ELX800酶標(biāo)儀(美國BioTek公司)。

1.3 方法

1.3.1細(xì)胞培養(yǎng) T47D Tam1(T-47DTR)細(xì)胞系按照ATCC的標(biāo)準(zhǔn)方案進(jìn)行培養(yǎng)，在培養(yǎng)基中補(bǔ)充1 μmol·L-14-OHT以維持他莫昔芬的耐藥性。其中T-47DTR使用含有10%胎牛血清(FBS)和10 mg·L-1胰島素的DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)。T47D細(xì)胞系在添加10% FBS的DMEM中培養(yǎng)。所有細(xì)胞均在5% CO2和37 ℃條件下培養(yǎng)。

1.3.2MTT法檢測細(xì)胞存活率 取對數(shù)生長期T-47D/TR耐藥細(xì)胞或其親本細(xì)胞T-47D,按照8×103個(gè)/孔接種于96空板內(nèi)，培養(yǎng)24 h后，給予不同濃度4-OHT(0.5、1、2.5、5、10 μmol·L-1)作用48 h，另設(shè)陰性對照(Control組)，每組5個(gè)復(fù)孔。然后將MTT溶液(5 g·L-1，20 μL)添加到每個(gè)孔中并再孵育4 h。然后除去培養(yǎng)基，加入DMSO(100 μL/孔)并充分混合。使用酶標(biāo)儀在570 nm處測量吸光度(OD)值。重復(fù)3次，將所得數(shù)據(jù)進(jìn)行計(jì)算，得出各濃度藥物下的抑制率(inhibition rate，IR)，IR/%=[(OD對照組-OD4-OHT)/OD對照組]×100%。

1.3.3Western blot檢測蛋白表達(dá) 取對數(shù)生長期T-47DTR耐藥細(xì)胞接種于6孔板內(nèi)，按照實(shí)驗(yàn)分組T-47DTR、T-47DTR+4-OHT(2 μmol·L-1)、T-47DTR+G15(5 μmol·L-1)和T-47DTR+4-OHT(2 μmol·L-1)+G15(5 μmol·L-1)給藥48 h后。使用含有PMSF(1 mmol·L-1)和蛋白酶抑制劑混合物(1 ∶100)的裂解緩沖液提取細(xì)胞總蛋白，離心并收集上清，采用BCA 蛋白定量試劑盒進(jìn)行蛋白定量。按照45 μɡ共20 μL分裝各組蛋白并進(jìn)行電泳，濕法轉(zhuǎn)膜，2%牛血清白蛋白封閉。封閉完成后，根據(jù)抗體說明書稀釋一抗，4 ℃孵育過夜，再加入相應(yīng)二抗室溫孵育90 min，采用Bio-Rad凝膠成像系統(tǒng)獲取圖像，并使用Image Lab分析軟件計(jì)算蛋白印跡結(jié)果的灰度值。

1.3.4細(xì)胞凋亡檢測 取對數(shù)生長期T-47DTR耐藥細(xì)胞接種于6孔板內(nèi)，按“1.3.3”項(xiàng)給藥48 h后，用不含EDTA胰酶消化收集細(xì)胞，PBS洗滌細(xì)胞兩次，2 000 r·min-1，5 min收集1×105細(xì)胞，進(jìn)行FITC/PI雙染，室溫避光反應(yīng)15 min后進(jìn)行流式細(xì)胞儀檢測。

1.3.5膜漿分離分析 根據(jù)試劑盒說明書方法，分離細(xì)胞膜蛋白和細(xì)胞質(zhì)蛋白，通過Western blot定量分析GPR30在細(xì)胞內(nèi)分布的變化。

1.3.6統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 所有結(jié)果均表示為至少3個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的平均值±標(biāo)準(zhǔn)差。使用t檢驗(yàn)分析兩組之間的差異，并使用單因素方差分析分析多組之間的差異。

2 結(jié)果

2.1 4-OHT對T-47D和T-47DTR細(xì)胞生長抑制的影響MTT結(jié)果顯示，不同濃度4-OHT(0.5、1、2.5、5、10 μmol·L-1)作用48 h后，與T-47D親本細(xì)胞相比，T-47DTR耐藥細(xì)胞對4-OHT的抵抗性明顯增強(qiáng)，其4-OHT對T-47D和T-47DTR細(xì)胞的IC50值分別為(2.69±0.16)μmol·L-1、(26.65±0.03)μmol·L-1，兩者比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Fig 1)。

Fig 1 Effect of 4-OHT on growth inhibition of *P<0.05，**P<0.01 vs T-47D/TR

2.2 G15對T-47DTR細(xì)胞中GPER蛋白表達(dá)的影響如Fig 2所示，與T-47D親本細(xì)胞相比，T-47DTR耐藥細(xì)胞中GPER蛋白表達(dá)明顯上調(diào)；在T-47DTR耐藥細(xì)胞中，給予4-OHT作用48 h后，與空白對照組比較，GPER在細(xì)胞膜內(nèi)易位增加，給予G15處理后能明顯降低4-OHT誘導(dǎo)的T-47DTR細(xì)胞中GPER蛋白表達(dá)上調(diào)(Fig 3)。

Fig 2 Expression of GPER protein in T-47D and

Fig 3 Effect of G15 on GPER protein expression of

2.3 G15誘導(dǎo)T-47DTR耐藥細(xì)胞凋亡與單用4-OHT組或?qū)φ战M相比，4-OHT聯(lián)用G15組總凋亡率增加，表明G15可增強(qiáng)4-OHT對T-47DTR細(xì)胞的抑制作用(Fig 4)，結(jié)果提示，G15能夠增加T-47DTR耐藥細(xì)胞對他莫昔芬的敏感性。

Fig 4 Apoptosis in T-47DTR cells induced by

2.4 G15對T-47DTR耐藥細(xì)胞中凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響Western blot結(jié)果顯示，與單用4-OHT組或?qū)φ战M相比，4-OHT聯(lián)用G15處理48 h后，T-47DTR耐藥細(xì)胞中Bax表達(dá)顯著增加，Bcl-2表達(dá)顯著降低；cleaved-caspase 3和cleaved-caspase 9表達(dá)增加(Fig 5)。表明G15影響凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)從而恢復(fù)T-47DTR耐藥細(xì)胞對他莫昔芬的敏感性。

Fig 5 Effect of G15 on expression of apoptosis-related

3 討論

他莫昔芬是一種選擇性雌激素受體(ER)調(diào)節(jié)劑，是世界范圍內(nèi)ER陽性轉(zhuǎn)移性乳腺癌女性最常見的內(nèi)分泌治療藥物，或作為疾病早期的輔助治療藥物，雖然極大地提高了患者生存率，但并非所有患者都能從其使用中獲益[8]。在治療過程中，原發(fā)性或獲得性耐藥經(jīng)常出現(xiàn)，并成為乳腺癌內(nèi)分泌治療的主要障礙[9]，因此，迫切需要探索新的治療策略，通過克服乳腺癌細(xì)胞的耐藥性來提高TAM的療效。

GPER是一種新的膜結(jié)合雌激素受體，約在50%的乳腺癌患者中表達(dá)，并被認(rèn)為可以在乳腺癌細(xì)胞[10]中介導(dǎo)雌激素的快速效應(yīng)。在長期使用他莫昔芬治療的過程中可導(dǎo)致耐藥的發(fā)生以及GPER的激活[11-13]，這與細(xì)胞表面GPER的表達(dá)增加有關(guān)，導(dǎo)致與生長因子受體的串?dāng)_增加，并導(dǎo)致細(xì)胞增殖增加[14-16]。同樣，與我們上述觀察到的結(jié)果一致，GPER在TAM耐藥細(xì)胞中表達(dá)明顯高于其親本細(xì)胞，表明TAM耐藥細(xì)胞中GPER被激活，以及GPER的膜易位在4-OHT處理后在TAM耐藥細(xì)胞中增加。提示，GPER受體在TAM治療的過程中起著關(guān)鍵作用。然而，目前，并未有針對GPER的藥物上市。因此，本研究探討GPER特異性抑制劑G15誘導(dǎo)T-47DTR耐藥細(xì)胞凋亡，恢復(fù)耐藥細(xì)胞對他莫昔芬的敏感性。首先，我們檢測了T-47DTR耐藥細(xì)胞中4-OHT聯(lián)用G15對T-47DTR耐藥細(xì)胞中GPER蛋白表達(dá)的影響。結(jié)果顯示，給予G15可顯著減少GPER的表達(dá)，與單用4-OHT或?qū)φ战M相比4-OHT聯(lián)用G15顯著減少GPER表達(dá)。

已有研究表明，在TAM耐藥的乳腺癌細(xì)胞中，GPER通過激活MAPK/ERK-TRIM2信號減少Bim(僅BH3促凋亡蛋白家族成員BCL2-L11)，從而減少TAM誘導(dǎo)的凋亡，促進(jìn)ER陽性乳腺癌細(xì)胞中的他莫昔芬耐藥性[17]。與上述研究結(jié)果相似，本研究結(jié)果顯示，聯(lián)用G15能夠增加4-OHT誘導(dǎo)T-47DTR耐藥細(xì)胞發(fā)生凋亡，上調(diào)凋亡相關(guān)蛋白Bax、cleaved-caspase-3、cleaved-caspase-9的活性，下調(diào)抗凋亡蛋白Bcl-2，表明G15可增強(qiáng)T-47DTR對他莫昔芬的敏感性。

綜上所述，本研究表明G15通過抑制GPER的表達(dá)影響T-47DTR耐藥細(xì)胞凋亡，恢復(fù)其對他莫昔芬的敏感性，GPER受體抑制劑G15有望作為耐藥增敏劑應(yīng)用于臨床腫瘤耐藥患者的治療。